Name: pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Il progetto è stato finanziato dal DFG (BE 4570/4-1) a S.B.

La coltivazione delle cellule microfluidiche è stata eseguita con cellule endoteliali otiliarie primarie commerciali (HUVEC). L'azienda ha isolato le cellule con il consenso informato del donatore. Questo studio è stato approvato dalla Camera etica dei medici del Baden-Wuerttemberg dello Stato federale con il numero di referenza 219-04.
 NOT:</</c0> Vedere Tabella dei materiali per le forniture di protocollo.
1. Precoltivazione dell...

<ol>
	<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+transmission,+colonization+and+invasion.">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li><li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins.">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells.">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li><li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells.">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin(ogen)-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface.">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+plasmin(ogen)-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae.">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix,+dissolution+of+fibrin+and+transmigration.">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li><li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow.">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).</li><li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping.">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li><li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation.">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li><li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease:+Focus+on+acute+coronary+syndromes.">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li><li>Springer, T. 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L., Mewburn, J., Alb&#225;nez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation.">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li><li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions.">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li><li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues:+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology.">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li><li>Harrison, D. 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Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li><li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions.">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li><li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers.">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li><li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo:+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system.">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li><li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies.">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li><li>Freshney, R. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-cell+patterning+lab+chip:+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue.">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-on-a-chip?+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine.">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li></ol>

La simulazione dell'interazione batterica con proteine ospiti meccanosensibili come VWF richiede un sistema di coltura cellulare perffubile che consente la generazione di un flusso definito, unidirezionale e continuo di liquidi, generando così uno stress di taglio affidabile . Sono già stati descritti diversi sistemi di pompe microfluidiche. Una revisione completa di Bergmann et al. riassume gli aspetti chiave dei diversi modelli di coltura cellulare bidimensionali e tridimensionali17.
<p cl...

