Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

우리는 알버트 팬과 아른트 시에크만에게 형질전환 생선 선물을 주셔서 감사합니다. 일본 문화체육관광부의 국립생물자원사업인 국립유전학원의 가와카미 고이치(Koichi Kawakami)에게 형질전환 제브라피쉬 HGn39b의선물에 감사드립니다. 우리는 또한 공초점 현미경 검사법에 대한 도움을 파티마 상인과 캐슬린 Gajewski, 사진에 대한 트레이시 테리아울트에 감사드립니다.
이 작품은 국립 보건원의 국립 환경 보건 과학 연구소의 보조금에 의해 지원되었다 (보조금 번호 P30ES023512 및 계약 번호 HHSN2732015000010C). SU는 Keck 전산 암 생물학 프로그램 (걸프 코스트 컨소시엄 CPRIT 교부금 RP140113)과 휴 로이와 릴리 인다우먼트 기금의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. J-Å G는 로버트 A. 웰치 재단 (E-0004)에 의해 지원되었다.

여기에 제시 된 동물 작품은 휴스턴 대학과 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었습니다.
1. 생선 축산
참고: 척추동물 모델로 작업하려면 IACUC 승인 프로토콜이 필요합니다. 관련 국내 및 국제 지침에 따라 수행해야 합니다.
<ol><li>이전에 출판된 문헌9에설명된 바와 같이 성체 얼룩말어를 유지한다.</li>
...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. 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N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

전체 제브라피시 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 대한 장착 방법이 여기에 설명되어 있다. 장착 방법에 대한 가장 중요한 단계는 무제한 제브라피시 배아 성장을 허용하는 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 동시에 공초점 이미징을 위해 배아를 완전히 고정 된 위치에 유지하는 것입니다. 아가로즈의 최적 농도가 매우 좁기 때문에, 이 값은 용액을 제조하는 동안 아가로오스의 ?...

