Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Ringraziamo Albert Pan e Arndt Sieakmann per i doni di pesce transgenico. Ringraziamo Koichi Kawakami presso l'Istituto Nazionale di Genetica, il National BioResource Project del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone per il dono del pesce zebra transgenico HGn39b. Ringraziamo anche Fatima Merchant e Kathleen Gajewski per l'assistenza sulla microscopia confocale, e Tracey Theriault per le fotografie.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Environmental Health Sciences dei National Institutes of Health (numero di sovvenzione P30ES023512 e numero di contratto HHSN273201500010C). SU è stata sostenuta da una borsa di studio del programma Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) e da Hugh Roy e Lillie Endowment Fund. La Fondazione Robert A. Welch (E-0004) è stata sostenuta da J-O G.

Il lavoro sugli animali qui presentato è stato approvato dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Houston e dell'Università dell'Indiana.
1. Allevamento di pesce
NOTA: il lavoro con i modelli vertebrati richiede un protocollo approvato IACUC. Dovrebbe essere condotta secondo le pertinenti linee guida nazionali e internazionali.
<ol><li>Mantenere il pesce zebra adulto come descritto nella letteratura pubblicata in p...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Un metodo di montaggio per la microscopia confocale time-lapse estesa di embrioni interi di pesci zebra è descritto qui. Il passo più critico per il metodo di montaggio è quello di identificare la concentrazione ottimale di agarose che permetterà la crescita senza restrizioni dell'embrione di pesce zebra e allo stesso tempo mantenere gli embrioni in una posizione completamente fissa per l'imaging confocale. Poiché la concentrazione ottimale di agarose è molto stretta, questo valore è molto sensibile agli errori di...

Il pesce zebra è stato a lungo un organismo modello per la biologia dello sviluppo, e la microscopia è il metodo principale per visualizzare lo sviluppo embrionale. I vantaggi dell'utilizzo di embrioni di pesce zebra per gli studi sullo sviluppo includono piccole dimensioni, chiarezza ottica, rapido sviluppo e alta fecondità del pesce adulto. La generazione di linee di pesci zebra transgenici che esprimono fluorescenza in alcuni tessuti o cellule ha permesso una visualizzazione diretta dello sviluppo dei tessuti in modi non possibili con animali vertebrati più grandi. In combinazione con la microscopia time-lapse, i dettagli e le dinamiche dello sviluppo dei tessuti possono essere facilmente studiati.
Una difficoltà con lo sviluppo di pesci zebra imaging è che gli embrioni crescono notevolmente in lunghezza; l'embrione estende la sua lunghezza quattro volte entro i primi 3 giorni di vita1. Inoltre, il corpo dell'embrione precoce è morbido e diventa facilmente distorto se la crescita è limitata. Tuttavia, per eseguire la microscopia confocale, l'embrione deve essere immobilizzato. Per mantenere gli embrioni in posizione fissa per l'imaging confocale time-lapse, sono regolarmente anestesizzati e montati in agarose a bassa fusione dello 0,3-1%. Questo ha il vantaggio di consentire una certa crescita durante l'imaging per un certo periodo di tempo, limitando al contempo i movimenti dell'embrione. Parti dell'embrione possono essere efficacemente immagini come questa. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo per l'imaging dell'intero embrione per periodi di tempo prolungati, si osservano distorsioni a causa della crescita limitata causata dall'agarose. Pertanto, sono necessari altri metodi di montaggio. Kaufmann e colleghi hanno descritto un montaggio alternativo di embrioni di pesce zebra per la microscopia a fogli opaci, come la microscopia selettiva dell'illuminazione piana (SPIM), montando gli embrioni in tubi fluorurati di propilene di etilene (FEP) contenenti basse concentrazioni di agarose o metilcellulosa2. Questa tecnica produce una superba visualizzazione