Name: pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Projektet blev finansieret af DFG (BE 4570/4-1) til S.B.

Den mikrofluidiske celledyrkning blev udført med kommercielle primære humane navle vene endotheliale celler (HUVEC). Virksomheden isolerede cellerne med informeret samtykke fra donor. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for læger kammer i forbundsstaten Baden-Wuerttemberg med referencenummer 219-04.
Bemærk: Se tabel over materialer til protokol forsyninger.
1. fordyrkning af primære endotelceller
<ol><li>D...

<ol>
	<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+transmission,+colonization+and+invasion.">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li><li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins.">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells.">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li><li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells.">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin(ogen)-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface.">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+plasmin(ogen)-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae.">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix,+dissolution+of+fibrin+and+transmigration.">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li><li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow.">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).</li><li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping.">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li><li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation.">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li><li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease:+Focus+on+acute+coronary+syndromes.">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li><li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells.">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li><li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section.">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li><li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Alb&#225;nez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation.">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li><li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions.">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li><li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues:+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology.">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li><li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip.">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li><li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+Structure,+assembly,+and+cardiovascular+implications.">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li><li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases.">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li><li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2012.+Microfluidic+3D+cell+culture:+potential+application+for+tissue-based+bioassays.">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li><li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions.">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li><li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers.">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li><li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo:+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system.">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li><li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies.">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , (2005).</li><li>Shaw, J. A., Shaw, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).</li><li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+(hpIgR)+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium.">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li><li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism.">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li><li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-cell+patterning+lab+chip:+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue.">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-on-a-chip?+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine.">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li></ol>

Simuleringen af bakteriel interaktion med mekanisnofølsomme værts proteiner som VWF kræver et perfbrugbart cellekultursystem, der muliggør generering af en defineret, ensrettet og kontinuerlig strøm af væsker, hvilket skaber pålidelig forskydningsbelastning . Flere mikrofluidisk pumpesystemer er allerede blevet beskrevet. En omfattende anmeldelse fra Bergmann et al. opsummerer de vigtigste aspekter af forskellige to-og tre-dimensionelle cellekultur modeller17.
De...

Patogenesen af pneumokokker infektioner er karakteriseret ved en mangesidet interaktion med en mangfoldighed af ekstracellulære matrix forbindelser og komponenter i den menneskelige hæmostase, såsom plasminogen og vWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Multi Domain glykoprotein vWF fungerer som nøgle regulator af en balanceret hæmostase ved at mægle trombocyt rekruttering og fibrin inkorporering på stedet for vaskulær trombusdannelse9. Betydningen af funktionel, aktiv VWF til blødningskontrol og sårheling påvises ved von Willebrands sygdom, en almindelig arvelig blødningsforstyrrelse10.
Den globulære vWF cirkulerer i det menneskelige blod system i en koncentration på op til 14,0 μg/ml11,10. Som reaktion på vaskulær skade, den lokale frigivelse af vWF af endotel Weibel Palade organer (WBP) er markant forøget11,12. Tidligere undersøgelser viser, at pneumokokker overholdelse af humane endotelceller og dets produktion af pore dannende toksin pneumolysin i betydelig grad stimulerer luminale vWF sekretionen13. De hydrodynamiske kræfter i blodgennemstrømningen inducerer en strukturel åbning af mekanismens esponsive VWF domæner. Ved strømningshastigheder på 10 dyn/cm2 vWF multimerizes til lange protein strenge på op til flere hundrede mikrometer i længden, der forbliver fastgjort til subendothelium10,12.
