Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Vi takker Albert pan og Arndt Sieakmann for gaver av transgene fisk. Vi takker Koichi Kawakami ved National Institute of genetikk, National BioResource Project fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan for gave de transgene sebrafisk HGn39b. Vi takker også Fatima Merchant og Kathleen Gajewski for assistanse på konfokalmikroskopi mikroskopi, og Tracey Theriault for fotografier.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Environmental Health Sciences i National Institutes of Health (Grant nummer P30ES023512 og kontraktnummer HHSN273201500010C). SU ble støttet av et fellesskap fra Keck beregningsorientert Cancer Biology program (Gulf Coast konsortier CPRIT Grant RP140113) og av Hugh Roy og Lillie legat fondet. J-å G ble støttet av Robert A. Welch Foundation (E-0004).

Dyret arbeidet som presenteres her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUCs) ved University of Houston og Indiana University.
1. fiskeoppdrett
Merk: arbeid med virveldyr modeller krever en IACUC godkjent protokoll. Det bør gjennomføres i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer.
<ol><li>Vedlikehold voksen sebrafisk som beskrevet i tidligere publisert litteratur9.</li>
	<li>På ettermidda...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Her beskrives en monteringsmetode for utvidet tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi av hele sebrafisk embryo. Den mest kritiske skritt for montering metoden er å identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose som vil tillate for ubegrenset sebrafisk embryo vekst, og samtidig holde embryo i en helt fast posisjon for konfokalmikroskopi Imaging. Fordi den optimale konsentrasjonen av agarose er veldig smal, er denne verdien svært følsom for feil i måling av vekten av agarose og volumet av E3 under utarbeidelse ...

Sebrafisk har lenge vært en modell organisme for utviklingsmessige biologi, og mikroskopi er den viktigste metoden for å visualisere embryoutvikling. Fordelene ved å bruke sebrafisk embryo for utviklingsstudier inkluderer liten størrelse, optisk klarhet, rask utvikling, og høy fekunditet av den voksne fisken. Generering av transgene sebrafisk linjer som uttrykker fluorescens i visse vev eller celler har tillatt for en direkte visualisering av vev utvikling på måter som ikke er mulig med større virveldyr dyr. I kombinasjon med tidsforløp mikroskopi, detaljer og dynamikk av vev utvikling kan lett studert.
Et problem med Imaging sebrafisk utvikling er at embryo vokser betydelig i lengde; embryo utvider sin lengde fire ganger i løpet av de første 3 dagene av livet1. Dessuten er kroppen av de tidlige embryo myk, og lett blir forvrengt hvis veksten er begrenset. Likevel, for å utføre konfokalmikroskopi mikroskopi, må fosteret være immobilisert. For å holde embryo i en fast posisjon for konfokalmikroskopi time-lapse Imaging, de er regelmessig anesthetized og montert i 0,3-1% lav-smelte agarose. Dette har fordelen av å la for noen vekst under Imaging for en viss tid, mens begrense bevegelsene til fosteret. Deler av fosteret kan effektivt bli avbildet som dette. Men når du bruker denne metoden for Imaging av hele embryo for lengre tidsperioder, er skjevheter observert på grunn av begrenset vekst forårsaket av agarose. Dermed er andre monteringsmetoder nødvendig. Kaufmann og kolleger har beskrevet en alternativ montering av sebrafisk embryo for lys ark mikroskopi, for eksempel selektiv fly belysning mikroskopi (SPIM), ved å montere embryo i fluoriserte etylen propylenglykol (FEP) rør som inneholder lave konsentrasjoner av agarose eller methylcellulose2. Denne teknikken gir en suveren visualisering av embryogenesis over tid. Schmid et al. beskriver montering av opptil seks embryo i agarose i FEBRUAR-rør for mikroskopi3 som gir visualisering av flere embryo i en bilde økt. Muggsopp har blitt brukt til å lage embryo arrays for effektiv montering av større antall embryo4. Masselkink et al. har bygget 3D trykt plast muggsopp som kan brukes til å lage silisium kaster som sebrafisk embryo på ulike stadier kan plasseres i, slik at montering i en konstant posisjon for Imaging, inkludert konfokalmikroskopi Imaging5. 3D-utskrift har også blitt brukt til å lage former for konsistent posisjonering av sebrafisk embryo i 96-brønn format6. Noen former er tilpasset for visse stadier og kan ikke tillate Ubegrenset vekst for lang tidsperioder, mens andre formene er mer fleksible. Nylig, Weijts et al. publisert design og fabrikasjon av en fire-brønn parabolen for Live Imaging av sebrafisk embryo7. I denne parabolen, er halen og stammen av anesthetized fisk embryo plassert manuelt under en klar silikon tak festet like over et deksel glass for å danne en lomme. Fosteret blir deretter fast i denne posisjonen ved tilsetning av 0,4% agarose. Denne monteringen gjør det mulig for Imaging av ca 2 mm lang bakre del (trunk og hale) av fosteret, og som opp til 12 embryo kan monteres per brønn, gir metoden for Imaging av flere prøver. På samme måte, Hirsinger og Steventon nylig presentert en metode der leder av fisken er montert i agarose, mens halen kan fritt vokse, og denne metoden også effektivt forenkler Imaging av stammen og halen regionen av embryo8.
Denne artikkelen beskriver en lagdelt montering metode for sebrafisk embryo som begrenser bevegelsene til embryo samtidig gir for Ubegrenset vekst. Fordelene med denne monteringsmetoden er at det er en rimelig, rask og enkel metode for å montere embryo av ulike stadier for bildebehandling ved hjelp av noen invertert mikroskop. Monteringen tillater lang tids avbildning av hele kroppen (hode, stamme og hale) under utviklingen av embryo. For å vise frem brukbarheten av denne metoden, ble hele embryo vaskulær, neuronal og muskelutvikling avbildet i transgene fisk. To embryo per økt, på to bølgelengder i 3D ble avbildet av time-lapse mikroskopi for 55 sammenhengende timer for å gjengi filmer av vev utvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

