Name: pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

הפרויקט מומן על ידי DFG (להיות 4570/4-1) כדי S.B.

הטיפוח-תרגול של התאים המיקרופלואידיג התבצע עם תאי הטבור העיקריים של העורק האנושי הראשי (HUVEC). החברה מבודדת את התאים עם הסכמה מושכלת של התורם. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הלשכה הרופאים של המדינה הפדרלית באדן-Wuerttemberg עם מספר הסימוכין 219-04.
הערה: ראה טבלת חומרי...

<ol>
	<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+transmission,+colonization+and+invasion.">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li><li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins.">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells.">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li><li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells.">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin(ogen)-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface.">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+plasmin(ogen)-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae.">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix,+dissolution+of+fibrin+and+transmigration.">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li><li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow.">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).</li><li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping.">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li><li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation.">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li><li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease:+Focus+on+acute+coronary+syndromes.">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li><li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells.">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li><li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section.">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li><li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Alb&#225;nez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation.">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li><li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions.">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li><li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues:+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology.">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li><li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip.">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li><li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+Structure,+assembly,+and+cardiovascular+implications.">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li><li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases.">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li><li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2012.+Microfluidic+3D+cell+culture:+potential+application+for+tissue-based+bioassays.">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li><li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions.">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li><li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers.">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li><li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo:+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system.">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li><li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies.">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , (2005).</li><li>Shaw, J. A., Shaw, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).</li><li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+(hpIgR)+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium.">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li><li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism.">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li><li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-cell+patterning+lab+chip:+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue.">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-on-a-chip?+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine.">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li></ol>

הדמיה של אינטראקציה חיידקית עם חלבונים מארחים רגישים מכונאי כגון VWF דורש מערכת התרבות התא המכונה המאפשרת את הדור של זרימה מוגדרת, חד כיווני, רציפה של נוזלים, ובכך לייצר מאמץ הטיה אמין . כמה מערכות משאבות מיקרופלואידיסי כבר תוארו. סקירה מקיפה של ברגמן ואח ' מסכמת את ההיבטים המרכזיים של מודלי?...

הפתוגנזה של זיהומים פנאומטי מאופיין באינטראקציה רבת-פנים עם מגוון של תרכובות מטריצות ורכיבים של המטאוסטזיס האנושי, כגון פלמיננוגן ו vwf1,2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה רב התחומים גליקופרוטאין VWF משמש כרגולטור מפתח של הומוסטאזיס מאוזנת על ידי גיוס thrombocyte מדיה ו התאגדות פיאין באתר של היווצרות כלי דם הטרובוס9. החשיבות של הפונקציונלי, VWF פעיל עבור שליטה דימום וריפוי הפצע הוא הפגינו על ידי המחלה של פון Willebrand, הפרעת דימום משותף הפרעה10.
כדורי vwf מסחררת במערכת הדם האנושי בריכוז של עד 14.0 μg/mL11,10. בתגובה לפציעה וסקולרית, שחרורו המקומי של vwf על ידי הגופים האלה של weibel palade (wbp) גדל במידה ניכרת11,12. מחקרים קודמים מראים כי הדבקות האנטי-קוקוס לתאי האנדותל של האדם והייצור של הנקבוביות היוצרות משאבה משמעותית מעוררת באופן משמעותי את הפרשת הלומיאל (VWF)13. הכוחות ההידרודינמיים של זרימת הדם גורמים לפתיחת מבנה של תחומים VWF מכנימים. בקצב זרימה של 10 דינמיקה/ס"מ2 vwf multimerizes למחרוזות חלבון ארוך של עד כמה מיקרומטר באורך הנותרים מחוברים subאנדותל10,12.