dell'embriogenesi nel tempo. Schmid e t al. descrivono il montaggio di fino a sei embrioni in agarose in tubi FEB per la microscopia light-sheet3 che fornisce la visualizzazione di diversi embrioni in una sessione di imaging. Le muffe sono state utilizzate per creare array di embrioni per un montaggio efficiente di un numero maggiore di embrioni4. Masselkink et al. hanno costruito stampi in plastica stampati in 3D che possono essere utilizzati per fare calchi di silicio in cui possono essere collocati embrioni di pesce zebra in diverse fasi, consentendo il montaggio in una posizione costante per l'imaging, compresa l'imaging confocale5. La stampa 3D è stata utilizzata anche per realizzare stampi per un posizionamento coerente degli embrioni di pesce zebra in formato 96-well6. Alcuni stampi sono personalizzati per alcune fasi e non possono consentire una crescita illimitata per lunghi periodi di tempo, mentre altri stampi sono più flessibili. Recentemente, Weijts ealtri ha pubblicato la progettazione e la fabbricazione di un piatto di quattro pozzi per l'imaging dal vivo di embrioni di pesce zebra7. In questo piatto, la coda e il tronco degli embrioni di pesce anestesizzati sono posizionati manualmente sotto un tetto in silicone trasparente attaccato appena sopra un vetro di copertura per formare una tasca. L'embrione viene quindi fissato in questa posizione con l'aggiunta dello 0,4% di agarose. Questo montaggio consente l'imaging della parte posteriore lunga circa 2 mm (tronco e coda) dell'embrione, e poiché fino a 12 embrioni possono essere montati per pozzo, il metodo consente l'imaging di più campioni. Allo stesso modo, Hirsinger e Steventon hanno recentemente presentato un metodo in cui la testa del pesce è montata in agarose, mentre la coda può crescere liberamente, e questo metodo facilita anche in modo efficiente l'imaging della regione del tronco e della coda dell'embrione8.
Questo articolo descrive un metodo di montaggio stratificato per gli embrioni di pesce zebra che limitano i movimenti degli embrioni, consentendo al contempo una crescita illimitata. I vantaggi di questo metodo di montaggio sono che si tratta di un metodo a basso costo, veloce e facile per montare embrioni di varie fasi per l'imaging utilizzando qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio consente l'imaging a lungo termine di tutto il corpo (testa, tronco e coda) durante lo sviluppo dell'embrione. Per mostrare l'usabilità di questo metodo, lo sviluppo vascolare, neuronale e muscolare dell'intero embrione è stato immaginato nei pesci transgenici. Due embrioni per sessione, a due lunghezze d'onda in 3D sono stati immagini per microscopia time-lapse per 55 ore consecutive per rendere i filmati dello sviluppo dei tessuti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

Le dinamiche di sviluppo possono essere seguite da microscopia confocale time-lapse di embrioni di pesce zebra transgenici vivi che esprimono fluorescenza in tessuti o cellule specifici. Una difficoltà con l'imaging dello sviluppo di embrioni interi è che gli embrioni di pesce zebra crescono notevolmente in lunghezza. Quando montato come regolarmente fatto in 0.3-1% agarose a bassa fusione, l'agarose impone restrizione di crescita, portando a distorsioni nel corpo embrionale morbido. Tuttavia, per eseguire la microscopia confocale time-lapse, l'embrione deve essere immobilizzato. Questo articolo descrive un metodo di montaggio stratificato per gli embrioni di pesce zebra che limitano la motilità degli embrioni, consentendo al contempo la crescita illimitata. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni. Per dimostrare l'usabilità di questo metodo, lo sviluppo vascolare, neuronale e muscolare dell'intero embrione è stato immagine nei pesci transgenici per 55 ore consecutive. Questo metodo di montaggio può essere utilizzato per l'imaging facile e a basso costo di embrioni di pesci zebra interi utilizzando microscopi invertiti senza requisiti di stampi o attrezzature speciali.

