Name: pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00
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이 프로젝트는 DFG (BE 4570/4-1)에 의해 S.B에 지원되었습니다.

미세유체 세포 배양은 상업적인 일차인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 수행하였다. 회사는 기증자의 통보된 동의를 가진 세포를 고립시되었습니다. 이 연구는 참조 번호 와 연방 주 바덴 - 뷔르템베르크의 의사 상공 회의소의 윤리위원회에 의해 승인되었다 219-04.
참고: 프로토콜 소모품에 대한 재료 표를 참조하십시오.
1. 1 차 내피 세포...

<ol>
	<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+transmission,+colonization+and+invasion.">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li><li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins.">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells.">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li><li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells.">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin(ogen)-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface.">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+plasmin(ogen)-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae.">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix,+dissolution+of+fibrin+and+transmigration.">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li><li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow.">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).</li><li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping.">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li><li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation.">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li><li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease:+Focus+on+acute+coronary+syndromes.">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li><li>Springer, T. 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Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li><li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions.">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li><li>Pappelbaum, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo:+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system.">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li><li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies.">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li><li>Freshney, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).</li><li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+(hpIgR)+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium.">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li><li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism.">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li><li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-cell+patterning+lab+chip:+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue.">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-on-a-chip?+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine.">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li></ol>

VWF와 같은 메카노에민성 숙주 단백질과의 세균 상호 작용 시뮬레이션은 정의된 단방향 및 연속적인 액체 흐름을 생성할 수 있는 이난 세포 배양 시스템을 필요로 하며, 이로 인해 신뢰할 수 있는 전단 응력 생성 . 여러 미세 유체 펌프 시스템이 이미 설명되어 있습니다. Bergmann 외에서 포괄적인 검토는 상이한 2차원 및 3차원 세포 배양모델(17)의주요 측면을 요약한다.
<p class="jov...

폐렴구균 감염의 병인은 플라스미노겐 및 VWF 1,2와 같은 인간 지혈의 세포 외 매트릭스 화합물 및 구성 요소의 다양성과 다각적인 상호 작용을 특징으로합니다. 3,4,5,6,7,8. 다중 도메인 당단백질 VWF는 혈관 혈전 형성 부위에서 혈전세포 모집 및 피브린 혼입을 중재함으로써 균형 잡힌 지혈의 주요 조절자 역할을 한다9. 출혈 조절 및 상처 치유를 위한 기능적이고 활동적인 VWF의 중요성은 일반적인 상속된 출혈 장애 인 폰 윌레브란트 병10에의해 입증됩니다.
구형 VWF는 최대 14.0 μg/mL11,10의농도로 인간의 혈액 시스템에서 순환합니다. 혈관 손상에 대한 응답으로, 내피 바이벨 팔라드 바디 (WBP)에 의한 VWF의 국소 방출은현저하게 11,12증가된다. 이전 연구는 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 준수 및 공극 형성 독소 폐렴의 생산이 크게 루미날 VWF 분비를 자극한다는 것을 보여준다13. 혈류의 유체역학적 힘은 메카노반응성 VWF 도메인의 구조적 개방을 유도한다. 10dyn/cm2의 유량에서 VWF는 최대 수백 마이크로미터길이의 긴 단백질 문자열로 multimerizes10,12.