제브라피쉬는 오랫동안 발달 생물학의 모델 유기체였으며, 현미경 검사법은 배아 발달을 시각화하는 주요 방법입니다. 발달 연구를 위해 zebrafish 배아를 사용하는 장점은 작은 크기, 광학 선명도, 빠른 개발 및 성인 어류의 높은 배변성을 포함합니다. 특정 조직 또는 세포에서 형광을 발현하는 형질전환 제브라피시 라인의 생성은 더 큰 척추동물로는 불가능한 방법으로 조직 발달을 직접 시각화할 수 있게 하였다. 시간 경과 현미경 검사법과 함께, 조직 발달의 세부 사항 및 역학을 쉽게 연구 할 수 있습니다.
화상 진찰 zebrafish 발달을 가진 어려움은 배아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다; 태아는 수명1의첫번째 3 일 안에 그것의 길이를 4 시간 연장합니다. 또한, 초기 배아의 몸은 부드럽고 성장이 제한되면 쉽게 왜곡됩니다. 그러나 공초점 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 공초점 시간 경과 화상 진찰을 위한 고정된 위치에 배아를 지키기 위하여는, 그(것)들은 정규로 마취되고 0.3-1% 저용융 아가로즈에 거치됩니다. 이것은 태아의 운동을 제한하는 동안 특정 기간 동안 화상 진찰 도중 약간의 성장을 허용하는 이점이 있습니다. 배아의 부분은 이같이 능면화될 수 있습니다. 그러나, 장기간 동안 전체 배아의 화상 진찰을 위해 이 방법을 사용할 때, agarose에 기인한 제한된 성장 때문에 왜곡이 관찰됩니다. 따라서 다른 장착 방법이 필요합니다. Kaufmann 및 동료는 가로오스 또는 메틸셀룰로오스 2의 낮은 농도를 포함하는 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브에 배아를 장착함으로써 선택적 평면 조명 현미경 검사법 (SPIM)과 같은 가벼운시트 현미경 검사법에 대한 제브라피시 배아의 대체 장착을 설명했다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 배아 발생의 뛰어난 시각화를 생성합니다. Schmid 등은 1개의 화상 진찰 세션에서 몇몇 태아의 가시화를 제공하는 빛 시트 현미경 검사법3를 위한 FEB 관에 있는 아가로제에 있는 최대 6개의 배아의 설치를 기술합니다. 금형은 배아의 큰 숫자의 효율적인 장착을위한 배아 배열을 만드는 데 사용되었습니다4. Masselkink 등은 다양한 단계에서 제브라피시 배아를 배치할 수 있는 실리콘 주조를 만드는 데 사용할 수 있는 3D 프린팅 플라스틱 금형을 구성하여 공초점이미징을포함한 이미징을 위한 일정한 위치에 장착할 수 있습니다 5. 3D 프린팅은 또한 96웰 포맷6에서제브라피시 배아의 일관된 포지셔닝을 위한 금형을 만드는 데 사용되었습니다. 일부 금형은 특정 단계에 맞게 사용자 정의되며 장기간 무제한 성장을 허용하지 않을 수 있지만 다른 금형은 더 유연합니다. 최근, Weijts 등은 제브라피시 배아의 라이브 이미징을 위한 4웰 접시의 설계 및제작을7. 이 요리에서는 마취 된 물고기 배아의 꼬리와 줄기가 커버 유리 바로 위에 부착 된 투명한 실리콘 지붕 아래에 수동으로 배치되어 주머니를 형성합니다. 배아는 0.4% 아가로스를 첨가하여 이 위치에 고정된다. 이 장착은 배아의 약 2 mm 긴 후방 부분 (트렁크 및 꼬리)의 이미징을 허용하고, 최대 12 개의 배아가 잘 당 장착 될 수 있으므로, 방법은 여러 샘플의 이미징을 허용합니다. 마찬가지로, Hirsinger와 Steventon은 최근 꼬리가 자유롭게 자랄 수 있는 동안 물고기의 머리가 아가로오스에 장착되는 방법을 제시했으며,이 방법은 또한 배아8의트렁크 및 꼬리 부위의 이미징을 효율적으로 용이하게합니다.
이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 움직임을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 이 장착 방법의 장점은 모든 반전 된 현미경을 사용하여 이미징을위한 다양한 단계의 배아를 장착하는 저비용, 빠르고 쉬운 방법입니다. 장착은 배아 발달 도중 전신 (머리, 트렁크 및 꼬리)의 장기 적인 화상 진찰을 허용합니다. 이 방법의 유용성을 보여주기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 형질전환 어류에서 이미지화되었다. 세션당 2개의 배아, 3D의 2개의 파장에서 55시간 연속시간 경과 현미경검사법에 의해 이미지화되어 조직 발달의 영상을 렌더링하였습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

발달의 역학은 특정 조직 또는 세포에 형광을 발현하는 살아있는 형질전환 제브라피시 배아의 공초점 시간 경과 현미경 검사법에 의해 뒤따를 수 있습니다. 화상 진찰 전체 배아 발달을 가진 어려움은 zebrafish 태아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다. 0.3-1% 낮은 용융 아가로스에서 정기적으로 장착할 때, 아가로세는 성장 제한을 가하여 부드러운 배아 체체의 왜곡을 초래합니다. 그러나 공초점 시간 경과 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 운동성을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 55시간 연속으로 형질전환 어류에서 영상화되었다. 이 장착 방법은 금형이나 특수 장비의 요구 사항없이 반전 된 현미경을 사용하여 전체 얼룩말 배아의 쉽고 저렴한 이미징에 사용할 수 있습니다.

마운팅 방법의 개발 이 작업의 주요 목적은 장기간 제브라피시 개발의 시간 경과 이미징을 위한 저비용 장착 기술을 개발하는 것이었습니다. 층상 장착 방법은 깨지기 쉬운 얼룩말 배아 몸체의 완전한 성장을 허용하면서 움직임을 제한하기 위해 개발되었습니다. 층 1의 아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡되고 구부러지게됩니다(그림 2). 0.1%와 0.5%로 자?...