Dynamikken i utviklingen kan etterfølges av konfokalmikroskopi time-lapse mikroskopi av levende transgene sebrafisk embryo uttrykker fluorescens i bestemte vev eller celler. Et problem med Imaging hele embryoutvikling er at sebrafisk embryo vokse betydelig i lengde. Når montert som regelmessig gjort i 0,3-1% lav smelte agarose, pålegger agarose vekst restriksjon, som fører til skjevheter i den myke embryo kroppen. Likevel, for å utføre konfokalmikroskopi time-lapse mikroskopi, må fosteret være immobilisert. Denne artikkelen beskriver en lagdelt montering metode for sebrafisk embryo som begrenser motilitet av embryo samtidig gir for Ubegrenset vekst. Monteringen utføres i lag av agarose i ulike konsentrasjoner. For å demonstrere brukbarheten av denne metoden, ble hele embryo vaskulær, neuronal og muskelutvikling avbildet i transgene fisk for 55 sammenhengende timer. Denne monteringsmetoden kan brukes for enkel, rimelig Imaging av hele sebrafisk embryo bruker invertert mikroskop uten krav til mugg eller spesialutstyr.

Utvikling av monteringsmetoden Hovedformålet med dette arbeidet var å utvikle en rimelig monteringsteknikk for tidsforløp avbildning av sebrafisk utvikling i lengre perioder. Den lagdelte monteringsmetoden ble utviklet for å muliggjøre full vekst av den skjøre sebrafisk embryo kroppen, samtidig som den begrenser dens bevegelser. Hvis agarose konsentrasjon av lag 1 er for høy, vil embryo bli forvrengt og buet (figur 2). Embryo dyrket på 0,1% og 0,5% agarose har for...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Denne artikkelen beskriver en metode for å montere skjøre sebrafisk embryo for utvidet tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne rimelige metoden er enkel å utføre ved hjelp av vanlige glass-bunn mikroskopi retter for bildebehandling på noen invertert mikroskop. Monteringen utføres i lag av agarose i ulike konsentrasjoner.