For at forstå funktionen af multimeriserede vWF-strenge genereret under forskydnings stress i interaktionen af pneumokokker med endoteloverfladen blev der etableret en mikrofluidic-baseret cellekultur infektion tilgang. Der blev anvendt en mikrofluidic-enhed med et software kontrolleret lufttryk pumpesystem. Dette gav mulighed for en kontinuerlig, ensrettet recirkulation af cellekulturmedium med en defineret strømningshastighed. Derved anvendte systemet en defineret forskydningsbelastning på overfladen af endotelceller, som forblev fastgjort inde i specialiserede kanalrutschebaner. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at simuleringen af forskydnings kraften i blodstrømmen i det menneskelige vaskulære system, hvor VWF-strengene genereres på differentierede endotelceller under definerede konstante strømningsforhold. Til dette formål blev endotelcellerne dyrket i specifikke kanalrutschebaner (Se tabel over materialer), som blev tilpasset til mikroskopiske analyser under gennemstrømningen. Det mikrofluidisk pumpesystem leverede den meget definerede og kontrollerede forskydnings stresssituation, der kræves for dannelsen af udvidede vWF strenge på flydende endotheliale cellelag. Efter stimulering af VWF-sekretion af confluently dyrket humane navle formede vene endotelceller (HUVEC) af histamin tilskud, strengen dannelse blev induceret ved at anvende en shear stress (ԏ) af 10 dyn/cm2. Forskydnings belastningen defineres som den kraft, der handler på cellelaget. Det beregnes omtrent efter Cornish et. al.14 med ligning 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
Hvor ԏ = forskydningsbelastning i dyn/cm2, η = viskositet i (dyn ∙ s)/cm2, h = halvdelen af kanal højden, w = halvdelen af kanalbredden og Φ = flow hastigheds i ml/min.
Resultatet af ligning 1 afhænger af de forskellige højder og bredder på de forskellige anvendte slides (Se tabel over materialer). I dette studie blev der anvendt et luer-kanal udtræk på 0,4 μm, som resulterede i en kammer slide faktor på 131,6 (Se formel 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
Viskositeten af mediet ved 37 °C er 0,0072 dyn ∙ s/cm ², og der blev anvendt en forskydningsbelastning på 10 dyn/cm ². Dette resulterede i en strømningshastighed på 10,5 mL/min (Se formel 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
Her er tilpasningen og fremskridt af en mikrofluidisk celledyrkning procedure ved hjælp af et ensrettet laminar flow system til undersøgelse og visualisering af bakterielle infektions mekanismer i værts vasculaturen beskrevet i detaljer. Generering af VWF strenge på endotellag kan også stimuleres ved hjælp af andre pumpesystemer, der er i stand til at anvende en kontinuerlig og stabil shear stress15.
Efter dyrkning af primære endotelceller til sammenløbet i flow og stimulering af VWF-streng dannelse blev pneumokokker, der udtrykker rødt fluorescens protein (RFP)16 , føjet til endotelcellelag under konstant mikroskopisk kontrol. Tilknytningen af bakterier til VWF strenge på overfladen af endotelceller blev mikroskopisk visualiseret og overvåges i op til tre timer i realtid ved hjælp af VWF-specifikke fluorescerende-mærkede antistoffer. Med denne tilgang, rolle vWF som en vedhæftning cofaktor fremme bakteriel tilknytning til den vaskulære endotelum blev bestemt8.
Ud over den mikroskopiske visualisering af protein sekretion og konformationsmæssige ændringer, denne metode kan bruges til at overvåge enkelte trin af bakteriel infektion processer i realtid og at kvantificere mængden af vedhæftede bakterier på forskellige tidspunkter af Infektion. Det specifikke softwarestyrede pumpesystem giver også mulighed for at kultur de endotelceller i definerede konstante strømningsforhold i op til flere dage og muliggør en defineret pulseret medium flow inkubation. Desuden kan denne metode anvendes ved hjælp af forskellige celletyper. Tilpasning af farvnings protokollen giver også mulighed for påvisning og visualisering af bakterier internaliseret i eukaryote celler.
