Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Agradecemos a Albert Pan y Arndt Sieakmann por los regalos de pescado transgénico. Agradecemos a Koichi Kawakami en el Instituto Nacional de Genética, el Proyecto Nacional de Biorecursos del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón por el regalo del pez cebra transgénico HGn39b. También agradecemos a Fatima Merchant y Kathleen Gajewski por su ayuda en microscopía confocal, y a Tracey Theriault por fotografías.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Institutos Nacionales de Salud (número de subvención P30ES023512 y número de contrato HHSN273201500010C). SU fue apoyada por una beca del programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) y por Hugh Roy y Lillie Endowment Fund. La Fundación Robert A. Welch (E-0004) contó con el apoyo de j-o G.

El trabajo animal presentado aquí fue aprobado por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUCs) de la Universidad de Houston y la Universidad de Indiana.
1. Cría de pescado
NOTA: El trabajo con modelos de vertebrados requiere un protocolo aprobado por la IACUC. Debe llevarse a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes.
<ol><li>Mantener el pez cebra adulto como se describe en la literatura publicada anterio...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Aquí se describe un método de montaje para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de peces cebra. El paso más crítico para el método de montaje es identificar la concentración óptima de agarosa que permitirá el crecimiento sin restricciones del embrión del pez cebra, y al mismo tiempo mantener los embriones en una posición completamente fija para la toma de imágenes confocales. Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, este valor es muy sensible a lo...

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la biología del desarrollo, y la microscopía es el principal método para visualizar el desarrollo embrionario. Las ventajas de utilizar embriones de pez cebra para estudios de desarrollo incluyen pequeño tamaño, claridad óptica, desarrollo rápido y alta fecundidad de los peces adultos. La generación de líneas transgénicas de peces cebra que expresan fluorescencia en ciertos tejidos o células han permitido una visualización directa del desarrollo de tejidos de maneras no posibles con animales vertebrados más grandes. En combinación con la microscopía de lapso de tiempo, los detalles y la dinámica del desarrollo del tejido se pueden estudiar fácilmente.
Una dificultad con el desarrollo de peces cebra por imágenes es que los embriones crecen sustancialmente en longitud; el embrión extiende su longitud cuatro veces dentro de los primeros 3 días de vida1. Además, el cuerpo del embrión temprano es suave, y fácilmente se distorsiona si el crecimiento está restringido. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal, el embrión debe estar inmovilizado. Para mantener los embriones en una posición fija para la toma de imágenes confocales de lapso de tiempo, se anestesian regularmente y se montan en agarosa de fusión baja del 0,3-1%. Esto tiene la ventaja de permitir cierto crecimiento durante la toma de imágenes durante un cierto período de tiempo, mientras que restringe los movimientos del embrión. Partes del embrión se pueden imaginar eficientemente así. Sin embargo, cuando se utiliza este método para la toma de imágenes de todo el embrión durante períodos de tiempo prolongados, se observan distorsiones debido al crecimiento restringido causado por la agarosa. Por lo tanto, se requieren otros métodos de montaje. Kaufmann y sus colegas han descrito un montaje alternativo de embriones de pez cebra para la microscopía de láminas ligeras, como la microscopía de iluminación selectiva de plano (SPIM), montando los embriones en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) que contienen bajas concentraciones de agarosa o metilcelulosa2. Esta técnica produce una excelente visualización de la embriogénesis a lo largo del tiempo. Schmid et al. describen el montaje de hasta seis embriones en agarosa en tubos FEB para la microscopía de hoja de luz3 proporcionando visualización de varios embriones en una sesión de imágenes. Se han utilizado moldes para crear matrices de embriones para un montaje eficiente de un mayor número de embriones4. Masselkink et al. han construido moldes de plástico impresos en 3D que se pueden utilizar para hacer moldes de silicio en los que se pueden colocar embriones de pez cebra en diferentes etapas, lo que permite el montaje en una posición constante para la toma de imágenes, incluida la imagen confocal5. La impresión 3D también se ha utilizado para hacer moldes para el posicionamiento consistente de embriones de pez cebra en formato de 96 pozos6. Algunos moldes se personalizan para ciertas etapas y pueden no permitir un crecimiento sin restricciones durante largos períodos de tiempo, mientras que otros moldes son más flexibles. Recientemente, Weijts et al. publicaron el diseño y la fabricación de un plato de cuatro pozos para la toma de imágenes en vivo de embriones de pez cebra7. En este plato, la cola y el tronco de los embriones de pescado anestesiados se colocan manualmente bajo un techo de silicona transparente unido justo encima de un cristal de cubierta para formar un bolsillo. El embrión se fija entonces en esta posición mediante la adición de 0,4% de agarosa. Este montaje permite la toma de imágenes de la parte posterior de unos 2 mm de largo (tronco y cola) del embrión, y como se pueden montar hasta 12 embriones por pozo, el método permite la toma de imágenes de múltiples muestras. Del mismo modo, Hirsinger y Steventon presentaron recientemente un método donde la cabeza del pez está montada en agarose, mientras que la cola puede crecer libremente, y este método también facilita eficientemente la toma de imágenes del tronco y la región de la cola del embrión8.
Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen los movimientos de los embriones mientras permiten un crecimiento sin restricciones. Las ventajas de este método de montaje son que es un método de bajo costo, rápido y fácil para montar embriones de varias etapas para la toma de imágenes utilizando cualquier microscopio invertido. El montaje permite imágenes a largo plazo de todo el cuerpo (cabeza, tronco y cola) durante el desarrollo embrionario. Para mostrar la usabilidad de este método, se realizó la imagen del desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros en peces transgénicos. Dos embriones por sesión, a dos longitudes de onda en 3D fueron representados por microscopía de lapso de tiempo durante 55 horas consecutivas para representar películas de desarrollo de tejido.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