내피 표면과 폐렴구균의 상호 작용에서 전단 응력 하에서 생성된 다중화된 VWF 현의 기능을 이해하기 위해 미세 유체 기반 세포 배양 접근법이 확립되었습니다. 소프트웨어 제어 식 공기 압력 펌프 시스템을 갖춘 미세 유체 장치가 사용되었습니다. 이를 통해 정의된 유량으로 세포 배양 배지의 연속적이고 단방향 재순환이 가능했습니다. 따라서 시스템은 내피 세포의 표면에 정의된 전단 응력을 적용하여 특수 채널 슬라이드 내부에 부착된 상태로 유지했습니다. 이 접근법은 정의된 일정한 흐름 조건 하에서 VWF 현이 분화된 내피 세포에서 생성되는 인간 혈관 시스템의 혈류 내 전단력을 시뮬레이션할 수 있게 했습니다. 이를 위해, 내피 세포는 특정 채널 슬라이드(재료 표참조)에서 경작되었고, 이는 유동 동안 현미경 분석을 위해 조정되었다. 미세 유체 펌프 시스템은 동포 내피 세포 층에 확장 된 VWF 문자열의 형성에 필요한 고도로 정의되고 제어 된 전단 응력 상황을 제공했습니다. VWF-분비후 히스타민 보충제에 의해 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)를 동류성장한 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)의 자극 후, 현 형성은 10dyn/cm2의전단 응력(들)을 적용하여 유도되었다. 전단 응력은 세포 층에 작용하는 힘으로 정의됩니다. 그것은 코니쉬 등에 따라 대략 계산됩니다. al.14 와 방정식 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
여기서 = dyn/cm2의전단 응력, θ =점도(dyn∙s)/cm2, h =채널 높이의 절반, 채널 너비의 절반, Φ=mL/min의 유량.
방정식 1의 결과는 사용되는 다른 슬라이드의 높이와 너비에 따라 달라집니다(재질 표참조). 본 연구에서 0.4 μm의 루어 채널 슬라이드를 사용하여 챔버 슬라이드 계수 131.6을 사용하였다(공식 2 참조). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
37°C에서 배지의 점도는 0.0072 dyn∙s/cm²이고 10 dyn/cm²의 전단 응력도 사용하였다. 그 결과 10.5 mL/min의 유량이 발생했습니다(수식 3 참조). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
여기서, 숙주 혈관구조에서 세균 감염 메커니즘의 조사 및 시각화를 위한 단방향 층류 시스템을 이용한 미세유체 세포 배양 절차의 적응 및 발전이 상세히 기술된다. 내피 층에 VWF 스트링의 생성은 또한 연속적이고 꾸준한 전단응력(15)을적용할 수 있는 다른 펌프 시스템을 사용하여 자극될 수 있다.
VWF 현 형성의 흐름 및 자극에 합류하는 1차 내피 세포를 배작한 후, 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 폐렴구균을 일정한 현미경 조절하에 내피 세포 층에 첨가하였다. 내피 세포의 표면에 VWF 문자열에 박테리아를 부착하는 것은 VWF 특이적 형광 표지 항체를 사용하여 실시간으로 최대 3 시간 동안 현미경으로 시각화및 모니터링되었습니다. 이러한 접근법으로, 혈관 내피에 세균 부착을 촉진하는 유착 보조인자로서 VWF의 역할을 결정하였고8.
단백질 분비 및 형태 변화의 현미경 시각화 이외에,이 방법은 실시간으로 세균 감염 과정의 단일 단계를 모니터링하고 서로 다른 시점에서 부착 된 박테리아의 양을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 감염. 특정 소프트웨어 제어 펌프 시스템은 또한 최대 며칠 동안 정의된 일정한 유동 조건에서 내피 세포를 배양할 수 있는 가능성을 제공하고 정의된 펄스 매질 유동 배양을 가능하게 합니다. 또한,이 방법은 다른 세포 유형을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 염색 프로토콜을 적응하면 진핵 세포로 내중화된 박테리아를 감지하고 시각화할 수 있습니다.