La patogenesi delle infezioni da pneumococco è caratterizzata da un'interazione sfaccettata con una diversità di composti di matrice extracellulare e componenti dell'emostasi umana, come plasminogen e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. La VWF glicoproteina multidominio funge da regolatore chiave di un'emostasi bilanciata mediando il reclutamento di trombociti e l'incorporazione di fibrina nel sito di formazione di trombosi vascolare9. L'importanza del VWF funzionale e attivo per il controllo delle emorragie e la guarigione delle ferite è dimostrata dalla malattia di von Willebrand, un comune disturbo ereditario del sanguinamento10.
Il VWF globulare circola nel sistema sanguigno umano ad una concentrazione fino a 14,0 g/mL11,10. In risposta alle lesioni vascolari, il rilascio locale di VWF da parte di Weibel Palade Bodies (WBP) endoteliale è notevolmente aumentatodi 11,12. Studi precedenti dimostrano che l'aderenza allo pneumococco alle cellule endoteliali umane e la sua produzione della pneumolysin tossina che formano i pori stimola noannamente la secrezione VWF luminale13. Le forze idrodinamiche del flusso sanguigno inducono un'apertura strutturale dei domini VWF meccanorenti. Con una portata di 10 dyn/cm2 il VWF si multimerisce a lunghe stringhe proteiche fino a diverse centinaia di micrometri di lunghezza che rimangono attaccate al subendotelio10,12.
Per comprendere la funzione delle stringhe VWF multimeriche generate sotto stress da taglio nell'interazione dello pneumococco con la superficie endoteliale, è stato stabilito un approccio di infezione da coltura cellulare basato su microfluidica. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico con un sistema di pompa a pressione dell'aria controllato dal software. Ciò ha permesso un continuo, unidirezionale ricircolo del mezzo di coltura cellulare con una portata definita. Di conseguenza, il sistema ha applicato una sollecitazione di taglio definita sulla superficie delle cellule endoteliali, che sono rimaste attaccate all'interno di vetrini di canale specializzati. Questo approccio ha permesso la simulazione della forza di taglio all'interno del flusso sanguigno del sistema vascolare umano, in cui le stringhe VWF vengono generate su cellule endoteliali differenziate in condizioni di flusso costante definite. A tale scopo, le cellule endoteliali sono state coltivate in specifici vetrini di canale (vedi Tabella dei materiali), che sono stati adattati per analisi microscopiche durante il flusso. Il sistema di pompaggio microfluidico ha fornito la situazione di sollecitazione di taglio altamente definita e controllata necessaria per la formazione di corde VWF estese sullo strato di cellule endoteliali confluenti. Dopo la stimolazione della secrezione di VWF delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) coltivate confluentemente dal completamento dell'istamina, la formazione delle corde è stata indotta applicando uno stress da taglio di 10 disiniettorio2. La sollecitazione di taglio è definita come la forza che agisce sul livello della cella. Viene calcolato approssimativamente secondo Cornish et. al.14 con l'equazione 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
Dove , e lo stress da taglio in dyn/cm2, la viscosità (dyn s)/cm2, h , la metà dell'altezza del canale, la larghezza del canale e la metà della larghezza del canale e la linea di flusso in mL/min.
Il risultato dell'equazione 1 dipende dalle diverse altezze e larghezze delle diverse diapositive utilizzate (vedere Tabella dei materiali). In questo studio è stata utilizzata una diapositiva di canale Luer di 0,4 m risultante in un fattore di scorrimento della camera di 131,6 (vedere la formula 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
La viscosità del mezzo a 37 gradi centigradi è 0,0072 dynos/cm2 ed è stata utilizzata una sollecitazione di taglio di 10 dini/cm2. Ciò ha comportato una portata di 10,5 mL/min (vedi formula 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
Qui, l'adattamento e l'avanzamento di una procedura di coltura cellulare microfluidica utilizzando un sistema di flusso laminare unidirezionale per l'indagine e la visualizzazione dei meccanismi di infezione batterica nella vascolatura ospite è descritto in dettaglio. La generazione di stringhe VWF su strati endoteliali può essere stimolata anche utilizzando altri sistemi di pompaggio in grado di applicare una sollecitazione di taglio continua e costante15.
Dopo la coltivazione di cellule endoteliali primarie alla confluenza nel flusso e nella stimolazione della formazione delle corde VWF, gli pneumococci che esprimono la proteina di fluorescenza rossa (RFP)16 sono stati aggiunti allo strato di cellule endoteliali sotto costante controllo microscopico. L'attaccamento dei batteri alle stringhe VWF sulla superficie delle cellule endoteliali è stato visualizzato e monitorato al microscopio per un massimo di tre ore in tempo reale utilizzando anticorpi con etichettafluenza specifica VWF. Con questo approccio, il ruolo del VWF come cofattore di adesione che promuove l'attaccamento batterico all'endotelio vascolare è stato determinato8.
Oltre alla visualizzazione microscopica della secrezione proteica e ai cambiamenti conformazionali, questo metodo potrebbe essere utilizzato per monitorare singoli passaggi dei processi di infezione batterica in tempo reale e per quantificare la quantità di batteri collegati in diversi punti temporali di infezione. Lo specifico sistema di pompe software-controllato offre anche la possibilità di coltura le cellule endoteliali in condizioni di flusso costante definite per un massimo di diversi giorni e consente un'incubazione a flusso medio pulsato definito. Inoltre, questo metodo può essere applicato utilizzando diversi tipi di cella. L'adattamento del protocollo di colorazione consente anche il rilevamento e la visualizzazione di batteri interiorizzati in cellule eucariotiche.