La dinámica de desarrollo puede ser seguida por una microscopía confocal de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos vivos que expresan fluorescencia en tejidos o células específicos. Una dificultad con el desarrollo de embriones enteros es que los embriones de pez cebra crecen sustancialmente en longitud. Cuando se monta como se hace regularmente en 0.3-1% baja agarosa de fusión, la agarosa impone restricción de crecimiento, dando lugar a distorsiones en el cuerpo del embrión blando. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal de lapso de tiempo, el embrión debe ser inmovilizado. Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen la motilidad de los embriones mientras permiten el crecimiento sin restricciones. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones. Para demostrar la usabilidad de este método, el desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros se realizó en peces transgénicos durante 55 horas consecutivas. Este método de montaje se puede utilizar para obtener imágenes fáciles y de bajo costo de embriones enteros de peces cebra utilizando microscopios invertidos sin necesidad de moldes o equipos especiales.

Desarrollo del método de montaje El objetivo principal de este trabajo era desarrollar una técnica de montaje de bajo costo para la toma de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo de peces cebra durante largos períodos de tiempo. El método de montaje en capas fue desarrollado para permitir el crecimiento completo del frágil cuerpo embrionario de pez cebra, al tiempo que restringe sus movimientos. Si la concentración de agarosa de la capa 1 es demasiado alta, los embriones se distorsionarán ...

