Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Agradecemos a Albert Pan e Arndt Sieakmann por presentes de peixe transgênico. Agradecemos Koichi Kawakami no Instituto Nacional de Genética, o Projeto Nacional de BioResource do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão para o dom do zebrafish transgênico HGn39b. Agradecemos também a Fátima Merchant e Kathleen Gajewski pela assistência na microscopia confocal e a Tracey Theriault por fotografias.
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos Institutos Nacionais de Saúde (número de subvenção P30ES023512 e número de contrato HHSN273201500010C). A SU foi apoiada por uma bolsa do programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) e por Hugh Roy e Lillie Endowment Fund. J-Å G foi apoiado pela Fundação Robert A. Welch (E-0004).

O trabalho animal apresentado aqui foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUCs) da Universidade de Houston e da Universidade de Indiana.
1. Criação de peixes
NOTA: O trabalho com modelos de vertebrados requer um protocolo aprovado pela IACUC. Deve ser conduzida de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes.
<ol><li>Manter zebrafish adulto, como descrito na literatura publicada anteriormente<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Um método de montagem para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões inteiros de zebrafish é descrito aqui. O passo mais crítico para o método de montagem é identificar a concentração ideal de agarose que permitirá o crescimento irrestrito do embrião de zebrafish e, ao mesmo tempo, manter os embriões em uma posição completamente fixa para imagens confocais. Como a concentração ideal de agarose é muito estreita, esse valor é muito sensível aos erros na medição do peso da agarose e...

O zebrafish tem sido um organismo modelo para a biologia do desenvolvimento, e a microscopia é o método principal para visualizar o desenvolvimento embrionário. As vantagens do uso de embriões de zebrafish para estudos de desenvolvimento incluem pequeno tamanho, clareza óptica, desenvolvimento rápido e alta fecundidade dos peixes adultos. A geração de linhas transgênicas de zebrafish expressando fluorescência em certos tecidos ou células permitiu uma visualização direta do desenvolvimento de tecidos de maneiras não possíveis com animais vertebrados maiores. Em combinação com a microscopia de lapso de tempo, detalhes e dinâmicas do desenvolvimento do tecido podem ser prontamente estudados.
Uma dificuldade com o desenvolvimento do zebrafish da imagem latente é que os embriões crescem substancialmente no comprimento; o embrião estende seu comprimento quatro vezes nos primeiros 3 dias de vida1. Além disso, o corpo do embrião precoce é macio e facilmente se torna distorcido se o crescimento for restrito. No entanto, para realizar microscopia confocal, o embrião deve ser imobilizado. Para manter os embriões em posição fixa para imagens confocais de lapso de tempo, eles são regularmente anestesiados e montados em 0,3-1% de baixa fusão agarose. Isto tem a vantagem de permitir algum crescimento durante a imagem latente por um determinado período de tempo, ao restringir movimentos do embrião. Partes do embrião podem ser imagemdas de forma eficiente assim. No entanto, ao utilizar este método de imagem de todo o embrião por longos períodos de tempo, as distorções são observadas devido ao crescimento restrito causado pela agarose. Assim, outros métodos de montagem são necessários. Kaufmann e seus colegas descreveram uma montagem alternativa de embriões de zebrafish para microscopia de folha de luz, como microscopia seletiva de iluminação plana (SPIM), montando os embriões em tubos de etileno fluorado (FEP) contendo baixas concentrações de agarose ou metilcelulose2. Esta técnica produz uma visualização soberba de embriogênese ao longo do tempo. Schmid et al. descrevem a montagem de até seis embriões em agarose em tubos feb para microscopia de folha de luz3 fornecendo visualização de vários embriões em uma sessão de imagem. Os moldes foram usados para criar disposições do embrião para a montagem eficiente de um número maior de embriões4. Masselkink et al. construíram moldes plásticos impressos em 3D que podem ser usados para fazer moldes de silício em que embriões de zebrafish em diferentes estágios podem ser colocados, permitindo a montagem em uma posição constante para imagens, incluindo imagens confocais5. Impressão 3D também tem sido usada para fazer moldes para o posicionamento consistente de embriões zebrafish em 96 bem formato6. Alguns moldes são personalizados para determinadas fases e não podem permitir o crescimento irrestrito por longos períodos de tempo, enquanto outros moldes são mais flexíveis. Recentemente, Weijts et al. publicou o projeto e fabricação de um prato de quatro poços para imagens ao vivo de embriões zebrafish7. Neste prato, a cauda e o tronco de embriões de peixeanestesiados são colocados manualmente um telhado de silicone claro ligado logo acima de um copo de cobertura para formar um bolso. O embrião é então fixado nesta posição pela adição de 0,4% agarose. Esta montagem permite a imagem latente da parte posterior de aproximadamente 2 milímetros de comprimento (tronco e cauda) do embrião, e como até 12 embriões podem ser montados por poço, o método permite a imagem latente de amostras múltiplas. Da mesma forma, Hirsinger e Steventon apresentaram recentemente um método onde a cabeça do peixe é montada em agarose, enquanto a cauda pode crescer livremente, e este método também facilita eficientemente a imagem do tronco e da região da cauda do embrião8.
Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem os movimentos dos embriões, permitindo um crescimento irrestrito. As vantagens deste método de montagem são que é um método de baixo custo, rápido e fácil de montar embriões de várias fases para imagens usando qualquer microscópio invertido. A montagem permite a imagem latente a longo prazo do corpo inteiro (cabeça, tronco e cauda) durante o desenvolvimento do embrião. Para mostrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgénicas. Dois embriões por sessão, em dois comprimentos de onda em 3D foram imageados pela microscopia do time-lapse por 55 horas consecutivas para render filmes do desenvolvimento do tecido.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