Questo manoscritto descrive questo protocollo sperimentale avanzato che può essere utilizzato come approccio definito, affidabile e riproducibile per una caratterizzazione efficiente e versatile dei processi patofisiologici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10303002</td>
			<td>with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Luer-syringe</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>9077136</td>
			<td>For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>eBioscience now thermo fisher</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>protease mix used for gentle detachment of endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176751</td>
			<td>no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 &#181;l of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>BD 249210</td>
			<td>complex bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-25G</td>
			<td>solubilized, for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks with filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>392304</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of &#62; 2mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-30</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B06314</td>
			<td>spinning down of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Z 216 MK</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>305.00 V05 - Z 216 M</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3886.2</td>
			<td>used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp for perfusion tubing</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10821</td>
			<td>for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td>incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18 AIC</td>
			<td>for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colombia blood agar plates</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>PA-254005.06</td>
			<td>agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3440</td>
			<td>Comuter with pressure pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3904.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101969</td>
			<td>orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGM supplement Mix</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-39215</td>
			<td>supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 &#181;g / mL heparin, 1 &#181;g / mL Hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGMS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>biochrome now Merck</td>
			<td>S 0415</td>
			<td>supplement for cell culture, used for infection analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8822</td>
			<td>stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic Unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td>fluidic unit for flow cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (porcine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-1890-100g</td>
			<td>for precoating of microslide channel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-7250-10MG</td>
			<td>for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td>
			<td>primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc73268</td>
			<td>stock concentration: 200 &#181;g/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Port</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10820</td>
			<td>for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 35M</td>
			<td>inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td>physically modified slides for fludic cultivation (&#956;&#8211;Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 &#956;l, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td>For preparation of ECGMS medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Pump</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10905</td>
			<td>air pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer cell counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH&#38;Co KG</td>
			<td>40442002</td>
			<td>microscopic counting chamber for HUVECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>for cross linking of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the &#181;-slide L0.4Luer, at 37&#176;C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67,741</td>
			<td>(2 x optic) for OD measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumococcus-specific antiserum</td>
			<td>Pineda</td>
			<td></td>
			<td>raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene or Styrofoam plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>v1.5.4</td>
			<td>Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes 1.5/ 2.0mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706/ 72.695.500</td>
			<td>required for antibody dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes with 50 mL volume</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,48,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP-expressing pneumococci</td>
			<td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td>
			<td>10,319</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipets 5, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.025/ 86.1254.025</td>
			<td>for pipeting larger volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td>for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>P030.2</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Photometer Libra S22</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2115-20</td>
			<td>measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow

L'interazione di Streptococcus pneumoniae con la superficie delle cellule endoteliali è mediata nel flusso sanguigno attraverso proteine meccanosensibili come il Von Willebrand Factor (VWF). Questa glicoproteina cambia la sua conformazione molecolare in risposta allo stress da taglio, esponendo così i siti di legame per un ampio spettro di interazioni ospite-ligando. In generale, la coltura delle cellule endoteliche primarie sotto un flusso di taglio definito è nota per promuovere la differenziazione cellulare specifica e la formazione di uno strato endoteliale stabile e strettamente collegato simile alla fisiologia del rivestimento interno di un vaso sanguigno . Pertanto, l'analisi funzionale delle interazioni tra patogeni batterici e la vascolatura ospite che coinvolge proteine meccanosensibili richiede l'istituzione di sistemi di pompaggio in grado di simulare le forze di flusso fisiologico note per influenzare la superficie cellule vascolari.
Il dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio consente un ricircolo continuo e senza impulsi dei fluidi con una portata definita. Il sistema di pompaggio a pressione dell'aria controllato dal computer applica una sollecitazione di taglio definita sulle superfici delle cellule endote generando un flusso medio continuo, unidirezionale e controllato. I cambiamenti morfologici delle cellule e dell'attaccamento batterico possono essere monitorati e quantificati al microscopio nel flusso utilizzando speciali vetrini di canale progettati per la visualizzazione microscopica. A differenza dell'infezione da coltura cellulare statica, che in generale richiede una fissazione del campione prima dell'etichettatura immunitaria e delle analisi microscopiche, i vetrini microfluidici consentono sia il rilevamento basato sulla fluorescenza di proteine, batteri e componenti cellulari dopo la fissazione del campione; colorazione dell'immunofluorescenza seriale; e rilevamento diretto basato sulla fluorescenza in tempo reale. In combinazione con batteri fluorescenti e anticorpi specifici con etichettatura a fluorescenza, questa procedura di infezione fornisce un efficiente sistema di visualizzazione di componenti multipli per un enorme spettro di applicazioni scientifiche relative ai processi vascolari.

La culminazione dell'HUVEC primario in un flusso unidirezionale costante comporta la formazione di uno strato cellulare confluente e strettamente imballato che promuove la generazione di MDB cellulari riempiti con il VWF meccanosensibile13,14. Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di ricircolo senza impulsi basato sulla pressione dell'aria per l'analisi delle infezioni che richiede di imitare la situazione di stress da taglio nel flusso sanguigno umano.<...