Dette manuskript beskriver denne avancerede eksperimentelle protokol, der kan bruges som en defineret, pålidelig og reproducerbar tilgang til en effektiv og alsidig karakterisering af patofysiologiske processer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10303002</td>
			<td>with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Luer-syringe</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>9077136</td>
			<td>For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>eBioscience now thermo fisher</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>protease mix used for gentle detachment of endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176751</td>
			<td>no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 &#181;l of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>BD 249210</td>
			<td>complex bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-25G</td>
			<td>solubilized, for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks with filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>392304</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of &#62; 2mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-30</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B06314</td>
			<td>spinning down of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Z 216 MK</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>305.00 V05 - Z 216 M</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3886.2</td>
			<td>used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp for perfusion tubing</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10821</td>
			<td>for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td>incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18 AIC</td>
			<td>for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colombia blood agar plates</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>PA-254005.06</td>
			<td>agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3440</td>
			<td>Comuter with pressure pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3904.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101969</td>
			<td>orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGM supplement Mix</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-39215</td>
			<td>supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 &#181;g / mL heparin, 1 &#181;g / mL Hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGMS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>biochrome now Merck</td>
			<td>S 0415</td>
			<td>supplement for cell culture, used for infection analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8822</td>
			<td>stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic Unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td>fluidic unit for flow cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (porcine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-1890-100g</td>
			<td>for precoating of microslide channel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-7250-10MG</td>
			<td>for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td>
			<td>primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc73268</td>
			<td>stock concentration: 200 &#181;g/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Port</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10820</td>
			<td>for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 35M</td>
			<td>inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td>physically modified slides for fludic cultivation (&#956;&#8211;Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 &#956;l, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td>For preparation of ECGMS medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Pump</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10905</td>
			<td>air pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer cell counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH&#38;Co KG</td>
			<td>40442002</td>
			<td>microscopic counting chamber for HUVECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>for cross linking of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the &#181;-slide L0.4Luer, at 37&#176;C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67,741</td>
			<td>(2 x optic) for OD measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumococcus-specific antiserum</td>
			<td>Pineda</td>
			<td></td>
			<td>raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene or Styrofoam plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>v1.5.4</td>
			<td>Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes 1.5/ 2.0mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706/ 72.695.500</td>
			<td>required for antibody dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes with 50 mL volume</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,48,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP-expressing pneumococci</td>
			<td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td>
			<td>10,319</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipets 5, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.025/ 86.1254.025</td>
			<td>for pipeting larger volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td>for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>P030.2</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Photometer Libra S22</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2115-20</td>
			<td>measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow

Interaktion af Streptococcus pneumoniae med overfladen af endotelceller er medieret i blodgennemstrømning via mekanisk følsomme proteiner såsom von Willebrand Factor (VWF). Dette glykoprotein ændrer sin molekylære konstellation som reaktion på forskydnings stress og udsætter derved bindingssteder for et bredt spektrum af Host-ligand-interaktioner. Generelt er dyrkning af primære endotelceller under en defineret forskydnings strøm kendt for at fremme den specifikke cellulære differentiering og dannelsen af et stabilt og tæt forbundet endotellag, der ligner fysiologien i den indvendige foring af et blodkar . Således kræver den funktionelle analyse af interaktioner mellem bakterielle patogener og værts Vaskulaturen, der involverer mekaniske følsomme proteiner, etablering af pumpesystemer, som kan simulere de fysiologiske strømnings kræfter, som vides at påvirke overfladen af vaskulære celler.
Den mikrofluidiske anordning, der anvendes i dette studie, muliggør kontinuerlig og Pulseless recirkulation af væsker med en defineret strømningshastighed. Det computerstyrede Lufttryks pumpesystem anvender en defineret forskydningsbelastning på endotelcellernes overflader ved at generere et kontinuerligt, envejs og kontrolleret medium flow. Morfologiske ændringer af cellerne og bakteriel fastgørelse kan mikroskopisk overvåges og kvantificeres i flowet ved hjælp af specielle kanal slides, der er designet til mikroskopisk visualisering. I modsætning til statisk cellekultur infektion, som generelt kræver en prøve fiksering forud for immun mærkning og mikroskopiske analyser, de mikrofluidisk dias muliggør både fluorescens-baserede påvisning af proteiner, bakterier, og cellulære komponenter efterprøve fiksering; seriel immunofluorescens farvning; og direkte fluorescens baseret detektion i realtid. I kombination med fluorescerende bakterier og specifikke fluorescens-mærkede antistoffer, denne infektion procedure giver en effektiv flere komponent visualisering system til et stort spektrum af videnskabelige applikationer relateret til vaskulære processer.

Dyrkning primær HUVEC i en konstant ensrettede flow resulterer i dannelsen af en flydende og stramt pakket cellelag, der fremmer generering af cellulære wpbs fyldt med den mekanisosensitive vWF13,14. Denne protokol beskriver brugen af et lufttryk pumpe-baseret, Pulseless recirkulation system til infektion analyse, der kræver efterligne forskydnings stresssituation i den menneskelige blodgennemstrømning.
Dette system muliggør en de...

Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Denne undersøgelse beskriver den mikroskopiske monitorering af pneumokokker-tilslutningen til von Willebrand-faktor strenge, der produceres på overfladen af differentierede humane primære endotelceller under forskydnings stress i definerede strømningsforhold. Denne protokol kan udvides til detaljeret visualisering af specifikke cellestrukturer og kvantificering af bakterier ved anvendelse af differentiale immunofarvnings procedurer.

Pneumococcus infektion af primære humane endotelceller i konstant flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Brugen af denne endotel celle kultur system gør det muligt assimilation af situationen i blodgennemstrømningen. Og med denne situation, kan vi analysere bakteriel infektion processer også herunder identifikation af bakterielle vektorer og også af celle vektorer, der er involveret i denne proces. Denne teknik baner vejen for at undersøge virkningen af bakterielle infektioner på den vaskulære integritet, herunder også virkningen på morfogenese mekanismer, på inflammation reaktioner og immun regulering.Denne teknik kræver nogle særlige håndtering af endotelceller og derfor en visuel beskrivelse er bedre end blot en verbal forklaring. Denne metode giver indsigt i flere andre områder af forskning korreleret med perfunderes vaskulære systemer såsom endotel celle differentiering, sårheling, tumor genesis og angiogenese. Et af de vigtigste trin er standardiseret celledyrkning samt nøjagtig håndtering af primære endotelceller.Denne teknik kræver nogle særlige celle kultur håndtering, som ikke kunne være klar ved blot verbal forklaring. Til at begynde, arbejde i et sterilt miljø ved hjælp af en ren bænk. Brug en pipette til at injicere 100 mikroliter af en 2% steril filtreret svinegel gelatine PBS opløsning i en enkelt reservoir af en temperatur ækvilibrated kanal dias.Placer gelatine-belagt kanal dias på en tynd polystyren eller styrofoam plade for at forhindre et fald i glidetemperaturen med en en milliliter Luer sprøjte til at tilføje 100 mikroliter af de fire gange 10 til den femte per milliliter HUVEC suspension i diaset til frø og dyrke HUVEC. Inkuber kanalslide med HUVEC i 60 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Derefter fyldes hvert medium reservoir i begge ender af kanalslide med 60 mikroliter AF ECGMS medium.Inkubere i en time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Dernæst for at justere den mikrofluidiske pumpe, skal du først tilslutte det ekvilibrerede perfusionssæt til pumpeenheden, fylde med 13,6 milliliter ECGMS-mediet og starte pumpestyringssoftwaren. I menuen i den flydende enhed setup, skal du vælge passende perfusion sæt og type kammer dias ved hjælp af rulle ned vinduer.Vælg 0,007 dyne sekund per kvadratcentimeter i softwaren for medium viskositet. Uden for rugemaskinen skal en glasflaske, der er fyldt med tørrende silicaperler, forbindes med lufttryksslangen. Vælg flowparametre i softwaremenuen, indstil trykket til 40 millibar, og skyl pumperørene med væskemediet ved at starte det kontinuerlige mediumflow.Vi sikrer en stram celletilbehør ved hjælp af subkonfluentedvoksede HUVEC'er og fokuserer desuden på at få luftbobler ud af systemet samt ved hjælp af uafhængig strømforsyning til pumpesystemet. Tryk på slangeforbindelserne for at fjerne luftbobler og sørg for, at der ikke cirkulerer luftbobler i pumpesystemet. For tilslutning af kanalslidet skal du stoppe strømcirkulationen i pumpekontrolsoftwaren og holde mediumstrømmen og perfusionsslangen nede ved at fastspænde rørene nær Luer-forbindelsen.Tilslut kanalslidet og undgå luftbobler. I pumpen kontrol software avanceret fane, bruge software værktøj cyklus skaberen til at programmere den ønskede forskydning stress cykler til flow dyrkning. Program forskydning stressniveauer for flow omsætning og starte langsigtede perfusion.Start med fem dyne per kvadratcentimeter, hvilket svarer til en strømningshastighed på 5,44 milliliter i minuttet i 30 minutter efterfulgt af kontinuerlig strømning ved forskydningsbelastning på 10 dyne per kvadratcentimeter, hvilket svarer til en strømningshastighed på 10,85 milliliter pr. minut. Kontrol afbalanceret reservoir pumpning. Placer