En lagdelt montering metode for utvidet tidsforløp Konfokalmikroskopi mikroskopi av hele sebrafisk embryo

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Vi har utviklet en monteringsmetode for tidsforløp som muliggjør ubegrenset vekst av skjøre sebrafiskembryoer og samtidig holder dem i en helt fast posisjon. Denne monteringsmetoden er rask, enkel og billig, og den fungerer for laboratorieavbildning på ethvert omvendt mikroskop. Vi utviklet denne metoden for avbildning av levende sebrafisk embryoer, men det kan endres for avbildning av andre små akvatiske dyremodeller.Start med å avle den voksne sebrafisken. På ettermiddagen plasserer du fisken i avlstanker i et mannlig-til-kvinne-forhold på en-til-to. Deretter forbereder en lagerløsning på 1% lav smelte oppsto i embryomedier og oppløs den ved å varme den opp i en mikrobølgeovn.Aliquot agarose løsningen i 1,5 milliliter rør. Lag en lagerløsning på 4% trikain i destillert vann og lagre agarose og trikain ved fire grader Celsius. Trikain er giftig og må veies og tilberedes i en røykhette.Etter parring, høst sebrafisk embryoer i E3 i en petriskål og inkubere dem på 26,5 grader Celsius i ca 28 timer før montering. Bedøve embryoene med 0,02% trikain og dekoionere dem under et mikroskop ved å forsiktig gripe og trekke chorion fra hverandre for å frigjøre embryoet. Like før montering, varme agaroseløsningen til 65 grader Celsius og la den avkjøles til ca 30 grader Celsius slik at embryoet ikke blir skadet av varmen og tilsett trikain til agaroseløsningen.Bruk 35 millimeter glass bunnretter med en tall null coverglass bunn. Legg forsiktig et deforionert embryo med en av sidesidene mot bunnen av fatet med en glasspipette eller en mikropipette, og fjern deretter forsiktig eventuell gjenværende E3 med en mikropipette. Tilsett den første agaroseløsningen til den lille godt skapt av dekkglasset festet til bunnen av parabolen for å dekke embryoet, og pass på at agarose dekker den lille brønnen, men ikke overløp den.Dekk den lille brønnen med et dekkglass for å skape et smalt agarosefylt rom med embryoet mellom de to dekkglassene. Plasser et lag med 1% agarose løsning på toppen av dekkglasset over hele bunnen av parabolen som vil holde dekkglasset på plass som det stivner. Fyll deretter den gjenværende delen av fatet med E3 som inneholder 0,02% trikain for å holde systemet hydrert.For å identifisere den optimale agarosekonsentrasjonen for lag en, monter embryoene i økende konsentrasjoner av agarose og utfør tidsforløp for å identifisere konsentrasjonen som minimerer embryoforvrengning og motilitet, og test deretter et finere konsentrasjonsområde basert på resultatene. Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er å identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose for lag en. Test forskjellige nanokonsentrasjoner av agarose som 0,030% 0,032%etc.for å finne den optimale konsentrasjonen. For å utføre tidsforløp av embryoene, bruk et mikroskopstadium med en inkubator satt til 28,5 grader Celsius og bilde i opptil 55 timer. For å samtidig bilde flere embryoer, bruk en sceneadapter som holder flere retter og roterer oppvasken en etter en slik at embryoene er horisontalt plassert.Velg et lavt forstørrelsesmål, finn deretter embryoene ved hjelp av okularet og til slutt justere dem horisontalt ved å rotere oppvasken. Registrer embryoenes plassering i programvaren og opprett et filnavn for autosparing av dataene. Angi pinhole størrelse, skannehastighet, bildestørrelse og zoom.Velg deretter en høyere forstørrelse for å ta bilder og fluorescenskanalene som skal avbildes. For hver kanal justerer du lasereffekten og detektoren høy spenning og sørger for å samle det beste dynamiske området som er