Name: a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

Albert Pan ve Arndt Sieakmann'a transgenik balık hediyeleri için teşekkür ederiz. Biz Genetik Ulusal Enstitüsü'nde Koichi Kawakami teşekkür, Eğitim Bakanlığı Ulusal BiyoKaynak Projesi, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya transgenik zebra balığı HGn39bhediye için . Ayrıca Fatima Merchant ve Kathleen Gajewski'ye konfokal mikroskopi konusunda yardımcı lıkları için ve Tracey Theriault'a da fotoğraflar için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nün (p30ES023512 hibe numarası ve HHSN2732015000010C) hibeleri ile desteklenmiştir. SU Keck Hesaplamalı Kanser Biyolojisi programı (Gulf Coast Consortia CPRIT hibe RP140113) ve Hugh Roy ve Lillie Bağış Fonu tarafından bir burs tarafından desteklendi. J-Å G, Robert A. Welch Vakfı (E-0004) tarafından desteklendi.

Burada sunulan hayvan çalışmaları Houston Üniversitesi ve Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUCs) tarafından onaylanmıştır.
1. Balık yetiştiriciliği
NOT: Omurgalı modelleri ile çalışmak iACUC onaylı bir protokol gerektirir. İlgili ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
<ol><li>Daha önce yayınlanmış literatürde açıklandığı gibi yetişkin zebra balığı koruyun<sup class...

<ol>
	<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207 (2013).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing.">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).</li><li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish.">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li><li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development.">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish.">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes:+tcf7+and+synembryn-like.">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li><li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+MS-222+(tricaine)+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish.">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li><li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish.">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).</li></ol>

Tüm zebra balığı embriyolarının uzun süreli konfokal mikroskopisi için bir montaj yöntemi burada açıklanmıştır. Montaj yöntemi için en kritik adım sınırsız zebra balığı embriyo büyümesi için izin verecek agarose optimal konsantrasyonu belirlemek için, ve aynı zamanda konfokal görüntüleme için tamamen sabit bir konumda embriyotutmak. Agarose'un optimum konsantrasyonu çok dar olduğundan, bu değer çözeltinin hazırlanması sırasında agarose'un ağırlığının ve E3 hacminin ölçülm...

