Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

אנו מודים לאלברט פן ולארגו סיאיקמן על מתנות של דגי הטרנסגניים. אנו מודים לקואיצ'י קסטאמי במכון הלאומי לגנטיקה, פרויקט BioResource הלאומי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן עבור מתנת הHGn39bהטרנסגניים. כמו כן, אנו מודים לפטימה מרצ ולקתלין גאייבסקי לסיוע במיקרוסקופיה וטרייסי ת'ייולט לתצלומים.
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי למדעי הסביבה של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר P30ES023512 וחוזה מספר HHSN273201500010C). SU נתמך על ידי מחבר מהתוכנית Keck בביולוגיה סרטן התוכנית (מפרץ החוף קונסורציומים CPRIT גרנט RP140113) ועל ידי רועי הקרן הקרנות. J-Å G נתמכת על ידי הקרן רוברט א. וולש (E-0004).

עבודת החיות המוצגת כאן אושרה על ידי הטיפול המוסדי בעלי חיים וועדות השימוש (IACUCs) של אוניברסיטת יוסטון ואוניברסיטת אינדיאנה.
1. גידול דגים
הערה: עבודה עם דגמי בעלי חוליות דורשת פרוטוקול מאושר IACUC. היא צריכה להתבצע על פי ההנחיות הלאומיות והבינלאומיות הרלוונטיות.</p...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

שיטת הרכבה עבור מיקרוסקופיה מורחבת של מיקרוסקופית הזמן של עוברי הדגים השלם מתוארת כאן. הצעד הקריטי ביותר עבור שיטת ההרכבה היא לזהות את הריכוז האופטימלי של agarose כי יאפשר צמיחה בלתי מוגבלת של העובר, ובאותו זמן לשמור על העוברים בעמדה קבועה לחלוטין עבור הדמיה קונפוקלית וקד. מכיוון שהריכוז האו...

