Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Vi tackar Albert Pan och Arndt Sieakmann för gåvor av transgena fiskar. Vi tackar Koichi Kawakami vid National Institute of Genetics, det nationella Bioresource projektet från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan för gåvan av den transgena zebrafiskar HGn39b. Vi tackar också Fatima Merchant och Kathleen Gajewski för hjälp med konfokalmikroskopi, och Tracey Theriault för fotografier.
Detta arbete stöddes av bidrag från nationella institutet för miljö hälsovetenskaper vid National Institutes of Health (bidrags nummer P30ES023512 och kontraktsnummer HHSN273201500010C). SU stöddes av ett stipendium från Keck Computational cancer biologi program (Gulf Coast konsortia CPRIT Grant RP140113) och av Hugh Roy och Lillie donationsfond. J-Å G stöddes av Robert A. Welch Foundation (E-0004).

Det djur arbete som presenteras här godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittéer (IACUCs) vid University of Houston och Indiana University.
1. fisk hållning
Anm.: arbete med ryggradsdjur kräver ett IACUC-godkänt protokoll. Den bör genomföras i enlighet med relevanta nationella och internationella riktlinjer.
<ol><li>Underhåll vuxna zebrafiskar enligt beskrivningen i tidigare publicerad litteratur9.</li>
	<...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Här beskrivs en monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela zebrafiskar embryon. Det mest kritiska steget för monteringsmetoden är att identifiera den optimala koncentrationen av aguppstod som kommer att möjliggöra obegränsad zebrafiskar embryotillväxt, och samtidigt hålla embryona i en helt fast position för konfokal avbildning. Eftersom den optimala koncentrationen av aguppstod är mycket smal, är detta värde mycket känsligt för fel i mätningen av vikten av Agreste och volyme...

Sebrafisken har länge varit en modellorganism för utvecklingsbiologi, och mikroskopi är den viktigaste metoden för att visualisera embryonal utveckling. Fördelarna med att använda zebrafiskar embryon för utvecklingsstudier inkluderar liten storlek, optisk klarhet, snabb utveckling, och hög Fecundity av den vuxna fisken. Generering av transgena zebrafiskar linjer uttrycker fluorescens i vissa vävnader eller celler har tillåtit en direkt visualisering av vävnads utveckling på ett sätt som inte är möjligt med större ryggradsdjur. I kombination med tidsfördröjd mikroskopi kan detaljer och dynamik i vävnads utvecklingen lätt studeras.
En svårighet med Imaging zebrafiskar utveckling är att embryona växer avsevärt i längd; embryot förlänger sin längd fyra gånger inom de första 3 dagarna i livet1. Också, kroppen av det tidiga embryot är mjuk, och lätt blir förvrängd om tillväxten är begränsad. Men för att utföra konfokalmikroskopi måste embryot immobiliseras. För att hålla embryon i en fast position för konfokaltid-lapse Imaging, de är regelbundet sövda och monteras i 0,3-1% låg smälta Agreste. Detta har fördelen av att tillåta viss tillväxt under bildtagning under en viss tidsperiod, samtidigt som man begränsar embryots rörelser. Delar av embryot kan effektivt avbildas så här. Vid användning av denna metod för avbildning av hela embryot under längre tidsperioder observeras dock snedvridningar på grund av den begränsade tillväxt som orsakats av aganden. Därför krävs andra monteringsmetoder. Kaufmann och kollegor har beskrivit en alternativ montering av zebrafiskar embryon för ljusplåt mikroskopi, såsom selektiv plan belysning mikroskopi (spim), genom att montera embryon i fluorerade etylenpropylen (FEP) rör som innehåller låga koncentrationer av aguppstod eller metylcellulosa2. Denna teknik ger en superb visualisering av embryogenes över tid. Schmid et al. beskriva montering av upp till sex embryon i aguppstod i FEB rör för ljus-Sheet mikroskopi3 tillhandahålla visualisering av flera embryon i en avbildning session. Formar har använts för att skapa embryomatriser för effektiv montering av ett större antal embryon4. Masselkink et al. har konstruerat 3D tryckt plast formar som kan användas för att göra kisel kastar att zebrafiskar embryon i olika stadier kan placeras i, vilket möjliggör montering i en konstant position för avbildning, inklusive konfokalmikroskopi Imaging5. 3D-utskrifter har också använts för att göra formar för konsekvent positionering av zebrafiskar embryon i 96-väl format6. Vissa formar är anpassade för vissa stadier och kan inte tillåta obegränsad tillväxt under långa tidsperioder, medan andra formar är mer flexibla. Nyligen publicerade weijts et al. design och tillverkning av en fyra-väl skålen för levande avbildning av zebrafiskar embryon7. I denna maträtt, är svansen och stammen av sövda fisk embryon placeras manuellt under en klar silikon tak bifogas strax ovanför ett täckglas för att bilda en ficka. Embryot är sedan fast i detta läge genom tillsats av 0,4% Agreste. Denna montering möjliggör avbildning av den ca 2 mm långa bakre delen (bål och svans) av embryot, och upp till 12 embryon kan monteras per brunn, metoden möjliggör avbildning av flera prover. Likaså presenterade Hirsinger och Steventon nyligen en metod där huvudet av fisken är monterad i aguppstod, medan svansen kan fritt växa, och denna metod också effektivt underlättar avbildning av stammen och svans regionen av embryot8.
Denna artikel beskriver en skiktad monteringsmetod för zebrafiskar embryon som begränsar förflyttningar av embryon samtidigt som den möjliggör obegränsad tillväxt. Fördelarna med denna monteringsmetod är att det är en låg kostnad, snabb och enkel metod för att montera embryon i olika stadier för avbildning med hjälp av inverterade Mikroskop. Monteringen tillåter långsiktig avbildning av hela kroppen (huvud, bål och svans) under embryots utveckling. För att Visa användbarheten av denna metod, hela embryo vaskulär, neuronala och muskelutveckling var avbildas i transgena fisk. Två embryon per session, vid två våglängder i 3D var avbildas av Time-lapse mikroskopi för 55 timmar i sträck för att återge filmer av vävnad utveckling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