Zebra balığı uzun gelişimbiyolojisi için örnek bir organizma olmuştur ve mikroskopi embriyonik gelişimi görselleştirmek için önemli bir yöntemdir. Gelişimsel çalışmalar için zebra balığı embriyoları kullanmanın avantajları küçük boyut, optik netlik, hızlı gelişme ve yetişkin balıkların yüksek fecundity içerir. Bazı doku veya hücrelerde floresans ifade transgenik zebra balığı hatları nesil büyük omurgalı hayvanlar ile mümkün olmayan şekillerde doku gelişiminin doğrudan görselleştirilmesi için izin verdi. Zaman atlamalı mikroskopi ile birlikte doku gelişiminin ayrıntıları ve dinamikleri kolayca incelenebilir.
Zebra balığı gelişimini görüntülemede bir zorluk, embriyoların uzunluklarının önemli ölçüde büyümesidir; embriyo yaşamın ilk 3 gün içinde dört kez uzunluğunu uzatır1. Ayrıca, erken embriyo vücut yumuşak, ve büyüme sınırlı ise kolayca deforme olur. Ancak, konfokal mikroskopi yapmak için, embriyo immobilize edilmelidir. Konfokal zaman atlamalı görüntüleme için embriyoları sabit bir pozisyonda tutmak için düzenli olarak anestezi edilir ve %0.3-1 düşük erime li agarose monte edilirler. Bu embriyo hareketlerini kısıtlarken, belirli bir süre için görüntüleme sırasında bazı büyüme için izin avantajı vardır. Embriyonun bazı bölümleri verimli bir şekilde bu şekilde görüntülenebilir. Ancak, uzun süre tüm embriyo görüntüleme için bu yöntem kullanılarak, bozulmalar nedeniyle sınırlı büyüme nedeniyle agarose neden görülür. Bu nedenle, diğer montaj yöntemleri gereklidir. Kaufmann ve arkadaşları hafif levha mikroskopisi için zebra balığı embriyolarının alternatif montaj tarif var, seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi gibi (SPIM), florlu etilen propilen embriyolar embriyolar monte ederek (FEP) agarose veya metilselüloz düşük konsantrasyonlarda içeren tüpler2. Bu teknik zaman içinde embriyogenezin mükemmel bir görselleştirme üretir. Schmid ve ark. bir görüntüleme seansında çeşitli embriyoların görselleştirilmesini sağlayan ışık sayfası mikroskopisi3 için FEB tüplerinde agarose'da altı embriyonun montajını tanımlar. Kalıplar embriyoların daha büyük sayıda verimli montaj için embriyo dizileri oluşturmak için kullanılmıştır4. Masselkink ve ark. farklı aşamalarında zebrabalığı embriyoları yerleştirilebilir silikon dökümleri yapmak için kullanılabilecek 3D baskılı plastik kalıplar inşa etmiş, görüntüleme için sabit bir konumda montaj sağlayan, confocalgörüntülemedahil 5 . 3D baskı da 96-iyiformat6zebra balığı embriyolarının tutarlı konumlandırma için kalıp yapmak için kullanılmıştır. Bazı kalıplar belirli aşamalar için özelleştirilmiştir ve uzun süreler boyunca sınırsız büyümeye izin vermezken, diğer kalıplar daha esnektir. Son zamanlarda, Weijts ve ark. zebrabalığı embriyolarının canlı görüntüleme için dört kuyulu bir çanak tasarım ve imalat yayınlandı7. Bu çanak, kuyruk ve anestezi balık embriyolarının gövde bir cep oluşturmak için bir kapak cam hemen üzerinde bağlı net bir silikon çatı altında manuel olarak yerleştirilir. Embriyo daha sonra % 0.4 agarose ilavesi ile bu pozisyonda sabitlenir. Bu montaj embriyonun yaklaşık 2 mm uzunluğundaki arka kısmının (gövde ve kuyruk) görüntülenmesine olanak sağlar ve her kuyuya 12 embriyo monte edilebildiği için, yöntem birden fazla numunenin görüntülenmesine olanak sağlar. Benzer şekilde, Hirsinger ve Steventon son zamanlarda balık başı agarose monte edildiği bir yöntem sundu, kuyruk serbestçe büyüyebilir iken, ve bu yöntem de verimli embriyo gövde ve kuyruk bölgesinin görüntüleme kolaylaştırır8.
Bu makalede, sınırsız büyüme için izin verirken embriyoların hareketlerini kısıtlayan zebra balığı embriyoları için katmanlı bir montaj yöntemi açıklanmaktadır. Bu montaj yönteminin avantajları, herhangi bir ters mikroskop kullanarak görüntüleme için çeşitli aşamalarda embriyomonte etmek için düşük maliyetli, hızlı ve kolay bir yöntem olmasıdır. Montaj embriyo gelişimi sırasında tüm vücudun uzun süreli görüntüleme izin verir (baş, gövde ve kuyruk). Bu yöntemin kullanılabilirliğini göstermek için transgenik balıklarda tüm embriyo vasküler, nöronal ve kas gelişimi görüntülendi. Seans başına iki embriyo, 3Boyutlu iki dalga boyunda, doku gelişimi filmlerini işlemek için 55 saat üst üste hızlandırılmış mikroskopi ile görüntülendi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom</td>
			<td>MatTek Corporation, MA</td>
			<td>P35GCOL-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Store dissolved solution at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Store dissolved solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 digital microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1S confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS AR Version 4.40</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos

Gelişim dinamikleri, belirli doku veya hücrelerde floresans ifade canlı transgenik zebra balığı embriyolarının konfokal zaman atlamalı mikroskobu ile takip edilebilir. Tüm embriyo gelişimini görüntülemede bir zorluk zebra balığı embriyolarının uzunlukları önemli ölçüde büyümek olduğunu. Düzenli olarak% 0.3-1 düşük erime agarose yapılır monte edildiğinde, agarose yumuşak embriyo vücudunda bozulmalara yol açan, büyüme kısıtlaması uygular. Ancak, konfokal zaman atlamalı mikroskopi yapmak için, embriyo immobilize edilmelidir. Bu makalede, sınırsız büyüme için izin verirken embriyoların hareketliliğini kısıtlayan zebra balığı embriyoları için katmanlı bir montaj yöntemi açıklanmaktadır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır. Bu yöntemin kullanılabilirliğini göstermek için, tüm embriyo vasküler, nöronal ve kas gelişimi transgenik balıklarda 55 saat üst üste görüntülendi. Bu montaj yöntemi kalıp veya özel ekipman gereksinimleri olmadan ters mikroskoplar kullanarak tüm zebra balığı embriyolarının kolay, düşük maliyetli görüntüleme için kullanılabilir.