הדג הגדול הינו אורגניזם מודל לביולוגיה התפתחותית, והמיקרוסקופיה היא השיטה העיקרית להמחיש את ההתפתחות העובלנית. יתרונות השימוש בעוברי דגים למחקרים התפתחותיים כוללים גודל קטן, בהירות אופטית, פיתוח מהיר ופוריות גבוהה של הדג המבוגר. הדור של הקווים הטרנסגניים המבטא זריחה ברקמות או תאים מסוימים אפשרו הדמיה ישירה של פיתוח רקמות בדרכים לא אפשרי עם בעלי חיים גדולים יותר בעלי חוליות. בשילוב עם מיקרוסקופ לשגות בזמן, פרטים ודינמיקה של פיתוח רקמות ניתן ללמוד בקלות.
קושי בהתפתחות הדמיה של דגי ההדמיה הוא שהעוברים גדלים באופן משמעותי באורך; העובר מרחיב את אורכו ארבע פעמים בתוך 3 הימים הראשונים של החיים1. גם, הגוף של העובר המוקדם הוא רך, ובקלות הופך להיות מעוות אם הצמיחה היא מוגבלת. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ ממוקד, העובר חייב להיות ללא תנועה. כדי לשמור על העוברים בעמדה קבועה עבור הדמיה זמן מיקוד התמונה, הם מורדם באופן קבוע ורכוב ב 0.3-1% נמוך להמיס. לדבר זה יש יתרון של התרת צמיחה מסוימת במהלך ההדמיה לתקופה מסויימת, תוך הגבלת תנועות העובר. חלקים של העובר יכול להיות ביעילות להיות בתמונה כך. עם זאת, בעת שימוש בשיטה זו עבור הדמיה של העובר כולו עבור פרקי זמן מורחבים, עיוותים הם נצפו בשל הצמיחה המוגבלת הנגרמת על ידי הצמח. לכן, נדרשות שיטות הרכבה אחרות. קאופמן ועמיתיו תיארו הרכבה חלופית של עוברי דג דג זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור, כגון מיקרוסקופ התאורה סלקטיבי המטוס (spim), על ידי הרכבה העוברים ב-fluorinated אתילן פרופילן (fep) צינורות המכילים ריכוזים נמוכים של agarose או מתילתאית2. טכניקה זו מייצרת ויזואליזציה מעולה של embryogenesis לאורך זמן. Schmid ואח ' לתאר הרכבה של עד שישה עוברים ב agarose בצינורות פבואר עבור מיקרוסקופ גיליון אור3 מתן ויזואליזציה של מספר עוברים במפגש אחד הדמיה. בתבניות נעשה שימוש כדי ליצור מערכי העובר להרכבה יעילה של מספר גדול יותר של עוברים4. מסקינקיות ואח ' בנויים בתבניות פלסטיק מודפס 3d שניתן להשתמש בהם כדי להפוך סיליקון מטיל כי העוברים בשלבים שונים ניתן להציב, המאפשר להרכבה בעמדה קבועה עבור הדמיה, כולל הדמיה קונפוקלית וקד5. הדפסה תלת-ממדית השתמשה גם כדי ליצור תבניות עבור מיקום עקבי של עוברי צבפיש 96-ובכן פורמט6. תבניות מסוימות מותאמות אישית עבור שלבים מסוימים ולא ניתן להתיר צמיחה בלתי מוגבלת לפרקי זמן ארוכים, בעוד שתבניות אחרות גמישות יותר. לאחרונה, Weijts ואח ' פרסמה את העיצוב והייצור של מאכל ארבע היטב עבור הדמיה חיה של עוברי דגיםשבעה 7. בתבשיל זה, הזנב והגזע של עוברי דגים מורדם ממוקמים באופן ידני תחת גג סיליקון ברור מחובר ממש מעל זכוכית כיסוי כדי ליצור כיס. העובר הוא תוקן לאחר מכן במיקום זה על ידי תוספת של 0.4% agarose. הרכבה זו מאפשרת הדמיה של החלק האחורי של כ 2 מ"מ (העורק והזנב) של העובר, וכמו עד 12 עוברים ניתן לרכוב לכל טוב, השיטה מאפשרת הדמיה של דגימות מרובות. באופן דומה, הירסינגר ו סטבנטון הציגו לאחרונה שיטה שבה ראש הדג מותקן בתוך agarose, בעוד הזנב יכול לצמוח בחופשיות, ושיטה זו גם מקלה ביעילות הדמיה של הגזע והזנב של העובר8.
מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועות העוברים תוך התרת צמיחה בלתי מוגבלת. היתרונות של שיטה זו הרכבה הם כי היא בעלות נמוכה, שיטה מהירה וקל לעלות על העוברים של שלבים שונים עבור הדמיה באמצעות כל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מאפשרת הדמיה ארוכת טווח של הגוף כולו (ראש, גזע וזנב) במהלך התפתחות העובר. כדי להציג את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה מתמונה בדגים טרנסגניים. שני עוברים בכל הפעלה, בשני אורכי גל תלת-ממד הוצגו על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות עבור 55 שעות רצופות כדי להפוך סרטים של פיתוח רקמות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

הדינמיקה של פיתוח יכול להיות בעקבות מיקרוסקופ זמן הקפיצה של התהליך של העוברים חיים הטרנסגניים לחיות ביטוי של זריחה ברקמות או בתאים ספציפיים. קושי עם הדמיה של התפתחות העובר כולו הוא כי עוברי דגים לצמוח באופן משמעותי באורך. כאשר נטען באופן קבוע ב-0.3-1% ממיסים נמוך, מטילה הצמח מגבלות גידול, המובילות לעיוותים בגוף העובר הרך. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ לצניחה בזמן מיקוד, העובר חייב להיות ללא תנועה. מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועתיות העוברים ומאפשרת צמיחה בלתי מוגבלת. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים. כדי להדגים את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה התמונה בדגים טרנסגניים במשך 55 שעות רצופות. שיטה זו הרכבה ניתן להשתמש בקלות, בעלות נמוכה הדמיה של עוברי דג זברה שלמים באמצעות מיקרוסקופים הפוכה ללא דרישות של תבניות או ציוד מיוחד.

פיתוח שיטת ההרכבה המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה לפתח טכניקת הרכבה בעלות נמוכה להדמיה בזמן הדמיה של התפתחות הדגים במשך פרקי זמן ארוכים. שיטת ההרכבה שכבתית פותחה כדי לאפשר צמיחה מלאה של גוף העובר שברירי דג זברה, תוך הגבלת תנועותיו. אם ריכוז השכבה 1 גבוה מדי, העוברים יהפכו להיות מ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