den flydende enhed med den tilsluttede kanalslide i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid.Start styringen af mikroskopsoftwaren, og juster principindstillingerne for fluorescensmikroskopisk overvågning ved at vælge de relevante filterindstillinger. For mikroskopisk visualisering skal den flydende enhed placeres i 37 grader Celsius varmekammer. Placer kanalrutsjebanen på scenen af et forvarmet mikroskop.Kontroller cellemorfologien og HUVEC-lagets integritet før injektion af histamin og bakterier i strømcirkulationen. Vedligehold flowindstillingen. Udkald frigivelsen af VWF fra endotelbare spiselige Palade-kroppe ved at indsprøjte 136 mikroliter af en 100 millimolar histaminbestandopløsning gennem en injektionsport i ECGMS-mediet, der cirkulerer i perfusionslangen.Ved immunfluorescensdetektion af flermerteDE VWF-strenge skal der injiceres 20 mikrogram af et VWF-specifikt FITC-konjugeret antistof i et volumen på 200 mikroliter PBS i det cirkulerende 13,6 milliliter ECGMS-medium. For at kvantificere pneumokoktilbehøret på VWF-strengene, der genereres på HUVEC-celleoverflader, skal der injiceres 1,35 gange 10 til ottende CFU pr. milliliter RFP, der udtrykker Pneumococci i et maksimalt volumen på en milliliter i ECGMS-mediet ved hjælp af injektionsporten. Vælg en 63X olie nedsænkning mål for mikroskop forstørrelse og justere fluorescens filter indstillinger i mikroskop software til RFP kanal med en 540 nanometer detektion filter til påvisning af RFP udtrykke Pneumococci.Ved kvantificering af bakteriel fastgørelse til VWF-strengene skal du oprette snapshots af Z-stakke med mindst 30 repræsentative feltvisninger, der hver indeholder ca. 10 morfologisk intakt HUVEC, og tælle mængden af Pneumococci. For at evaluere bakteriel fastgørelse efter fiksering før immunfluorescerende farvning skal du stoppe strømmen, fjerne 10 milliliter ECGMS-medium fra pumpereservoirerne og tilsætte 10 milliliter PBS suppleret med 5 % paraformaldehyd og fortsætte i henhold til manuskriptet. I denne protokol begynder de eksperimentelle principtrin med en fordyrkning af primære endotelceller til subconfluency i cellekulturkolber.Celler er derefter seedet i en gelatine-belagt kanal dias. Bakterier dyrkes på agar plader efterfulgt af dyrkning i en kompleks flydende medium til midten log fase. For mikrofluidisk cellekultur er en kanalrutsjebane med endotelceller forbundet med perfusionsrørene i en flydende enhed i pumpesystemet og udsat for konstant flow for celledifferentiering.Generationen af VWF-strengene blev fremkaldt af histamininjektion ved en forskydningsstress på 10 dyne sekund pr. kvadratcentimeter og mikroskopisk overvåget ved immunfluorescensdetektering ved hjælp af FITC-mærkede VWF-specifikke antistoffer. Efter injektion af rødt fluorescensprotein, der udtrykker bakterier til det cirkulerende medium, blev Pneumokokkertilbehør til VWF-strengene mikroskopisk visualiseret i realtid ved fluorescensemission ved 450 nanometer. Efter fiksering af cellerne ved hjælp af PFA, differentialimmunfluorescens farvning giver visualisering af bakteriel fastgørelse på specifikke infektion tidspunkter.Det vigtigste trin i denne procedure er at sikre en stram celle fastgørelse på diasoverfladen ved at justere fysiologiske forskydning stressniveauer og undgå ekstreme pumpetryk udsving. Ud over den mikroskopiske visualisering, denne teknik kan anvendes til at studere farmakologiske virkninger af nye anti-infektiøs og også til at analysere langsigtede konsekvenser af de vaskulære infektion processer. Dette pumpesystem gennemsyrer bakterielle patogener ved lufttryk for at forhindre enhver transmission via aerosoler.Det anbefales at følge biosikkerhedsforanstaltningerne.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg af Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering af Humane navlevene-endotelceller og deres anvendelse i undersøgelsen af ​​neutrofil transmigration Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Lille RNA transfektion i primære humane Th17 Celler af Next Generation Elektroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøjelsen af Murine leveren en Flow Cytometric analyse af lymfatisk Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...