Sviluppo del metodo di montaggio L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di sviluppare una tecnica di montaggio a basso costo per l'imaging time-lapse dello sviluppo del pesce zebra per lunghi periodi di tempo. Il metodo di montaggio a strati è stato sviluppato per consentire la piena crescita del fragile corpo embrionale di pesce zebra, limitando al contempo i suoi movimenti. Se la concentrazione di agarose dello strato 1 è troppo alta, gli embrioni diventeranno distorti e curvi (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Abbiamo sviluppato un metodo di montaggio per l'imaging time-lapse che consente una crescita illimitata di embrioni zebrafish fragili e allo stesso tempo li mantiene in una posizione completamente fissa. Questo metodo di montaggio è veloce, facile ed economico e funziona per l'imaging di laboratorio su qualsiasi microscopio invertito. Abbiamo sviluppato questo metodo per l'imaging di embrioni di zebrafish vivi, ma potrebbe essere modificato per l'imaging di altri piccoli modelli di animali acquatici.Inizia allevando il pesce zebra adulto. Nel pomeriggio, posizionare il pesce in vasche da riproduzione con un rapporto maschio-femmina di uno a due. Quindi preparare una soluzione stock di agarosio a bassa fusione dell'1% nei mezzi embrionale e scioglierla riscaldandola in un forno a microonde.Aliquota la soluzione di agarosio in tubi da 1,5 millilitri. Fare una soluzione stock di 4%tricaina in acqua distillata e conservare l'agarosio e la tricaina a quattro gradi Celsius. La tricaina è tossica e deve essere pesata e preparata in una cappa aspirante.Dopo l'accoppiamento, raccogliere gli embrioni di zebrafish in E3 in una piastra di Petri e incubarli a 26,5 gradi Celsius per circa 28 ore prima del montaggio. Anestetizza gli embrioni con lo 0,02% di tricaina e dechorionateli al microscopio afferrandoli delicatamente e separando il corione per rilasciare l'embrione. Poco prima del montaggio, riscaldare la soluzione di agarosio a 65 gradi Celsius e quindi lasciarla raffreddare a circa 30 gradi Celsius in modo che l'embrione non sia danneggiato dal calore e aggiungere tricaina alla soluzione di agarosio.Utilizzare piatti inferiori in vetro da 35 millimetri con un fondo in coverglass numero zero. Posizionare delicatamente un embrione dechorionato con uno dei suoi lati laterali verso il fondo del piatto con una pipetta di vetro o una micropipetta, quindi rimuovere con cura l'E3 rimanente con una micropipetta. Aggiungere la prima soluzione di agarosio al piccolo pozzo creato dal coverglass attaccato al fondo del piatto per coprire l'embrione assicurandosi che l'agarosio copra il piccolo pozzo ma non lo trabocca.Coprire il piccolo pozzo con un coverglass per creare uno spazio stretto pieno di agarosio con l'embrione tra i due coverglass. Posizionare uno strato di soluzione di agarosio all'1% sopra il coverglass su tutto il fondo del piatto che manterrà il vetro di copertura in posizione man mano che si solidifica. Quindi riempire la porzione rimanente del piatto con E3 contenente 0,02%tricaina per mantenere il sistema idratato.Per identificare la concentrazione ottimale di agarosio per lo strato uno, montare gli embrioni in concentrazioni crescenti di agarosio ed eseguire l'imaging time-lapse per identificare la concentrazione che riduce al minimo la distorsione e la motilità dell'embrione, quindi testare una gamma più fine di concentrazioni in base ai risultati. Il passaggio più critico di questo protocollo è identificare la concentrazione ottimale di agarosio per lo strato uno. Testa diverse nano concentrazioni di agarosio come 0,030%0,032%ecc.per trovare la concentrazione ottimale. Per eseguire l'imaging time-lapse degli embrioni, utilizzare uno stadio di microscopio con un incubatore impostato su 28,5 gradi Celsius e un'immagine per un massimo di 55 ore. Per immagini contemporaneamente più embrioni, utilizzare un adattatore da palcoscenico che contiene più piatti e ruotare i piatti uno per uno in modo che gli embrioni siano posizionati orizzontalmente.Selezionare un obiettivo a basso ingrandimento, quindi individuare gli embrioni utilizzando l'oculare e infine allinearli orizzontalmente ruotando i piatti. Registrare la posizione degli embrioni nel software e creare un nome di file per il