פיתחנו שיטת הרכבה להדמיית זמן לשגות המאפשרת צמיחה בלתי מוגבלת של עוברי זברה שבירים ו בו בזמן שומרת אותם במצב קבוע לחלוטין. שיטת הרכבה זו מהירה, קלה וזולה והיא פועלת להדמיית מעבדה בכל מיקרוסקופ הפוך. פיתחנו שיטה זו להדמיה של עוברי זברה חיים, אך ניתן לשנותה להדמיה של מודלים קטנים אחרים של בעלי חיים ימיים.התחל על ידי הרבייה של דג הזברה הבוגר. אחר הצהריים, מניחים את הדגים במיכלי רבייה ביחס של זכר לנקבה של אחד לשניים. לאחר מכן הכינו תמיסת מלאי של 1% התכה נמוכה בתקשורת העוברים והמיסו אותה על ידי חימום במיקרוגל.אליקאוט הפתרון agarose לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. הפוך פתרון מלאי של 4% tricaine במים מזוקקים ולאחסן את אגרוז טריקאין בארבע מעלות צלזיוס. Tricaine הוא רעיל ויש לשקול ולהוכן במכסה המנוע אדים.לאחר ההזדווגות, קוצרים את עוברי הזברה ב- E3 בצלחת פטרי ודגירה אותם ב 26.5 מעלות צלזיוס במשך כ 28 שעות לפני ההרכבה. הרדמה העוברים עם 0.02% tricaine ו dechorionate אותם תחת מיקרוסקופ על ידי אחיזה בעדינות משיכת chorion לגזרים כדי לשחרר את העובר. רגע לפני ההרכבה, מחממים את תווי ההתעוררות ל-65 מעלות ואז נותנים לו להתקרר לכ-30 מעלות צלזיוס כדי שהעובר לא ייפגע מהחום ומוסיפים טריקאין לתסכול ההתעוררות.השתמש 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות עם מספר אפס coverglass התחתון. מניחים בעדינות עובר dechorionated עם אחד הצדדים הצדדיים שלה לכיוון החלק התחתון של המנה עם פיפטה זכוכית או micropipette, ולאחר מכן להסיר בזהירות כל E3 הנותרים עם micropipette. הוסף את הפתרון הראשון agarose ל באר קטנה שנוצרה על ידי coverglass מחובר לתחתית המנה כדי לכסות את העובר לוודא כי אגרוז מכסה את באר קטנה אבל לא עולה על גדותיו.מכסים את באר קטנה עם coverglass כדי ליצור חלל צר מלא אגרוז עם העובר בין שני coverglasses. מניחים שכבה של 1% פתרון agarose על גבי coverglass בכל רחבי החלק התחתון של המנה אשר ישמור את coverglass במקום כפי שהוא מתמצח. לאחר מכן מלאו את החלק הנותר של המנה ב-E3 המכיל 0.02% טריקאין כדי לשמור על התייבשות המערכת.כדי לזהות את ריכוז ההתעוררות האופטימלי לשכבה 1, הר את העוברים בריכוזים הולכים וגדלים של אגרוז ובצע הדמיה של זמן לשגות כדי לזהות את הריכוז הממזער את עיוות העובר ואת תנועתיותו, ולאחר מכן לבדוק טווח עדין יותר של ריכוזים המבוססים על התוצאות. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא לזהות את הריכוז האופטימלי של אגרוז לשכבה 1. בדוק ריכוזי ננו שונים של אגרוז כגון 0.030%0.032%etc.כדי למצוא את הריכוז האופטימלי. כדי לבצע הדמיה בזמן לשגות של העוברים, להשתמש בשלב מיקרוסקופ עם אינקובטור מוגדר 28.5 מעלות צלזיוס ותדמית עד 55 שעות. כדי לדמיין בו זמנית מספר עוברים, השתמש במתאם שלב המכיל מספר מנות וסובב את הכלים בזה אחר זה כך שהעוברים ממוקמים אופקית.בחר מטרת הגדלה נמוכה, ולאחר מכן לאתר את העוברים באמצעות העין ולבסוף ליישר אותם אופקית על ידי סיבוב הכלים. רשום את מיקום העוברים בתוכנה וצור שם קובץ עבור שמירה אוטומטית של הנתונים. הגדר את גודל חור הסיכה, מהירות הסריקה, גודל התמונה ושינוי גודל התצוגה.