Dynamiken i utvecklingen kan följas av konfokaltidsförlopp mikroskopi av levande transgena zebrafiskar embryon uttrycker fluorescens i specifika vävnader eller celler. En svårighet med avbildning hela embryots utveckling är att zebrafiskar embryon växer avsevärt i längd. När den monteras som regelbundet görs i 0,3-1% låg smält aguppstod, aguppstod innebär tillväxt begränsning, vilket leder till snedvridningar i den mjuka embryot kroppen. Ändå, för att utföra konfokaltid-lapse mikroskopi, måste embryot immobiliseras. Denna artikel beskriver en skiktad monteringsmetod för zebrafiskar embryon som begränsar motilitet av embryon samtidigt som det möjliggör obegränsad tillväxt. Monteringen utförs i lager av aganat vid olika koncentrationer. För att demonstrera användbarheten av denna metod, hela embryo vaskulär, neuronala och muskelutveckling var avbildas i transgena fisk för 55 timmar i följd. Denna monteringsmetod kan användas för enkel, låg kostnad avbildning av hela zebrafiskar embryon med inverterade Mikroskop utan krav på formar eller särskild utrustning.

Utveckling av monteringsmetoden Det huvudsakliga syftet med detta arbete var att utveckla en låg kostnad Monteringsteknik för tidsförlopp avbildning av zebrafiskar utveckling under längre tidsperioder. Den lagrade monteringsmetoden utvecklades för att möjliggöra full tillväxt av den bräckliga zebrafiskar embryo kroppen, samtidigt begränsa dess rörelser. Om aganhalten i lager 1 är för hög blir embryona förvrängda och böjda (figur 2). Embryon som odlas på ...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Denna artikel beskriver en metod för att montera bräckliga zebrafiskar embryon för utökad tid-lapse konfokal mikroskopi. Denna lågkostnads metod är lätt att utföra med hjälp av vanliga glasbotten mikroskopi rätter för avbildning på någon inverterad Mikroskop. Monteringen utförs i lager av aganat vid olika koncentrationer.