salvataggio automatico dei dati. Impostare le dimensioni del foro stenopeica, la velocità di scansione, le dimensioni dell'immagine e lo zoom.Quindi selezionare un ingrandimento più elevato per acquisire immagini e i canali di fluorescenza da immaginire. Per ogni canale, regolare la potenza del laser e l'alta tensione del rilevatore assicurandosi di raccogliere la migliore gamma dinamica possibile evitando la saturazione e limitando lo sbiancamento delle foto. Successivamente, per immagini l'intero embrione con un obiettivo 10X, imposta le grandi impostazioni di acquisizione dell'immagine nel software per immagini diversi campi visivo e cucirli insieme regolando la posizione dell'embrione per assicurarti che si adatti a questa grande area dell'immagine.Configurare le impostazioni per l'acquisizione delle pile Z in base alle indicazioni del manoscritto. Al fine di mantenere la messa a fuoco di più embrioni durante l'imaging time-lapse a lungo termine, utilizzare una messa a fuoco automatizzata e regolare i singoli livelli di offset per ogni embrione per mettere a fuoco sul piano di riferimento. Quindi impostare i parametri time-lapse nel software del microscopio per l'immagine per una durata di 55 ore a intervalli di un'ora.Ad ogni ciclo, acquisire due set di dati sugli embrioni in sequenza e salvare automaticamente i dati. Utilizzare il software al microscopio per elaborare le immagini. Se è stato immaginato più di un embrione, creare file indipendenti per ogni embrione dividendo i set di dati in base alla posizione dell'imaging.Convertire i set di dati di tempo 3D in set di dati di tempo 2D utilizzando proiezioni di intensità massima o uno strumento simile. Infine, crea file filmato salvando come AVI e selezionando l'opzione nessuna compressione con intervalli di 200 millisecondi per una velocità di riproduzione di cinque fotogrammi al secondo. Questo metodo di montaggio stratificato consente di immagine degli embrioni di zebrafish consentendo loro di crescere ma allo stesso tempo limitandone il movimento.Se la concentrazione di agarosio è troppo alta, gli embrioni vengono distorti. Ma se è troppo basso, si sposteranno fuori dal campo visivo durante la microscopia time-lapse. La concentrazione ottimale di agarosio è stata riscontrata tra lo 0,028 e lo 0,034%Il pesce zebra transgenico vivo che esprime la RFP nell'intero embrione e la GFP nelle cellule endoteliali della vascucolatura sono state immagini per 55 ore durante le quali si è verificato il vaso intersegementale germogliato, si è sviluppata la vascucolatura subintestinale e della testa e si è verificata la condensazione del plesso caudale della vena con estensione del tronco.Gli embrioni che esprimono GFP e motoneuroni sono stati immagini per visualizzare lo sviluppo dei motoneuroni. Gli assoni dei motoneuroni germogliano dal tubo neurale ventrale sopra i somiti verso il lato ventrale dell'embrione. Il co-sviluppo della germogliazione dorsale degli assoni dei motoneuroni in relazione alla posizione dei vasi intersegmentali è stato immaginato usando un ingrandimento più elevato.Ciò ha permesso di visualizzare i dettagli più fini della germogliazione dell'assone ventrale e dell'assone dorsale che germoglia dal tubo neurale. Con l'aumento del numero di somiti, anche i somiti si estendono in lunghezza e larghezza. Questo processo è stato immaginato utilizzando embrioni transgenici che esprimono GFP nei muscoli.Poiché la concentrazione ottimale di agarosio è molto stretta, è molto sensibile alle piccole variazioni nelle misurazioni durante la preparazione della soluzione stock di agarosio e deve essere ridefinita per ogni nuovo lotto di soluzione di agarosio. È importante impostare attentamente i parametri di imaging, tra cui dimensioni e risoluzione dell'immagine, velocità di scansione, zoom, alta tensione del rivelatore e potenza laser per garantire la coerenza tra gli esperimenti e anche per ridurre la possibilità di tossicità fotografica e sbiancamento delle foto durante l'imaging time-lapse a lungo termine. Utilizzando questo metodo di montaggio per embrioni transgenici di zebrafish seguito da un'imaging prolungata time-lapse dell'intero organismo, possiamo visualizzare come i diversi tessuti si sviluppano insieme.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...