Montaj yönteminin geliştirilmesi Bu çalışmanın temel amacı, zebra balığı gelişiminin uzun süreler boyunca hızlandırılmış görüntülemesi için düşük maliyetli bir montaj tekniği geliştirmektir. Katmanlı montaj yöntemi kırılgan zebra balığı embriyo vücudunun tam büyümesini sağlamak için geliştirilmiştir, hareketlerini kısıtlarken. 1. tabakanın agarose konsantrasyonu çok yüksekse, embriyolar bozulur ve eğrileşir (Şekil 2). %0.1 v...

Watch this Scientific Journal Video about A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Kırılgan zebra balığı embriyolarının sınırsız büyümesine olanak tanıyan ve aynı zamanda onları tamamen sabit bir konumda tutan hızlandırılmış görüntüleme için bir montaj yöntemi geliştirdik. Bu montaj yöntemi hızlı, kolay ve ucuzdur ve herhangi bir ters mikroskop üzerinde laboratuvar görüntüleme için çalışır. Bu yöntemi canlı zebra balığı embriyolarının görüntülemesi için geliştirdik, ancak diğer küçük su hayvanı modellerinin görüntülenmesi için değiştirilebilir.Yetişkin zebra balıklarını yetiştirerek başlayın. Öğleden sonra, bir-iki erkek-kadın oranı ile üreme tankları içine balık yerleştirin. Sonra embriyo ortamda% 1 düşük erime agarose bir stok çözüm hazırlamak ve bir mikrodalga fırında ısıtarak eritin.Aliquot 1.5 mililitre tüpler içine agarose çözeltisi. Distile suda %4'lük triain bir stok çözeltisi yapın ve agarose ve tricaine'i dört santigrat derecede saklayın. Tricaine toksik tir ve tartılması ve duman kaputunda hazırlanması gerekir.Çiftlaştıktan sonra, E3'teki zebra balığı embriyolarını petri kabında hasat edin ve montajdan önce yaklaşık 28 saat boyunca 26,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Embriyoları %0.02 tricaine ile anestezi altına alayın ve embriyoyu serbest bırakmak için chorion'u yavaşça sürükleyerek ve çekerek mikroskop altında dekorionate. Montajdan hemen önce, agarose çözeltisini 65 santigrat dereceye ısıtın ve embriyonun ısıdan zarar görmemesi için yaklaşık 30 santigrat dereceye soğumasını bekleyin ve agarose çözeltisine tricaine ekleyin.Bir numara sıfır coverglass alt ile 35 milimetre cam alt yemekleri kullanın. Yavaşça bir cam pipet veya mikropipet ile çanak altına doğru onun yanal yanlarından biri ile dechorionated embriyo yerleştirin, sonra dikkatle bir micropipeette ile kalan E3 çıkarın. Embriyoyu kapsayacak şekilde yemeğin altına bağlı kapak camı tarafından oluşturulan küçük kuyuya ilk agarose çözeltisini ekleyin ve agarose'un küçük kuyuyu kapladığından emin olun ama taşmaz.İki coverglasses arasında embriyo ile dar bir agarose dolu alan oluşturmak için bir coverglass ile küçük kuyu kapağı. Örtü camının alt kısmındaki kapak camının üzerine %1'lik agarose çözeltisi yerleştirin ve bu tabaka, kapak camı sağlamlaştırdıkça yerinde tutacaktır. Daha sonra sistemin sulu tutmak için% 0.02 tricaine içeren E3 ile çanak kalan kısmını doldurun.Katman bir için optimal agarose konsantrasyonunu belirlemek için, agarose artan konsantrasyonlarda embriyomonte ve embriyo bozulma ve hareketlilik en aza indiren konsantrasyonu belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek, sonra sonuçlara dayalı konsantrasyonları daha ince bir dizi test. Bu protokolün en kritik adımı birinci katman için agarose'un en uygun konsantrasyonu belirlemektir. Agarose'un %0.030 0.032 gibi farklı nano konsantrasyonlarını test edin.en uygun konsantrasyonu bulmak için. Embriyoların hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirmek için, 28,5 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuvözve 55 saate kadar görüntü içeren bir mikroskop aşaması kullanın. Aynı anda birkaç embriyo görüntü için, birkaç yemekleri tutan bir sahne adaptörü kullanın ve embriyolar yatay konumlandırılmış böylece tek tek yemekleri döndürmek.Düşük büyütme hedefi seçin, sonra göz parçasını kullanarak embriyoları bulmak ve nihayet yemekleri döndürerek yatay olarak