כדי להבין את הפונקציה של מחרוזות VWF מולטימzed שנוצר תחת לחץ הטיה באינטראקציה של אבקת הקוקוס עם משטח אנדותל, מבוססי microfluidic מבוסס תרבות התא הגישה זיהום הוקמה. התקן מיקרופלואידיג עם מערכת משאבת הלחץ על התוכנה בקרת האוויר שימש. פעולה זו איפשרה הפעלת מבנה חד-כיווני ורציף של מדיום תרבות התא עם קצב זרימה מוגדר. ובכך, המערכת החלה להדגיש הטיה מוגדרת על פני השטח של תאים אנדותל, אשר נשאר מחובר בתוך שקופיות הערוץ המקצועית. גישה זו אפשרה את הסימולציה של כוח ההטיה בתוך זרם הדם של מערכת כלי הדם של האדם, שבו מחרוזות VWF מופקים על תאים אנדותל מובחנים בתנאי זרימה קבועים מוגדרים. לצורך זה, תאי האנדותל מעובדים בשקופיות מסוימות של ערוצים (ראו טבלת חומרים), שהותאמה לניתוחים מיקרוסקופיים במהלך הזרימה. מערכת המשאבה microflu, מספק את המצב מאוד מוגדר ומבוקר לחץ להטות הנדרש עבור היווצרות של מחרוזות VWF המורחבת על שכבת התאים שוטפת של הרשת. לאחר הגירוי של VWF-הפרשה של האדם בוגר הטבור וריד בתאי הטבורי (HUVEC) על ידי תוספי היסטמין, היווצרות מחרוזת המושרה על ידי החלת מתח הטיה (ԏ) של 10 דינמיקה/cm2. לחץ ההטיה מוגדר ככוח הפועל על שכבת התא. הוא מחושב בקירוב על פי הקורנית. אל14 עם משוואה 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
כאשר ԏ = להטות את המתח בדינמיקה/cm2, η = צמיגות ב (דינמיקה ∙ s)/cm2, h = מחצית גובה הערוץ, w = חצי רוחב הערוץ, ו Φ = שיעור flowrate-mL/min.
התוצאה של משוואה 1 תלויה בגבהים וברוחב השונים של השקופיות השונות המשמשות (ראה טבלת חומרים). במחקר זה שקופית ערוץ luer של 0.4 יקרומטר והתוצאה היא גורם שקופית קאמרית של 131.6 שימש (ראה נוסחה 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
צמיגות של המדיום ב 37 ° c הוא 0.0072 דינמיקה ∙ s/cm ² ו להטות את הלחץ של 10 דינמיקה/cm ² שימש. זה הביא לקצב הזרימה של 10.5 mL/min (ראה פורמולה 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
כאן, הסתגלות וקידום של הליך מיקרופלואידיג תא culturing באמצעות מערכת זרימה חד-כיוונית למינארי עבור החקירה ויזואליזציה של מנגנוני זיהום חיידקי בתוך המארח המארחים מתואר בפירוט. הדור של מחרוזות VWF על שכבות אנדותל יכול להיות גם מגורה באמצעות מערכות משאבה אחרות, כי הם מסוגלים להחיל לחץ מתמשך ויציב להטות15.
לאחר הטיפוח של תאי האנדותל הראשוניים למפגש בזרימה וגירוי של היווצרות מחרוזות VWF, הבעת הופעת חלבון פלואורסצנט אדום (RFP)16 נוספו לשכבת התא האנדותל תחת שליטה מיקרוסקופית מתמדת. ההחזקה של חיידקים כדי vwf מחרוזות על פני השטח של תאים אנדותל היה מאכל דמיין והפיקוח עד שלוש שעות בזמן אמת על ידי שימוש ב-vwf ספציפי נוגדנים מתויג-פלורסנט. עם גישה זו, התפקיד של VWF כמו קופקטור הדבקה לקידום ההחזקה החיידקית של כלי הדם אנדותל היה נחוש8.
בנוסף להדמיה המיקרוסקופית של הפרשת החלבון והשינויים השונים, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לפקח על צעדים בודדים של תהליכי זיהום חיידקי בזמן אמת, כדי לכמת את כמות החיידקים המצורפים בנקודות זמן שונות של זיהום. מערכת ספציפית מבוקרת תוכנה מספקת גם את האפשרות לתרבות התאים האנדותל בתנאי זרימה קבועה מוגדר למשך עד מספר ימים ומאפשר הדגירה פעמו זרימה בינונית. כמו-כן, ניתן להחיל שיטה זו באמצעות סוגי תאים שונים. התאמת פרוטוקול הצביעת גם מאפשרת איתור והדמיה של חיידקים הפנימו לתוך תאים איקריוטית.
כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הניסיוני המתקדם שניתן להשתמש בו כגישה מוגדרת, אמינה וניתנת ליישום לאפיון יעיל ותכליתי של תהליכים פתופסלוגיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10303002</td>
			<td>with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Luer-syringe</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>9077136</td>
			<td>For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>eBioscience now thermo fisher</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>protease mix used for gentle detachment of endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176751</td>
			<td>no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 &#181;l of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>BD 249210</td>
			<td>complex bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-25G</td>
			<td>solubilized, for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks with filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>392304</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of &#62; 2mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-30</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B06314</td>
			<td>spinning down of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Z 216 MK</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>305.00 V05 - Z 216 M</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3886.2</td>
			<td>used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp for perfusion tubing</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10821</td>
			<td>for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td>incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18 AIC</td>
			<td>for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colombia blood agar plates</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>PA-254005.06</td>
			<td>agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3440</td>
			<td>Comuter with pressure pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3904.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101969</td>
			<td>orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGM supplement Mix</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-39215</td>
			<td>supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 &#181;g / mL heparin, 1 &#181;g / mL Hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGMS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>biochrome now Merck</td>
			<td>S 0415</td>
			<td>supplement for cell culture, used for infection analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8822</td>
			<td>stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic Unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td>fluidic unit for flow cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (porcine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-1890-100g</td>
			<td>for precoating of microslide channel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-7250-10MG</td>
			<td>for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td>
			<td>primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc73268</td>
			<td>stock concentration: 200 &#181;g/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Port</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10820</td>
			<td>for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 35M</td>
			<td>inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td>physically modified slides for fludic cultivation (&#956;&#8211;Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 &#956;l, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td>For preparation of ECGMS medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Pump</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10905</td>
			<td>air pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer cell counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH&#38;Co KG</td>
			<td>40442002</td>
			<td>microscopic counting chamber for HUVECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>for cross linking of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the &#181;-slide L0.4Luer, at 37&#176;C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67,741</td>
			<td>(2 x optic) for OD measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumococcus-specific antiserum</td>
			<td>Pineda</td>
			<td></td>
			<td>raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene or Styrofoam plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>v1.5.4</td>
			<td>Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes 1.5/ 2.0mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706/ 72.695.500</td>
			<td>required for antibody dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes with 50 mL volume</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,48,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP-expressing pneumococci</td>
			<td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td>
			<td>10,319</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipets 5, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.025/ 86.1254.025</td>
			<td>for pipeting larger volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td>for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>P030.2</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Photometer Libra S22</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2115-20</td>
			<td>measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow

אינטראקציה של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס עם פני השטח של תאים אנדותל מתווך בזרימת הדם באמצעות חלבונים מכניביים מרכיב כגון מקדם וויללמותג פון (vwf). גליקופרוטאין זה משנה את המבנה המולקולרי שלה בתגובה למתח ההטיה, ובכך חושף אתרי כריכה לקשת רחבה של מארחים ואינטראקציות. באופן כללי, הקפדה על תאי האנדותל הראשוניים תחת זרימת הטיה מוגדרת לקדם את הבידול התאי המסוים ואת היווצרות של שכבת אנדותל יציבה ומקושרת היטב הדומה לפיזיולוגיה של הציפוי הפנימי של כלי הדם . לפיכך, ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פתוגנים חיידקיים לבין הפונדקאי המארח מעורבים חלבונים מכנימים רגישים דורש הקמת מערכות משאבה שיכולות לדמות את כוחות הזרימה הפיסיולוגיים הידועים להשפיע על פני השטח של תאי כלי הדם.
המכשיר המיקרו-פלואידיג המשמש במחקר זה מאפשר הפעלה מתמשכת ורציפה של נוזלים עם קצב זרימה מוגדר. מערכת משאבת לחץ האוויר מבוקרת המחשב מחיל לחץ הטיה מוגדר על משטחי תא אנדותל על ידי יצירת זרימה רציפה, חד כיווני, בינונית ומבוקרת. שינויים מורפולוגיים של התאים והקבצים המצורפים החיידקיים יכולים להיות מנוטרים באופן מיקרוסקופי ולכמת בזרימה באמצעות שקופיות ערוץ מיוחדות המיועדות להדמיה מיקרוסקופית. בניגוד לזיהום התרבות התא סטטי, אשר באופן כללי דורש קיבעון לדוגמה לפני תיוג החיסונית ניתוחים מיקרוסקופיים, שקופיות microflu, מאפשר הן איתור מבוססי-פלואורסצנטית של חלבונים, חיידקים, ורכיבים סלולריים לאחר קיבעון דגימה; כתמים מוחיסורתיים; וגילוי מבוסס-פלואורסצנטית ישיר בזמן אמת. בשילוב עם חיידקים פלורסנט ונוגדנים ספציפיים המסומנים בקרינה פלואורסצנטית, זה הליך זיהום מספק מערכת יעילה מרובת רכיבים מרובים עבור ספקטרום עצום של יישומים מדעיים הקשורים תהליכים כלי דם.