mulig, samtidig som du unngår metning og begrenser bleking av bilder. Deretter, for å bilde hele embryoet med et 10X-mål, sett de store bildeopptaksinnstillingene i programvaren for å bilde flere synsfelt og sy dem sammen og justere embryoets posisjon for å sikre at det passer inn i dette store bildeområdet.Konfigurer innstillingene for å fange Z-stabler i henhold til manuskriptinstruksjonene. For å opprettholde fokus på flere embryoer under langsiktig tidsforløp, bruk et automatisert fokus og juster de individuelle offsetnivåene for hvert embryo for å fokusere på referanseplanet. Deretter setter du opp tidsforløpsparametere i mikroskopprogramvaren til bildet i en varighet på 55 timer med intervaller på én time.Ved hver syklus fanger du opp to embryodatasett sekvensielt og lagrer data automatisk. Bruk mikroskopprogramvaren til å behandle bildene. Hvis mer enn ett embryo ble avbildet, oppretter du uavhengige filer for hvert embryo ved å dele datasettene basert på plasseringen av bildet.Konverter datasettene for 3D-tid til datasett for 2D-tid ved hjelp av maksimal intensitetsprojeksjoner eller et lignende verktøy. Til slutt oppretter du filmfiler ved å lagre som AVI og velge alternativet ingen komprimering med 200 millisekundintervaller for en avspillingshastighet på fem bilder per sekund. Denne lagdelte monteringsmetoden gjør det mulig å bilde sebrafisk embryoer samtidig som de kan vokse, men samtidig begrense deres bevegelse.Hvis agarosekonsentrasjonen er for høy, blir embryoene forvrengt. Men hvis det er for lavt, vil de bevege seg ut av synsfeltet under time-lapse mikroskopi. Den optimale agarosekonsentrasjonen ble funnet å være mellom 0,028 og 0,034%Levende transgen sebrafisk som uttrykker RFP i hele embryoet og GFP i de endotelcellene i vaskulaturen ble avbildet i 55 timer der det intersegementale fartøyet spiret, subintestinal og hodevaskulatur utviklet, og cau vene plexuskondensasjon med trunk forlengelse oppstod.Embryoer som uttrykker GFP og motoriske nevroner ble avbildet for å visualisere motorneuronutvikling. Motorneuronaksonene spirer fra ventral nevralrør over somittene mot ventral side av embryoet. Samtidig utvikling av dorsal spirende motor neuron aksoner i forhold til plasseringen av intersegmentale fartøy ble avbildet ved hjelp av en høyere forstørrelse.Dette gjorde det mulig å visualisere de finere detaljene i ventral aksionspiring samt dorsal axon spirende fra nevrale røret. Etter hvert som somitetallene økte, strekker somites seg også i lengde og bredde. Denne prosessen ble avbildet ved hjelp av transgene embryoer som uttrykker GFP i muskler.Fordi den optimale konsentrasjonen av agarose er svært smal, er den svært følsom for små variasjoner i målinger når du forbereder lagerløsningen av agarose, og den må omdefineres for hver nye batch av agaroseløsning. Det er viktig å nøye angi bildeparametrene, inkludert bildestørrelse og oppløsning, skannehastighet, zoom, detektor høy spenning og laserkraft for å sikre konsistens mellom eksperimenter og også for å redusere muligheten for fototoksisitet og fotobleking under langsiktig tidsforløp. Ved hjelp av denne monteringsmetoden for transgene sebrafiskembryoer etterfulgt av utvidet tidsforløp av hele organismen, kan vi visualisere hvordan forskjellige vev utvikler seg sammen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging of Early kyllingfoster

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metode for Time-Lapse Imaging av Dyrkede Rat mesenteric mikrovaskulære nettverk

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Encellede kvantifisering av Protein degradering av Time-Lapse fluorescens mikroskopi i tilhenger cellekultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...