לאחר מכן בחרו הגדלה גבוהה יותר ללכידת תמונות וערוצי הפלואורסצנטיות להדמיה. עבור כל ערוץ, כוונן את עוצמת הלייזר ואת המתח הגבוה של הגלאי הקפד לאסוף את הטווח הדינמי הטוב ביותר האפשרי תוך הימנעות מרוויה והגבלת הלבנת תמונות. לאחר מכן, כדי לצלם את העובר כולו עם מטרה 10X, להגדיר את הגדרות לכידת תמונה גדולה בתוכנה כדי תמונה מספר שדות תצוגה ולתפור אותם יחד התאמת המיקום של העובר כדי לוודא שהוא מתאים בתוך שטח תמונה גדול זה.קבע את ההגדרות ללכידת ערימות Z בהתאם להוראות כתב היד. על מנת לשמור על מיקוד של עוברים מרובים במהלך הדמיה לטווח ארוך לשגות זמן, להשתמש במוקד אוטומטי ולהתאים את רמות ההיסט הפרט עבור כל עובר להתמקד במישור הייחוס. לאחר מכן הגדר פרמטרים לשגות זמן בתוכנת המיקרוסקופ לתמונה למשך 55 שעות במרווחי זמן של שעה.בכל מחזור, לכוד שתי ערכות נתונים עובריות ברצף ושמור נתונים באופן אוטומטי. השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי לעבד את התמונות. אם יותר עובר אחד תדמית, צור קבצים עצמאיים עבור כל עובר על-ידי פיצול ערכות הנתונים בהתבסס על מיקום ההדמיה.המירו את ערכות הנתונים של זמן תלת-מימד לערכות נתונים דו-מימדיות באמצעות הקרנות בעוצמה מרבית או כלי דומה. לבסוף, צור קבצי סרטים על-ידי שמירה כ- AVI ובחירה באפשרות ללא דחיסה עם מרווחי זמן של 200 אלפיות שניה למהירות הפעלה של חמש מסגרות לשנייה. שיטת הרכבה שכבתית זו מאפשרת דימוי עוברי זברה-דג תוך מתן אפשרות לגדול אך בו זמנית מגבילה את תנועתם.אם ריכוז ההתעוררות גבוה מדי, העוברים הופכים מעוותים. אבל אם זה נמוך מדי, הם יעברו מחוץ לשדה המבט במהלך מיקרוסקופיה לשגות בזמן. ריכוז האגרוז האופטימלי נמצא בין 0.028 ל-0.034%דגי זברה מהונדסים חיים המבטאים RFP בעובר כולו ו-GFP בתאי האנדותל של כלי הדם נתפרו במשך 55 שעות שבמהלכן נבט כלי הדם הבין-דוריים, כלי דם תת מעיים וראש התפתחו, ועיבוי מקלעת ורידים caudal עם הארכת תא המטען התרחשה.עוברים המבטעים GFP ותאי עצב מוטוריים דימוי לדמיין התפתחות נוירון מוטורי. אקסונים נוירון מוטורי לנבוט מן הצינור העצבי הגחוני מעל somites לכיוון הצד הגחוני של העובר. ההתפתחות ההדדית של הנבט הגבי של אקסונים של נוירונים מוטוריים ביחס למיקום של כלי דם בין-סגמנטליים תדמית באמצעות הגדלה גבוהה יותר.זה אפשר לדמיין את הפרטים הקטנים של נובט אקסון הגחוני, כמו גם אקסון הגב נובט מן הצינור העצבי. ככל שמספרי somite גדלו, somites גם להרחיב באורך ורוחב. תהליך זה תדמית באמצעות עוברים מהופנטים המבטעים GFP בשרירים.בגלל הריכוז האופטימלי של אגרוז הוא צר מאוד, הוא רגיש מאוד וריאציות קטנות במדידות בעת הכנת פתרון המניות של אגרוז וזה צריך להיות מוגדר מחדש עבור כל קבוצה חדשה של פתרון agarose. חשוב להגדיר בזהירות את פרמטרי ההדמיה כולל גודל התמונה ורזולוציה, מהירות הסריקה, זום, מתח גבוה גלאי, וכוח לייזר כדי להבטיח עקביות בין ניסויים וגם כדי להפחית את האפשרות של רעילות תמונה הלבנת תמונה במהלך זמן ארוך לשגות הדמיה. באמצעות שיטת הרכבה זו לעוברים מהונדסים של דגי זברה ואחריה הדמיה ממושכת של האורגניזם כולו, אנו יכולים לדמיין כיצד רקמות שונות מתפתחות יחד.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...