hizalayın. Embriyoların konumunu yazılıma kaydedin ve verileri otomatik olarak kaydetmek için bir dosya adı oluşturun. İğne deliği boyutunu, tarayıp hızını, görüntü boyutunu ve yakınlaştırmayı ayarlayın.Ardından, görüntülenecek görüntüleri ve floresan kanalları yakalamak için daha yüksek bir büyütme seçin. Her kanal için lazer gücünü ve dedektör yüksek voltajı ayarlayarak doygunluğu önlerken ve fotoğraf beyazlatmasını sınırlandırırken mümkün olan en iyi dinamik aralığı topladığından emin olun. Daha sonra, 10X hedefi ile tüm embriyo görüntü, görüntüleme çeşitli alanları görüntü lemek ve bu büyük görüntü alanı içinde uygun olduğundan emin olmak için embriyo konumunu ayarlayarak onları bir araya dikiş yazılımdaki büyük görüntü yakalama ayarlarını ayarlayın.Z-yığınlarını yakalama ayarlarını el yazması yönergelere göre yapılandırın. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme sırasında birden fazla embriyonun odak noktasını korumak için, otomatik bir odak kullanın ve her embriyo için ayrı ofset düzeylerini referans düzlemine odaklanacak şekilde ayarlayın. Ardından, mikroskop yazılımındaki hızlandırılmış parametreleri bir saatlik aralıklarla 55 saat süreyle görüntüye ayarlayın.Her döngüde, iki embriyo veri kümesini sırayla yakalayın ve verileri otomatik olarak kaydedin. Görüntüleri işlemek için mikroskop yazılımını kullanın. Birden fazla embriyo görüntülenmişse, görüntülemenin konumuna göre veri kümelerini bölerek her embriyo için bağımsız dosyalar oluşturun.Maksimum yoğunluk projeksiyonları veya benzer bir aracı kullanarak 3B zaman veri kümelerini 2B zaman veri kümelerine dönüştürün. Son olarak, AVI olarak kaydederek ve saniyede beş kare oynatma hızı için 200 milisaniye aralıklarla sıkıştırma seçeneğini seçerek film dosyaları oluşturun. Bu katmanlı montaj yöntemi, zebra balığı embriyolarının büyümesine izin verirken aynı zamanda hareketlerini kısıtlamayı mümkün kılar.Agarose konsantrasyonu çok yüksekse, embriyolar bozulur. Ama çok düşükse, hızlandırılmış mikroskopi sırasında görüş alanının dışına çıkarlar. Optimal agarose konsantrasyonunun 0.028 ile 0.034% arasında olduğu saptandı Canlı transgenik zebrabalığı tüm embriyo ve GFP tüm embriyo ve GFP ifade vaskülatür endotel hücrelerinde 55 saat boyunca intersegemental damar filizlendi, subintestinal ve baş vaskülatür gelişmiş ve gövde uzantısı ile kaudal ven pleksus yoğuşma oluştu.GFP ve motor nöronları ifade eden embriyolar motor nöron gelişimini görselleştirmek için görüntülendi. Motor nöron aksonları embriyonun ventral tarafına doğru somitler üzerinde ventral nöral tüp filiz. Motor nöron aksonların intersegmental damarların konumuna göre dorsal filizlenmesinin birlikte gelişimi daha yüksek bir büyütme kullanılarak görüntülendi.Bu mümkün ventral akson filizlenen ince ayrıntıları yanı sıra nöral tüpten filizlenen dorsal akson görselleştirmek için yaptı. Somit sayıları arttıkça, somitler de uzunluk ve genişlik uzamıştır. Bu süreç kaslarda GFP ifade transgenik embriyolar kullanılarak görüntülendi.Agarose'un optimum konsantrasyonu çok dar olduğundan, agarose çözeltisinin stok çözeltisini hazırlarken ölçümlerdeki küçük farklılıklara karşı çok hassastır ve her yeni agarose çözeltisi için yeniden tanımlanması gerekir. Uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme sırasında fotoğraf toksisitesi ve fotoğraf beyazlatma olasılığını azaltmak ve deneyler arasında tutarlılık sağlamak için görüntü boyutu ve çözünürlüğü, taramalar hızı, yakınlaştırma, dedektör yüksek voltaj ve lazer gücü gibi görüntüleme parametrelerini dikkatle ayarlamak önemlidir. Transgenik zebra balığı embriyoları için bu montaj yöntemini kullanarak tüm organizmanın uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini takip ederek, farklı dokuların birlikte nasıl geliştiğini görselleştirebiliriz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...