En skiktad monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela Zebrafish embryon

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Vi har utvecklat en monteringsmetod för avbildning av tidsförlopp som möjliggör obegränsad tillväxt av ömtåliga zebrafiskembryon och samtidigt håller dem i ett helt fast läge. Denna monteringsmetod är snabb, enkel och billig och det fungerar för lab imaging på alla inverterade mikroskop. Vi utvecklade denna metod för avbildning av levande zebrafisk embryon, men det kan ändras för avbildning av andra små vattenlevande djur modeller.Börja med att föda upp de vuxna zebrafiskarna. På eftermiddagen placerar fisken i häckningstankar vid ett förhållande mellan män och hona på ett till två. Sedan förbereda en stamlösning på 1%låg smälta agaros i embryo media och lösa upp den genom att värma den i en mikrovågsugn.Aliquot agaroslösningen i 1,5 milliliterrör. Gör en stamlösning på 4%trikain i destillerat vatten och förvara agaros och trikain i fyra grader Celsius. Trikain är giftigt och måste vägas och förberedas i en rök huva.Efter parning skördar du zebrafiskembryonen i E3 i en petriskål och ruvar dem i 26,5 grader Celsius i ca 28 timmar före montering. Bedöva embryona med 0,02%trikain och dehorionate dem under ett mikroskop genom att försiktigt greppa och dra chorion isär för att släppa embryot. Strax före montering, värm agaroslösningen till 65 grader Celsius och låt den sedan svalna till cirka 30 grader Celsius så embryot inte skadas av värmen och tillsätt trikain till agaroslösningen.Använd 35 millimeters glas botten rätter med ett nummer noll coverglass botten. Placera försiktigt ett dehorionerat embryo med en av dess sidor i lateralt mot botten av skålen med en glaspipett eller en mikropipette, ta sedan försiktigt bort eventuella kvarvarande E3 med en mikropipette. Tillsätt den första agaroslösningen till den lilla brunnen som skapas av täckglaset fäst på botten av skålen för att täcka embryot och se till att agarosen täcker den lilla brunnen men inte svämmar över den.Täck den lilla brunnen med ett täckglas för att skapa ett smalt agarosfyllt utrymme med embryot mellan de två täckglasen. Placera ett lager av 1%agaroslösning ovanpå täckglaset över hela botten av skålen som kommer att hålla täckglas på plats eftersom det stelnar. Fyll sedan den återstående delen av skålen med E3 som innehåller 0,02%trikain för att hålla systemet hydraterat.För att identifiera den optimala agaroskoncentrationen för skikt ett, montera embryona i ökande koncentrationer av agaros och utföra timelapseimaging för att identifiera den koncentration som minimerar embryosvridning och motilitet, testa sedan ett finare intervall av koncentrationer baserat på resultaten. Det mest kritiska steget i detta protokoll är att identifiera den optimala koncentrationen av agaros för skikt ett. Testa olika nanokoncentrationer av agaros såsom 0,030%0,032%etc.för att hitta den optimala koncentrationen. För att utföra timelapseimaging av embryona, använd ett mikroskopstadium med en inkubator inställd på 28,5 grader Celsius och bild i upp till 55 timmar. För att samtidigt avbilda flera embryon, använd en stegadapter som rymmer flera rätter och rotera disken en efter en så att embryona är horisontellt placerade.Välj en låg förstoring mål, sedan lokalisera embryon med hjälp av okularet och slutligen rikta dem horisontellt genom att rotera disken. Registrera embryon'plats i programvaran och skapa ett filnamn för autosparing av data. Ställ in pinhole-storlek, skanningshastighet, bildstorlek och zoom.Välj sedan en högre förstoring för att fånga bilder och de fluorescenskanaler som ska avbildas. För varje kanal, justera lasereffekten och detektorn hög spänning se till att samla in bästa möjliga dynamiska omfång samtidigt som man undviker mättnad och begränsa foto blekning. Nästa, att bilden hela embryot med en 10X mål, ställa in den stora bilden fånga inställningar i programvaran för att bilden flera synfält och sy ihop dem justera positionen för embryot för att se till att det passar inom denna stora bild