Culturing הראשי huvec בזרימה חד כיווני מתמדת היווצרות שכבת התאים הקשורים וגדוש בחוזקה המקדם את הדור של wpbs הסלולר ממולא vwf המכונה הרגיש13,14. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת המבוססת על לחץ אוויר מבוסס על משאבה, לניתוח זיהום המחייב לחקות את המצב לחץ ההטיה בזרימת הדם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

השימוש במערכת תרבות תאים אנדותל זה מאפשר הטמעה של המצב בזרימת הדם. ועם מצב זה, אנו יכולים לנתח תהליכי זיהום חיידקיים כולל גם זיהוי של וקטורים חיידקיים וגם של וקטורים התא המעורבים בתהליך זה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקור את ההשפעה של זיהומים חיידקיים על שלמות כלי הדם, כולל גם את ההשפעה על מנגנוני מורפוגנזה, על תגובות דלקת ורגולציה חיסונית.טכניקה זו דורשת טיפול מיוחד בתאי ה אנדותל ולכן תיאור חזותי עדיף מאשר רק הסבר מילולי. שיטה זו מספקת תובנות על מספר תחומי מחקר אחרים המתואמים עם מערכות כלי דם מחושלות כגון דיפרנציאלי של תאי אנדותל, ריפוי פצעים, בראשית הגידול ואנגיוגנזה. אחד השלבים העיקריים הוא טיפוח תאים מתוקקנים, כמו גם טיפול מדויק בתאי אנדותל ראשוניים.טכניקה זו דורשת טיפול מיוחד בתרבות התאים אשר לא יכול להיות ברור רק על ידי הסבר מילולי. כדי להתחיל, לעבוד בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. השתמש בפיגט כדי להזריק 100 מיקרוליטרים של פתרון PBS ג'לטין חזירי מסונן 2%2%למאגר יחיד של שקופית ערוץ עם שיווי משקל טמפרטורה.מניחים את השקופית ערוץ מצופה ג'לטין על צלחת פוליסטירן דק או קלקר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת השקופית עם מזרק לור מיליליטר אחד להוסיף 100 microliters של ארבע פעמים 10 כדי החמישי לכל מיליליטר HUVEC השעיה לתוך השקופית כדי לזרוע ולטפח את HUVEC. הדגירה את השקופית ערוץ עם HUVEC במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, מלאו כל מאגר בינוני בשני קצות שקופית הערוץ ב-60 מיקרוליטרים של מדיום ECGMS.דגירה עוד שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, כדי להתאים את המשאבה microfluidic, תחילה לחבר את ערכת חליטה שיווי משקל ליחידת המשאבה, למלא עם 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS ולהתחיל את תוכנת בקרת המשאבה. בתפריט של הגדרת היחידה הנוזלית, בחר את ערכת הזלבולות ההולמת ואת סוג השקופית הקאמרית באמצעות החלונות המגוללים למטה.בחר 0.007 dyne השני לסנטימטר מרובע בתוכנה עבור צמיגות בינונית. מחוץ לאנקובטור, חברו בקבוק זכוכית מלא גם צנרת לחץ אוויר. בחר פרמטרי זרימה בתפריט התוכנה, הגדר את הלחץ ל-40 מיליבאר ושטף את צינורות המשאבה עם המדיום הנוזלי על-ידי הפעלת הזרימה הבינונית הרציפה.אנו מבטיחים חיבור הדוק לתא באמצעות HUVECs הגדלים בתת-מודע ומתמקדים בנוסף בהצאת בועות אוויר מהמערכת, כמו גם שימוש באספקת חשמל עצמאית עבור מערכת המשאבה. הקש על חיבורי הצינורות כדי להסיר בועות אוויר ולוודא כי אין בועות אוויר במחזור במערכת המשאבה. לחיבור שקופית הערוץ, עצרו את זרימת הזרימה בתוכנת בקרת המשאבה והחזיקו את הזרימה הבינונית ואת צינורות הזיעת על ידי הידוק הצינורות ליד חיבור לור.חבר את שקופית הערוץ ובכך הימנעות בועות אוויר. בכרטיסייה המתקדמת של תוכנת בקרת המשאבה, השתמש ביוצר מחזור כלי התוכנה כדי לתכנת את מחזורי הלחץ הרצויים להגזמה לטיפוח זרימה. לתכנת את רמות הלחץ הגזירה למחזור הזרימה ולהתחיל תפוצה לטווח ארוך.