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A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

우리는 깨지기 쉬운 제브라피시 배아의 무제한 성장을 허용하는 동시에 완전히 고정 된 위치에 그들을 유지하는 시간 경과 이미징을위한 장착 방법을 개발했습니다. 이 마운팅 방법은 빠르고 쉽고 저렴하며 반전 된 현미경의 실험실 이미징에 적합합니다. 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 화상 진찰을 위한 이 방법을 개발했습니다, 그러나 그밖 작은 수생 동물 모형의 화상 진찰을 위해 수정될 수 있었습니다.성인 얼룩말 물고기를 사육하여 시작합니다. 오후에는 물고기를 사육 탱크에 넣고 1대 2의 남성 대 여성 비율로 사육합니다. 그런 다음 배아 매체에 1% 낮은 용융 아가로즈의 스톡 용액을 준비하고 전자 레인지에 가열하여 용해하십시오.아가로즈 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 증류수에 4%트리카인의 스톡 솔루션을 만들고 아가로즈와 트리카인을 섭씨 4도에 보관하십시오. 트리카인은 독성이 있으며 연기 후드에 무게를 두고 준비해야합니다.짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 제브라피쉬 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 섭씨 26.5도에서 배양하십시오. 0.02%의 트리카인으로 배아를 마취시키고, 조리온을 부드럽게 잡아당겨 배아를 방출함으로써 현미경으로 배아를 비코로 비우게 한다. 장착 직전에 아가로즈 용액을 섭씨 65도로 가열한 다음 약 30°C까지 식히면 배아가 열에 의해 손상되지 않도록 하고 아가로즈 용액에 트리카인을 추가하십시오.숫자 제로 커버 글래스 바닥35 밀리미터 유리 바닥 접시를 사용합니다. 유리 파이펫이나 마이크로피펫으로 접시 의 바닥쪽으로 측면 중 하나를 가진 비반향 배아를 부드럽게 놓고 마이크로 피펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거합니다. 아가로즈가 작은 우물을 커버하지만 오버플로하지 않도록 배아를 커버하기 위해 접시의 바닥에 부착 된 커버 글래스에 의해 생성 된 작은 우물에 첫 번째 아가로즈 용액을 추가합니다.커버글래스로 작은 우물을 덮어 두 개의 커버글래스 사이에 배아가 있는 좁은 아가로즈로 채워진 공간을 만듭니다. 커버글래스 의 상단에 1%아가로즈 용액층을 배치하여 커버글래스를 제자리에 고정시합니다. 그런 다음 0.02%의 트리카인을 함유한 E3로 접시의 나머지 부분을 채우고 시스템을 촉촉하게 유지합니다.1층에 대한 최적의 아가로즈 농도를 식별하기 위해 아가로즈 농도증가에 배아를 장착하고 시간 경과 이미징을 수행하여 배아 왜곡과 운동성을 최소화하는 농도를 확인한 다음 결과에 따라 더 미세한 농도 범위를 테스트합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 레이어 1에 대한 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 것입니다. 0.030%0.032% 등 다양한 나노 농도를 테스트한다.최적의 농도를 찾을 수 있습니다. 배아의 시간 경과 이미징을 수행하려면 최대 55시간 동안 섭씨 28.5도로 설정된 인큐베이터와 이미지를 사용하여 현미경 단계를 사용하십시오. 여러 배아를 동시에 이미지화하려면 여러 개의 접시를 담고 있는 스테이지 어댑터를 사용하여 배아가 수평으로 배치되도록 접시를 하나씩 회전시합니다.낮은 배율 목표를 선택한 다음 접안렌즈를 사용하여 배아를 찾아 마지막으로 접시를 회전하여 수평으로 정렬합니다. 소프트웨어에서 배아의 위치를 기록하고 데이터를 자동 저장하기 위한 파일 이름을 만듭니다. 핀홀 크기를 설정하고 속도, 이미지 크기 및 확대/축소를 검사합니다.그런 다음 이미지 캡처및 이미지형 채널을 캡처하기 위해 더 높은 배율을 선택합니다. 