이 원고는 병리학 적 과정의 효율적이고 다양한 특성화를 위해 정의되고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 접근 법으로 사용할 수있는이 고급 실험 프로토콜을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10303002</td>
			<td>with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Luer-syringe</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>9077136</td>
			<td>For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>eBioscience now thermo fisher</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>protease mix used for gentle detachment of endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176751</td>
			<td>no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 &#181;l of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>BD 249210</td>
			<td>complex bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-25G</td>
			<td>solubilized, for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks with filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>392304</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of &#62; 2mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-30</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B06314</td>
			<td>spinning down of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Z 216 MK</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>305.00 V05 - Z 216 M</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3886.2</td>
			<td>used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp for perfusion tubing</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10821</td>
			<td>for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td>incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18 AIC</td>
			<td>for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colombia blood agar plates</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>PA-254005.06</td>
			<td>agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3440</td>
			<td>Comuter with pressure pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3904.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101969</td>
			<td>orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGM supplement Mix</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-39215</td>
			<td>supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 &#181;g / mL heparin, 1 &#181;g / mL Hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGMS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>biochrome now Merck</td>
			<td>S 0415</td>
			<td>supplement for cell culture, used for infection analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8822</td>
			<td>stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic Unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td>fluidic unit for flow cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (porcine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-1890-100g</td>
			<td>for precoating of microslide channel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-7250-10MG</td>
			<td>for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td>
			<td>primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc73268</td>
			<td>stock concentration: 200 &#181;g/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Port</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10820</td>
			<td>for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 35M</td>
			<td>inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td>physically modified slides for fludic cultivation (&#956;&#8211;Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 &#956;l, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td>For preparation of ECGMS medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Pump</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10905</td>
			<td>air pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer cell counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH&#38;Co KG</td>
			<td>40442002</td>
			<td>microscopic counting chamber for HUVECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>for cross linking of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the &#181;-slide L0.4Luer, at 37&#176;C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67,741</td>
			<td>(2 x optic) for OD measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumococcus-specific antiserum</td>
			<td>Pineda</td>
			<td></td>
			<td>raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene or Styrofoam plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>v1.5.4</td>
			<td>Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes 1.5/ 2.0mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706/ 72.695.500</td>
			<td>required for antibody dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes with 50 mL volume</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,48,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP-expressing pneumococci</td>
			<td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td>
			<td>10,319</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipets 5, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.025/ 86.1254.025</td>
			<td>for pipeting larger volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td>for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>P030.2</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Photometer Libra S22</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2115-20</td>
			<td>measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow

내피 세포의 표면과 연쇄상 구균 폐렴의 상호 작용은 폰 윌레브란트 인자 (VWF)와 같은 메카노 민성 단백질을 통해 혈류에서 매개됩니다. 이 당단백질은 전단 응력에 반응하여 분자 변형을 변화시켜 광범위한 숙주-리간드 상호작용에 대한 결합 부위를 노출시킵니다. 일반적으로, 정의된 전단 흐름 하에서 1 차 내피 세포의 배양은 혈관의 내벽의 생리학을 닮은 안정적이고 단단히 연결된 내피 층의 특정 세포 분화 및 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. . 따라서, 세균성 병원체와 메카노민성 단백질을 포함하는 숙주 혈관구조 간의 상호작용의 기능적 분석은 표면에 영향을 미치는 것으로 알려진 생리적 유동력을 시뮬레이션할 수 있는 펌프 시스템의 확립을 요구한다. 혈관 세포.
이 연구에 사용된 미세 유체 장치는 정의된 유량으로 유체의 연속적이고 펄스없는 재순환을 가능하게 합니다. 컴퓨터 제어 식 공기 압 펌프 시스템은 연속, 단방향 및 제어 된 매체 흐름을 생성하여 내피 세포 표면에 정의 된 전단 응력적용합니다. 세포와 세균 부착의 형태학적 변화는 현미경 시각화를 위해 설계된 특수 채널 슬라이드를 사용하여 흐름에서 현미경으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 일반적으로 면역 표지 및 현미경 분석 전에 샘플 고정을 필요로하는 정적 세포 배양 감염과는 달리 미세 유체 슬라이드는 단백질, 박테리아 및 세포 성분의 형광 기반 검출을 모두 가능하게합니다. 샘플 고정 후; 직렬 면역 형광 염색; 실시간으로 직접 형광 기반 검출. 형광 박테리아 및 특정 형광 표지 항체와 함께,이 감염 절차는 혈관 과정과 관련된 과학적 응용 프로그램의 거대한 스펙트럼을위한 효율적인 다중 구성 요소 시각화 시스템을 제공합니다.