התחל עם חמישה dyne לסנטימטר מרובע אשר מתאים קצב זרימה של 5.44 מיליליטר לדקה במשך 30 דקות ואחריו זרימה רציפה בלחץ הגזרה של 10 dyne לסנטימטר מרובע אשר מתאים קצב זרימה 10.85 מיליליטר לדקה. בקרת שאיבת מאגר מאוזנת. מניחים את היחידה הנוזלית עם החלקת התעלה המחוברת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.הפעל את בקרת תוכנת המיקרוסקופ והתאם את הגדרות העיקרון עבור הניטור המיקרוסקופי הפלואורסצנטי על-ידי בחירת הגדרות המסנן המתאימות. להדמיה מיקרוסקופית, מניחים את היחידה הנוזלית בתא החימום של 37 מעלות צלזיוס. מקם את שקופית הערוץ על הבמה של מיקרוסקופ טרום המלחמה.לשלוט על מורפולוגיה התא ואת השלמות של שכבת HUVEC לפני הזרקת היסטמין וחיידקים למחזור הזרימה. שמור על הגדרת הזרימה. לגרום לשחרורו של VWF מגופי Palade קיימא אנדותל על ידי הזרקת 136 microliters של פתרון מלאי היסטמין 100 מילימולר באמצעות יציאת הזרקה לתוך המדיום ECGMS במחזור צינורות זלוף.לגילוי immunofluorescence של מחרוזות VWF רב-תכליתיות, להזריק 20 מיקרוגרם של נוגדן FITC ספציפי FITC נדיד בנפח של 200 microliters של PBS לתוך במחזור 13.6 מיליליטר של מדיום ECGMS. כדי לכמת קובץ מצורף Pneumococcal מחרוזות VWF שנוצר על משטחי תא HUVEC, להזריק 1.35 פעמים 10 ל CFU השמיני לכל RFP מיליליטר מבטא Pneumococci בנפח מרבי של מיליליטר אחד לתוך המדיום ECGMS באמצעות יציאת ההזרקה. בחר יעד טבילת שמן 63X להגדלת מיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות מסנן הפלואורסצנטיות בתוכנת המיקרוסקופ לערוץ RFP עם מסנן זיהוי ננומטר 540 לזיהוי RFP המבטא Pneumococci.לכימות של קובץ מצורף חיידקי מחרוזות VWF, צור תמונות של ערימות Z של לפחות 30 תצוגות שדה מייצגות שכל אחת מהן מכילה כ- 10 HUVEC שלמים מורפולוגית וספירת כמות ה- Pneumococci. כדי להעריך את ההחזקה החיידקית לאחר הקיבעון לפני כתמי immunofluorescent, לעצור את הזרימה, להסיר 10 מיליליטר של מדיום ECGMS ממאגרים המשאבה, ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS בתוספת 5% paraformaldehyde ולהמשיך על פי כתב היד. בפרוטוקול זה, הצעדים הניסיוניים העיקריים מתחילים בטיפוח מראש של תאי אנדותל ראשוניים לתת-תצורה בבקבוקי תרבות התאים.לאחר מכן נזרעים תאים לשקופית ערוץ מצופה ג'לטין. חיידקים גדלים על צלחות אגר ואחריו טיפוח בשלב בינוני עד בינוני נוזלי מורכב. עבור תרבות תאים microfluidic, שקופית ערוץ עם תאים אנדותל מחובר צינורות זלוב של יחידה נוזלית של מערכת המשאבה נתון זרימה מתמדת עבור התמדות התא.הדור של מחרוזות VWF היה המושרה על ידי הזרקת היסטמין בלחץ גזיר של 10 dyne השני לסנטימטר מרובע ומנוטר מיקרוסקופית על ידי זיהוי immunofluorescence באמצעות נוגדנים ספציפיים VWF שכותרתו FITC. לאחר הזרקה של חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא חיידקים למדיום במחזור, Pneumococcus מצורף מחרוזות VWF היה חזותי מיקרוסקופי בזמן אמת על ידי פליטת פלואורסצנטיות ב 450 ננומטר. לאחר קיבעון של התאים באמצעות PFA, כתמי immunofluorescence דיפרנציאלי מספק הדמיה של התקשרות חיידקית בנקודות זמן זיהום ספציפיות.השלב החשוב ביותר בהליך זה הוא להבטיח חיבור תא הדוק על משטח השקופית על ידי התאמת רמות הלחץ הפיזיולוגיות של ההמהר והימנעות מתנודות קיצוניות בלחץ המשאבה. בנוסף להדמיה המיקרוסקופית, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד השפעות פרמקולוגיות של אנטי זיהומיות חדשות וגם לנתח את ההשלכות ארוכות הטווח של תהליכי זיהום כלי הדם. מערכת משאבה זו מזיפה פתוגנים חיידקיים על ידי לחץ אוויר כדי למנוע כל שידור באמצעות אירוסולים.מומלץ לעקוב אחר אמצעי הזהירות הביו-בטיחותיים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...