A dinâmica do desenvolvimento pode ser seguida pela microscopia confocal do time-lapse de embriões transgênicos vivos do zebrafish que expressam a fluorescência em tecidos ou em pilhas específicos. Uma dificuldade com o desenvolvimento de embriões inteiros da imagem latente é que os embriões do zebrafish crescem substancialmente no comprimento. Quando montada como feito regularmente em 0,3-1% de baixa agarose de raço, a agarose impõe restrição de crescimento, levando a distorções no corpo de embriões moles. No entanto, para realizar microscopia confocal time-lapse, o embrião deve ser imobilizado. Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem a motilidade dos embriões, permitindo o crescimento irrestrito. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações. Para demonstrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgémicos por 55 horas consecutivas. Este método de montagem pode ser usado para imagens fáceis e de baixo custo de embriões inteiros de zebrafish usando microscópios invertidos sem requisitos de moldes ou equipamentos especiais.

Desenvolvimento do método de montagem O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica de montagem de baixo custo para imagens de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish por longos períodos de tempo. O método de montagem em camadas foi desenvolvido para permitir o crescimento total do frágil corpo embrionário de zebrafish, restringindo seus movimentos. Se a concentração agarose da camada 1 for muito alta, os embriões ficarão distorcidos e curvos(Fig...