일정한 단방향 흐름에서 1차 HUVEC를 배양하면, 메카노에민티드 VWF13,14로채워진 셀룰러 WPB의 생성을 촉진하는 풍부하고 단단히 포장된 세포층의 형성을 초래한다. 이 프로토콜은 인간의 혈류에서 전단 응력 상황을 모방해야 하는 감염 분석을 위해 공기압 펌프 기반의 펄스리스 재순환 시스템의 사용을 설명합니다.
이 시스템은 소프?...

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Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

이 내피 세포 배양 시스템의 사용은 혈류의 상황을 동화 할 수 있습니다. 그리고 이러한 상황으로, 우리는 세균 성 벡터의 식별및 또한 이 과정에 관여하는 세포 벡터의 확인을 포함하여 세균성 감염 과정을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 또한 형태 발생 메커니즘에 미치는 영향을 포함하여 혈관 무결성에 세균 감염의 영향을 탐구하는 방법을 포장, 염증 반응및 면역 조절에.이 기술은 내피 세포의 몇 가지 특별한 처리를 필요로하므로 시각적 설명은 단지 구두 설명보다 낫다. 이 방법은 내피 세포 분화, 상처 치유, 종양 창세기 및 혈관 신생과 같은 침투 혈관 시스템과 상관 되는 연구의 여러 다른 영역에 대한 통찰력을 제공합니다. 주요 단계 중 하나는 표준화된 세포 재배뿐만 아니라 1차 내피 세포의 정확한 취급입니다.이 기술은 단지 구두 설명에 의해 명확 할 수없는 몇 가지 특별한 세포 배양 처리를 필요로한다. 먼저 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 작업하십시오. 파이펫을 사용하여 2% 멸균 여과 된 돼지 젤라틴 PBS 용액의 100 마이크로리터를 온도 평형 채널 슬라이드의 단일 저장소에 주입합니다.젤라틴 코팅 채널 슬라이드를 얇은 폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트에 놓고 1밀리리터 루어 주사기로 슬라이드 온도가 떨어지는 것을 방지하여 밀리리터 HUVEC 서스펜션당 5분의 1의 100 마이크로리터를 슬라이드에 추가하여 씨를 뿌리고 HUVEC를 경작시합니다. 채널 슬라이드를 HUVEC와 함께 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 60분 동안 배양합니다. 그 후, ECGMS 배지의 60 마이크로 리터로 채널 슬라이드의 양쪽 끝에 각 중간 저수지를 채웁니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 더 인큐베이션을 사용한다. 다음으로, 미세유체 펌프를 조정하기 위해 먼저 펌프 장치에 설정된 평형 관류를 연결하고, ECGMS 배지의 13.6 밀리리터를 채우고 펌프 제어 소프트웨어를 시작합니다. 유체 단위 설정의 메뉴에서 스크롤 창을 사용하여 적절한 관류 세트와 챔버 슬라이드 유형을 선택합니다.중간 점도에 대한 소프트웨어에서 평방 센티미터 당 0.007 다이네 초를 선택합니다. 인큐베이터 바깥쪽에는 건조실리카 구슬로 채워진 유리 병을 기압 튜브에 연결합니다. 소프트웨어 메뉴에서 유량 파라미터를 선택하고, 압력을 40밀리바르로 설정하고, 연속 배지 흐름을 시작하여 액체 배지로 펌프 튜브를 플러시한다.