område.Konfigurera inställningarna för att fånga Z-stackar enligt manuskriptriktningarna. För att behålla fokus på flera embryon under långsiktig time-lapse imaging, använd ett automatiserat fokus och justera de individuella förskjutningsnivåerna för varje embryo att fokusera på referensplanet. Ställ sedan in tidsförloppsparametrar i mikroskopprogramvaran till bild under en varaktighet av 55 timmar med en timmes intervall.Vid varje cykel, fånga två embryo datamängder sekventiellt och spara data automatiskt. Använd mikroskopprogramvaran för att bearbeta bilderna. Om mer än ett embryo avbildades, skapa oberoende filer för varje embryo genom att dela upp datamängderna baserat på platsen för avbildningen.Omvandla 3D-tidsdatauppsättningarna till 2D-tidsdatauppsättningar med hjälp av projektioner för maximal intensitet eller ett liknande verktyg. Skapa slutligen filmfiler genom att spara som AVI och välja alternativet ingen komprimering med 200 millisekunders intervall för en uppspelningshastighet på fem bildrutor per sekund. Denna skiktade monteringsmetod gör det möjligt att avbilda zebrafisk embryon samtidigt som de kan växa men samtidigt begränsa deras rörelse.Om koncentrationen av agaros är för hög, blir embryona förvrängda. Men om det är för lågt, kommer de att flytta ut ur synfältet under time-lapse mikroskopi. Den optimala agaros koncentrationen konstaterades vara mellan 0,028 och 0,034%Levande transgena zebrafiskar uttrycker RFP i hela embryot och GFP i endotel celler av vasculature var avbildade i 55 timmar under vilken den intersegemental fartyget grodda, subintestinal och headsculature utvecklas och caudal vein plex kondensation med bålen förlängs.Embryon som uttrycker GFP och motor nervceller var avbildade för att visualisera motor neuron utveckling. Motorn neuron axoner gro från ventrala neuralrör över somites mot den ventrala sidan av embryot. Samutveckling av ryggspirande av motor neuron axoner i förhållande till positionen för intersegmental fartyg var avbildad med hjälp av en högre förstoring.Detta gjorde det möjligt att visualisera de finare detaljerna i ventrala axon groning samt dorsala axon groning från neuralröret. I och med att antalet somiter ökade, sträcker sig somiterna också i längd och bredd. Denna process var avbildad med hjälp av transgena embryon uttrycker GFP i muskler.Eftersom den optimala koncentrationen av agaros är mycket smal, är den mycket känslig för små variationer i mätningar när man förbereder stamlösningen av agaros och den behöver omdefinieras för varje ny sats av agaroslösning. Det är viktigt att noggrant ställa in avbildningsparametrar inklusive bildstorlek och upplösning, skanningshastighet, zoom, detektor hög spänning, och lasereffekt för att säkerställa överensstämmelse mellan experiment och även för att minska möjligheten till foto toxicitet och foto blekning under lång sikt time-lapse imaging. Med hjälp av denna monteringsmetod för transgena zebrafiskembryon följt av förlängd timelapse-avbildning av hela organismen kan vi visualisera hur olika vävnader utvecklas tillsammans.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fånga Tissue Repair i Zebrafish Larver med Time-lapse Bright stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analysera<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migration använder Cell Transplantationer och Time-lapse avbildning i Zebrafish embryon

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En nedsänkt filterpapper Sandwich för långsiktigt<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse avbildning av tidig kycklingembryon

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metod för time-lapse avbildning av odlade Rat Mesenteric Mikrovaskulära Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En mångsidig Monteringsmetod för Long Term avbildning av zebrafisk utveckling

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Single-Cell kvantifiering av Protein nedbrytningshastigheten av Time-Lapse fluorescensmikroskopi i vidhäftande cellodling

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...