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Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.

Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

L'uso di questo sistema di coltura cellulare endoteliale consente l'assimilazione della situazione nel flusso sanguigno. E con questa situazione, possiamo analizzare i processi di infezione batterica includendo anche l'identificazione di vettori batterici e anche di vettori cellulari che sono coinvolti in questo processo. Questa tecnica apre la strada all'esplorazione dell'impatto delle infezioni batteriche sull'integrità vascolare, includendo anche l'impatto sui meccanismi di morfogenesi, sulle risposte all'infiammazione e sulla regolazione immunitaria.Questa tecnica richiede una gestione speciale delle cellule endoteliali e quindi una descrizione visiva è meglio di una semplice spiegazione verbale. Questo metodo fornisce approfondimenti su diverse altre aree di ricerca correlate con sistemi vascolari perfusi come la differenziazione delle cellule endoteliali, la guarigione delle ferite, la genesi del tumore e l'angiogenesi. Uno dei passaggi chiave è la coltivazione standardizzata delle cellule e la manipolazione accurata delle cellule endoteliali primarie.Questa tecnica richiede una gestione speciale della coltura cellulare che non potrebbe essere chiara solo con una spiegazione verbale. Per iniziare, lavorare in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Utilizzare una pipetta per iniettare 100 microlitri di una soluzione PBS di gelatina suina filtrata sterile al 2% in un unico serbatoio di un vetrino a canale equilibrato a temperatura.Posizionare lo scivolo del canale rivestito di gelatina su una sottile piastra di polistirolo o polistirolo per evitare un calo della temperatura di scorrimento con una siringa Luer millilitro per aggiungere 100 microlitri della sospensione HUVEC quattro volte 10 al quinto per millilitro nello scivolo per seminare e coltivare l'HUVEC. Incubare lo scivolo del canale con l'HUVEC per 60 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, riempire ogni serbatoio medio ad entrambe le estremità dello scivolo del canale con 60 microlitri di mezzo ECGMS.Incubare per un'altra ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, per regolare la pompa microfluidica, collegare prima la perfusione equilibrata impostata all'unità pompa, riempire con 13,6 millilitri di mezzo ECGMS e avviare il software di controllo della pompa. Nel menu della configurazione dell'unità fluidica, selezionare l'adeguato set di perfusioni e il tipo di diapositiva della camera utilizzando le finestre di scorrimento verso il basso.Scegli 0,007 dyne secondo per centimetro quadrato nel software per una viscosità media. All'esterno dell'incubatore, collegare una bottiglia di vetro piena di perline di silice essiccanti ai tubi di pressione dell'aria. Selezionare i parametri di flusso nel menu software, impostare la pressione su 40 millibar e lavare i tubi della pompa con il mezzo liquido avviando il flusso medio continuo.Garantiamo un attacco cellulare stretto utilizzando HUFC coltivati in modo subconfluente e ci concentriamo inoltre sull'uscita delle bolle d'aria dal sistema e sull'utilizzo di un alimentatore indipendente per il sistema di pompaggio. Toccare i collegamenti dei tubi per rimuovere le bolle d'aria e assicurarsi che non circoleranno bolle d'aria nel sistema di pompaggio. Per collegare lo scivolo del canale, interrompere la circolazione del flusso nel software di controllo della pompa e tenere il flusso medio e il tubo di perfusione bloccando i tubi vicino alla connessione Luer.Collegare lo scivolo del canale evitando così bolle d'aria. Nella scheda avanzata del software di controllo della pompa, utilizzare il creatore del ciclo degli utensili software per programmare i cicli di sollecitazione di taglio desiderati per la coltivazione del flusso. Programmare i livelli di sollecitazione di taglio per la circolazione del flusso e iniziare la perfusione a lungo termine.Inizia con cinque dyne per centimetro quadrato che corrisponde a una portata di 5,44 millilitri al minuto per 30 minuti seguita da un flusso continuo a sollecitazione di taglio di 10 dyne per centimetro quadrato che corrisponde a una portata di 10,85 millilitri al minuto. Controllare il pompaggio bilanciato del serbatoio. Posizionare l'unità fluidica con lo scivolo del canale collegato in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Avviare il controllo software del microscopio e regolare le impostazioni principali per il monitoraggio microscopico della fluorescenza selezionando le impostazioni del filtro appropriate. Per la visualizzazione microscopica, posizionare l'unità fluidica nella camera di riscaldamento di 37 gradi Celsius. Posizionare lo scivolo del canale sul palco di un microscopio precontevolto.Controllare la morfologia cellulare e l'integrità dello strato HUVEC prima dell'iniezione di istamina e batteri nella circolazione del flusso. Mantenere l'impostazione del flusso. Indurre il rilascio di VWF da corpi palade endoteliali vitali iniettando 136 microlitri di una soluzione di stock di istamina da 100 millimolare attraverso una porta di iniezione nel mezzo ECGMS che circola nei tubi di perfusione.Per il rilevamento dell'immunofluorescenza di stringhe VWF multimerizzate, iniettare 20 microgrammi di un anticorpo coniugato FITC specifico VWF in un volume di 200 microlitri di PBS nei 13,6 millilitri circolanti del mezzo ECGMS. Per quantificare l'attacco Pneumococcico alle stringhe VWF generate sulle superfici cellulari HUVEC, iniettare 1,35 volte 10 all'ottavo CFU per millilitro RFP esprimendo Pneumococchi in un volume massimo di un millilitro nel mezzo ECGMS utilizzando la porta di iniezione. Selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 63X per l'ingrandimento del microscopio e regolare le impostazioni del filtro a fluorescenza nel software del microscopio sul canale RFP con un filtro di rilevamento da 540 nanometri per il rilevamento di RFP che esprime Pneumococchi.Per la quantificazione dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF, creare istantanee di pile Z di almeno 30 viste rappresentative sul campo ciascuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatte e contare la quantità di Pneumococchi. Per valutare l'attacco batterico dopo la fissazione prima della colorazione immunofluorescente, interrompere il flusso, rimuovere 10 millilitri di mezzo ECGMS dai serbatoi della pompa e aggiungere 10 millilitri di PBS integrati con paraformaldeide al 5% e procedere secondo il manoscritto. In questo protocollo, i principali passaggi sperimentali iniziano con una pre-coltivazione di cellule endoteliali primarie alla subconfluenza nei contenitori di coltura cellulare.Le cellule vengono quindi sementi in uno scivolo a canale rivestito di gelatina. I batteri vengono coltivati su piastre di agar seguite dalla coltivazione in una complessa fase di log medio-medio liquido. Per la coltura cellulare microfluidica, uno scivolo di canale con cellule endoteliali è collegato ai tubi di perfusione di un'unità fluidica del sistema di pompaggio e sottoposto a flusso costante per la differenziazione cellulare.La generazione delle corde VWF è stata indotta dall'iniezione di istamina ad una sollecitazione di taglio di 10 dyne secondo per centimetro quadrato e monitorata microscopicamente dal rilevamento dell'immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici VWF etichettati FITC. Dopo l'iniezione di proteine rosse a fluorescenza che esprimono batteri al mezzo circolante, l'attacco di Pneumococco alle corde VWF è stato visualizzato microscopicamente in tempo reale dall'emissione di fluorescenza a 450 nanometri. Dopo la fissazione delle cellule utilizzando pfa, la colorazione differenziale dell'immunofluorescenza fornisce la visualizzazione dell'attaccamento batterico in specifici punti di tempo di infezione.La fase più importante di questa procedura è garantire un attacco cellulare stretto sulla superficie dello scivolo regolando i livelli fisiologici di sollecitazione di taglio ed evitando fluttuazioni estreme della pressione della pompa. Oltre alla visualizzazione microscopica, questa tecnica può essere applicata per studiare gli effetti farmacologici di nuovi anti-infettivi e anche per analizzare le conseguenze a lungo termine dei processi di infezione vascolare. Questo sistema di pompe perfonde agenti patogeni batterici per pressione dell'aria per prevenire qualsiasi trasmissione tramite aerosol.Si consiglia di seguire le precauzioni di biosicurezza.

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