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A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Hemos desarrollado un método de montaje para la toma de imágenes de lapso de tiempo que permite el crecimiento sin restricciones de embriones frágiles de peces cebra y al mismo tiempo los mantiene en una posición completamente fija. Este método de montaje es rápido, fácil y barato y funciona para imágenes de laboratorio en cualquier microscopio invertido. Desarrollamos este método para la toma de imágenes de embriones vivos de peces cebra, pero podría ser modificado para la toma de imágenes de otros pequeños modelos de animales acuáticos.Comience por la cría del pez cebra adulto. Por la tarde, coloque los peces en tanques de cría en una proporción de hombre a mujer de uno a dos. A continuación, prepare una solución de stock de 1% de agarosa fundible baja en medios embrionarios y disuelva calentándola en un horno microondas.Aliquot la solución de agarosa en tubos de 1,5 mililitros. Hacer una solución de stock de 4%tricaína en agua destilada y almacenar la agarosa y tricaína a cuatro grados centígrados. La tricaína es tóxica y tiene que ser pesada y preparada en una campana de humo.Después del apareamiento, cosecha los embriones de pez cebra en E3 en un plato de Petri e incubarlos a 26,5 grados centígrados durante unas 28 horas antes del montaje. Anesthetizar los embriones con 0.02%tricaína y descorionarlos bajo un microscopio agarrándolos suavemente y separando la tarea para liberar el embrión. Justo antes del montaje, calentar la solución de agarosa a 65 grados Celsius y luego dejar enfriar a aproximadamente 30 grados Celsius para que el embrión no se dañe por el calor y añadir tricaína a la solución de agarosa.Utilice platos de fondo de cristal de 35 milímetros con un fondo de cubierta cero número. Coloque suavemente un embrión descorionado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato con una pipeta de vidrio o una micropipeta, luego retire cuidadosamente cualquier E3 restante con una micropipeta. Añadir la primera solución de agarosa a la pequeña bien creada por el vaso de cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión asegurándose de que la agarosa cubre el pozo pequeño, pero no lo desborda.Cubra el pozo pequeño con un cubrecubos para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre las dos cubiertas. Coloque una capa de 1% de solución de agarosa en la parte superior del vidrio de la cubierta por toda la parte inferior del plato que mantendrá el vaso en su lugar a medida que se solidifica. A continuación, llene la porción restante del plato con E3 que contenga 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado.Para identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno, monte los embriones en concentraciones crecientes de agarosa y realice imágenes de lapso de tiempo para identificar la concentración que minimiza la distorsión embrionaria y la motilidad, luego pruebe un rango más fino de concentraciones basadas en los resultados. El paso más crítico de este protocolo es identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno. Probar diferentes nano concentraciones de agarosa como 0.030%0.032%etc.para encontrar la concentración óptima. Para realizar imágenes de lapso de tiempo de los embriones, utilice una etapa de microscopio con una incubadora establecida en 28,5 grados centígrados y una imagen de hasta 55 horas. Para tomar imágenes simultáneas de varios embriones, utilice un adaptador de etapa que sostenga varios platos y gire los platos uno por uno para que los embriones se coloquen horizontalmente.Seleccione un objetivo de bajo aumento, luego localice los embriones usando el ocular y finalmente alinee horizontalmente girando los platos. Registre la ubicación de los embriones en el software y cree un nombre de archivo para guardar automáticamente los datos. Establezca el tamaño del agujero, la velocidad de escaneo, el tamaño de la imagen y el zoom.A continuación, seleccione un aumento más alto para capturar imágenes y los canales de fluorescencia que se van a tomar imágenes. Para cada canal, ajuste la potencia del láser y el detector de alto voltaje asegurándose de recoger el mejor rango dinámico posible evitando la saturación y limitando el blanqueo fotográfico. A continuación, para crear imágenes de todo el embrión con un objetivo 10X, establezca los ajustes de captura de imágenes grandes en el software para crear una imagen de varios campos de visión y unirlos ajustando la posición del embrión para asegurarse de que se ajuste dentro de esta gran área de imagen.Configure los ajustes para capturar pilas Z de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Con el fin de mantener el enfoque de múltiples embriones durante la toma de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice un enfoque automatizado y ajuste los niveles de desplazamiento individuales para que cada embrión se enfoque en el plano de referencia. A continuación, configure los parámetros de lapso de tiempo en el software del microscopio para crear una imagen durante una duración de 55 horas a intervalos de una hora.En cada ciclo, capture dos conjuntos de datos embrionarios secuencialmente y guarde los datos automáticamente. Utilice el software del microscopio para procesar las imágenes. Si se ha creado una imagen de más de un embrión, cree archivos independientes para cada embrión dividiendo los conjuntos de datos en función de la ubicación de la imagen.Convierta los datasets de tiempo 3D en datasets de tiempo 2D utilizando proyecciones de intensidad máxima o una herramienta similar. Por último, cree archivos de película guardando como AVI y seleccionando la opción sin compresión con intervalos de 200 milisegundos para una velocidad de reproducción de cinco fotogramas por segundo. Este método de montaje en capas permite crear imágenes de embriones de pez cebra, al tiempo que les permite crecer pero al mismo tiempo restringir su movimiento.Si la concentración de agarosa es demasiado alta, los embriones se distorsionan. Pero si es demasiado bajo, se moverán fuera del campo de visión durante la microscopía de lapso de tiempo. Se encontró que la concentración óptima de agarosa estaba entre 0,028 y 0,034% pece cebra transgénica viva que expresaba RFP en todo el embrión y la GFP en las células endoteliales de la vasculatura durante 55 horas durante las cuales el recipiente intersecumental brotó, se desarrolló la vastura subintestinal y de la cabeza, y se produjo condensación de venas caudales con extensión de tronco.Los embriones que expresaban GFP y las neuronas motoras fueron imágenes para visualizar el desarrollo de las neuronas motoras. Los axones de neurona motora brotan del tubo neural ventral sobre las somitas hacia el lado ventral del embrión. El co-desarrollo de la brotación dorsal de los axones de neuronas motoras en relación con la posición de los vasos intersegmentales se hizo una imagen utilizando un aumento más alto.Esto hizo posible visualizar los detalles más finos de la brotación de axón ventral, así como el axón dorsal que brota del tubo neural. A medida que aumentaba el número de somitas, las somites también se extienden en longitud y anchura. Este proceso se hizo con imágenes utilizando embriones transgénicos que expresan la GFP en los músculos.Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, es muy sensible a pequeñas variaciones en las mediciones al preparar la solución de agarosa y necesita ser redefinida para cada nuevo lote de solución de agarosa. Es importante establecer cuidadosamente los parámetros de imagen, incluyendo el tamaño y la resolución de la imagen, la velocidad de escaneo, el zoom, el detector de alto voltaje y la potencia del láser para garantizar la consistencia entre los experimentos y también para reducir la posibilidad de toxicidad fotográfica y blanqueo fotográfico durante imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Utilizando este método de montaje para embriones de pez cebra transgénicos seguido de imágenes de lapso de tiempo extendidas de todo el organismo, podemos visualizar cómo se desarrollan juntos diferentes tejidos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

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A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

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