각 채널에 대해 레이저 전력과 검출기 고전압을 조정하여 포화를 피하고 사진 표백을 제한하면서 최상의 동적 범위를 수집합니다. 다음으로, 전체 배아를 10X 목표로 이미지화하기 위해 소프트웨어의 큰 이미지 캡처 설정을 설정하여 여러 시야 필드를 이미지화하고 배아의 위치를 조정하여 이 큰 이미지 영역에 맞는지 확인합니다.원고 방향에 따라 Z 스택을 캡처하기 위한 설정을 구성합니다. 장기 경과 이미징 동안 여러 배아의 초점을 유지하기 위해 자동화 된 초점을 사용하고 참조 평면에 초점을 각 배아에 대한 개별 오프셋 수준을 조정하십시오. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 시간 경과 매개 변수를 1시간 간격으로 55시간 동안 이미지화하도록 설정합니다.각 주기마다 두 개의 배아 데이터 집합을 순차적으로 캡처하고 데이터를 자동으로 저장합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 하나 이상의 배아가 이미지된 경우 이미징의 위치를 기반으로 데이터 집합을 분할하여 각 배아에 대해 독립적인 파일을 만듭니다.최대 강도 투영 또는 유사한 도구를 사용하여 3D 시간 데이터 집합을 2D 시간 데이터 집합으로 변환합니다. 마지막으로 AVI로 저장하고 초당 5프레임의 재생 속도를 위해 200밀리초 간격으로 압축 옵션을 선택하여 동영상 파일을 만듭니다. 이 계층장착 방법을 사용하면 제브라피시 배아를 이미지화하는 동시에 성장을 허용하지만 움직임을 제한하는 동일한 방식으로 이미지를 만들 수 있습니다.아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡됩니다. 그러나 너무 낮으면 시간 경과 현미경 검사중에 시야밖으로 이동합니다. 최적 아가로즈 농도는 혈관의 내피 세포에서 전체 배아및 GFP에서 RFP를 발현하는 0.028과 0.034%의 살아있는 형질제 제브라피쉬 사이인 것으로 나타났으며, 그 동안 55시간 동안 혈관간 혈관이 발아되고, 수피장 및 머리 혈관질이 개발되고, 골짜기 와 골병 이 형성되었다.GFP와 운동 뉴런을 발현하는 배아는 운동 신경 발달을 시각화하기 위해 이미지화되었습니다. 운동 신경 축축은 배아의 복부 측을 향해 소니트 를 통해 복부 신경관에서 새싹. 세그먼트 간 혈관의 위치와 관련하여 모터 뉴런 축종의 등삼 발아의 공동 개발은 더 높은 배율을 사용하여 이미지화되었다.이를 통해 신경관에서 발아되는 등쪽 축축뿐만 아니라 복부 축축발의 미세한 디테일을 시각화할 수 있게 되었습니다. 소미트 숫자가 증가함에 따라 솜릿도 길이와 너비로 확장됩니다. 이 과정은 근육에서 GFP를 표현하는 형질 전환 배아를 사용하여 이미지화되었다.아가로즈의 최적 농도는 매우 좁기 때문에 아가로즈의 재고 용액을 준비할 때 측정의 작은 변화에 매우 민감하며 아가로즈 솔루션의 각 새로운 배치에 대해 재정의되어야 합니다. 이미지 크기와 해상도, 스캔 속도, 줌, 검출기 고전압 및 레이저 전력을 포함한 이미징 매개 변수를 신중하게 설정하여 실험 간의 일관성을 보장하고 장기간 경과 하는 동안 사진 독성 및 사진 표백 가능성을 줄이는 것이 중요합니다. 전 유기체의 연장된 시간 경과 화상 진찰에 선행된 형질 전환 제브라피시 배아를 위한 이 마운팅 방법을 사용하여, 우리는 다른 조직이 어떻게 함께 발전하는지 구상할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

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연구

발생학

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

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해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

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An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...