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A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Desenvolvemos um método de montagem para imagens de lapso de tempo que permite o crescimento irrestrito de embriões frágeis de zebrafish e, ao mesmo tempo, os mantém em uma posição completamente fixa. Este método de montagem é rápido, fácil e barato e funciona para imagens de laboratório em qualquer microscópio invertido. Desenvolvemos este método para a imagem de embriões de zebrafish vivos, mas ele poderia ser modificado para imagens de outros pequenos modelos de animais aquáticos.Comece criando o zebrafish adulto. À tarde, coloque os peixes em tanques de reprodução em uma proporção macho-fêmea de um para dois. Em seguida, prepare uma solução de estoque de 1% de derretimento baixo agarose em mídia de embrião e dissolvê-lo aquecendo-o em um forno de micro-ondas.Aliquot a solução agarose em tubos de 1,5 mililitro. Faça uma solução de estoque de 4% de tricaine em água destilada e armazene a ágarose e tricaine a quatro graus Celsius. Tricaine é tóxico e tem que ser pesado e preparado em um capô de fumaça.Após o acasalamento, colmeia os embriões de zebrafish em E3 em uma placa de Petri e incuba-os a 26,5 graus Celsius por cerca de 28 horas antes da montagem. Anestesiar os embriões com 0,02% de tricaine e descorriosá-los sob um microscópio, agarrando suavemente e puxando o acorde para liberar o embrião. Pouco antes da montagem, aqueça a solução agarose a 65 graus Celsius e deixe esfriar a aproximadamente 30 graus Celsius para que o embrião não seja prejudicado pelo calor e adicione tricaine à solução agarose.Use pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com um fundo de vidro de cobertura número zero. Coloque suavemente um embrião descorioado com um de seus lados laterais em direção ao fundo do prato com uma pipeta de vidro ou uma micropipette, em seguida, remova cuidadosamente qualquer E3 restante com uma micropipette. Adicione a primeira solução agarose ao pequeno poço criado pela tampa presa na parte inferior do prato para cobrir o embrião certificando-se de que a agarose cobre o poço pequeno, mas não transborda.Cubra o pequeno poço com um óculos de cobertura para criar um espaço estreito cheio de agarose com o embrião entre os dois óculos de cobertura. Coloque uma camada de solução de 1%agarose em cima da tampa por toda a parte inferior do prato que manterá a tampa no lugar à medida que se solidificar. Em seguida, encha a porção restante do prato com E3 contendo 0,02% de tricaine para manter o sistema hidratado.Para identificar a concentração ideal de agarose para a camada um, monte os embriões em concentrações crescentes de agarose e realize imagens de lapso de tempo para identificar a concentração que minimiza a distorção e a motilidade do embrião, em seguida, teste uma gama mais fina de concentrações com base nos resultados. O passo mais crítico deste protocolo é identificar a concentração ideal de agarose para a camada um. Teste diferentes nano concentrações de agarose, como 0,030%0,032%etc.para encontrar a concentração ideal. Para realizar imagens de lapso de tempo dos embriões, use um estágio de microscópio com uma incubadora fixada a 28,5 graus Celsius e imagem por até 55 horas. Para imagem simultânea de vários embriões, use um adaptador de palco que contém vários pratos e gire os pratos um a um para que os embriões estejam posicionados horizontalmente.Selecione um objetivo de baixa ampliação, localize os embriões usando a ocular e, finalmente, alinhe-os horizontalmente girando os pratos. Registo a localização dos embriões no software e crie um nome de arquivo para autossusuer os dados. Defina o tamanho do pinhole, a velocidade de digitalização, o tamanho da imagem e o zoom.Em seguida, selecione uma ampliação maior para capturar imagens e os canais de fluorescência a serem imagens. Para cada canal, ajuste a potência do laser e o detector de alta tensão certificando-se de coletar o melhor alcance dinâmico possível, evitando a saturação e limitando o branqueamento fotográfico. Em seguida, para imaginar todo o embrião com um objetivo de 10X, defina as grandes configurações de captura de imagem no software para visualizar vários campos de visão e costurá-los juntos ajustando a posição do embrião para garantir que ele se encaixe dentro desta grande área de imagem.Configure as configurações para capturar pilhas Z de acordo com as instruções do manuscrito. A fim de manter o foco de múltiplos embriões durante a imagem de lapso de tempo de longo prazo, use um foco automatizado e ajuste os níveis de deslocamento individuais para cada embrião se concentrar no plano de referência. Em seguida, configure parâmetros de lapso de tempo no software de microscópio para imagem por uma duração de 55 horas em intervalos de uma hora.Em cada ciclo, capture dois conjuntos de dados de embriões sequencialmente e salve os dados automaticamente. Use o software de microscópio para processar as imagens. Se mais de um embrião for visualizado, crie arquivos independentes para cada embrião dividindo os conjuntos de dados com base na localização da imagem.Converta os conjuntos de dados de tempo 3D em conjuntos de dados de tempo 2D usando projeções de intensidade máxima ou uma ferramenta semelhante. Finalmente, crie arquivos de filme salvando como AVI e selecionando a opção sem compactação com intervalos de 200 milissegundos para uma velocidade de reprodução de cinco quadros por segundo. Este método de montagem em camadas torna possível a imagem de embriões de zebrafish, permitindo que eles cresçam, mas ao mesmo tempo restringindo seu movimento.Se a concentração de ágarose é muito alta, os embriões ficam distorcidos. Mas se for muito baixo, eles sairão do campo de visão durante a microscopia de lapso de tempo. A concentração de agarose ideal foi encontrada entre 0,028 e 0,034%Os zebrafish transgênicos vivos expressando RFP em todo o embrião e GFP nas células endoteliais da vasculatura foram imagens durante 55 horas durante as quais o vaso intersegemental brotou, a vasculatura subintestinal e a cabeça se desenvolveu, e a condensação de plexidade da veia caudal com a extensão do tronco ocorreu.Embriões que expressam GFP e neurônios motores foram imagens para visualizar o desenvolvimento do neurônio motor. Os axônios do neurônio motor brotam do tubo neural ventral sobre os somites em direção ao lado ventral do embrião. O co-desenvolvimento do broto dorsal dos axônios do neurônio motor em relação à posição dos vasos intersegmentais foi imageado utilizando-se uma ampliação mais elevada.Isso possibilitou visualizar os detalhes mais finos do axônio ventral brotando, bem como o axônio dorsal brotando do tubo neural. À medida que o número de somitas aumentava, as somitas também se estendem em comprimento e largura. Este processo foi imageado usando embriões transgênicos expressando GFP nos músculos.Como a concentração ideal de agarose é muito estreita, é muito sensível a pequenas variações nas medições ao preparar a solução de estoque de agarose e precisa ser redefinida para cada novo lote de solução agarose. É importante definir cuidadosamente os parâmetros de imagem, incluindo tamanho e resolução de imagem, velocidade de varredura, zoom, alta tensão do detector e poder laser para garantir a consistência entre os experimentos e também reduzir a possibilidade de toxicidade fotográfica e branqueamento de fotos durante imagens de longo prazo. Usando este método de montagem para embriões transgênicos de zebrafish seguido de imagens estendidas de lapso de tempo de todo o organismo, podemos visualizar como diferentes tecidos se desenvolvem juntos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

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analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

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