우리는 서브컨컬러재배 의 HUVEC를 사용하여 단단한 셀 부착을 보장하고 또한 시스템에서 기포를 꺼내고 펌프 시스템에 대한 독립적 인 전원 공급 장치를 사용하는 데 중점을 둡니다. 튜브 연결을 탭하여 기포를 제거하고 펌프 시스템에서 기포가 순환되지 않도록 하십시오. 채널 슬라이드를 연결하기 위해 펌프 제어 소프트웨어의 유동 순환을 중지하고 Luer 연결 근처의 튜브를 고정하여 중간 흐름과 관류 튜브를 보유합니다.채널 슬라이드를 연결하여 기포를 피하십시오. 펌프 제어 소프트웨어 고급 탭에서 소프트웨어 도구 주기 작성자를 사용하여 흐름 재배에 원하는 전단 응력 주기를 프로그래밍합니다. 흐름 순환에 대한 전단 응력 수준을 프로그래밍하고 장기 관류를 시작합니다.30분 동안 분당 5.44밀리리터의 유속도에 해당하는 평방 센티미터당 5개의 다인으로 시작하여 분당 10.85 밀리리터에 해당하는 평방 센티미터당 10dyne의 전단 응력에서 연속 유동을 시작합니다. 균형 잡힌 저수지 펌핑을 제어합니다. 연결된 채널 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 연결된 채널 슬라이드로 유체 장치를 배치합니다.현미경 소프트웨어 제어를 시작하고 적절한 필터 설정을 선택하여 형광 현미경 모니터링에 대한 원리 설정을 조정합니다. 미세한 시각화를 위해 유체 장치를 섭씨 37도 의 가열 챔버에 놓습니다. 미리 따뜻해진 현미경의 무대에 채널 슬라이드를 놓습니다.히스타민과 박테리아를 주입하기 전에 세포 형태와 HUVEC 층의 무결성을 유동 순환에 제어합니다. 흐름 설정을 유지 관리합니다. 관류 관에서 순환하는 ECGMS 배지에 주입 포트를 통해 100 밀리머 히스타민 스톡 용액의 136 마이크로리터를 주입하여 내피 성 가능한 팔라데 몸에서 VWF의 방출을 유도한다.다중 머기 폭스바겐F 현의 면역 불발 검출을 위해, ECGMS 배지의 순환 13.6 밀리리터에 PBS의 200 마이크로리터의 부피에 VWF 특정 FITC 컨쥬게이드 항체의 20 마이크로그램을 주입한다. HUVEC 세포 표면에서 생성된 폭스바겐F 현에 대한 공압코칼 부착물을 정량화하기 위해, 주입 포트를 사용하여 ECGMS 배지에 최대 1밀리리터의 최대 부피로 Pneumococci를 발현하는 밀리리터 RFP당 8번째 CFU에 1.35배 10배를 주입한다. 현미경 배율에 대한 63X 오일 침지 목표를 선택하고 Pneumococci를 발현하는 RFP 검출 필터를 사용하여 현미경 소프트웨어의 형광 필터 설정을 RFP 채널로 조정한다.VWF 문자열에 대한 세균 부착의 정량화를 위해, 약 10 개의 형태 그대로 HUVEC를 포함하는 적어도 30 개의 대표 필드 뷰의 Z 스택의 스냅 샷을 만들고 Pneumococci의 양을 계산합니다. 면역형성 염색 전에 고정 후 세균 부착을 평가하기 위해, 흐름을 멈추고, 펌프 저수지에서 ECGMS 배지의 10 밀리리터를 제거하고, 5%의 파라포름알데히드로 보충된 PBS의 10밀리리터를 추가하고 원고에 따라 진행한다. 이 프로토콜에서, 원리 실험 단계는 세포 배양 플라스크에 있는 섭년소에 1 차적인 내피 세포의 사전 재배로 시작합니다.그런 다음 셀을 젤라틴 코팅 채널 슬라이드로 시드됩니다. 박테리아는 한천 판에서 재배되며, 복잡한 액체 배지에서 중간 로그 단계에서 재배합니다. 미세 유체 세포 배양의 경우, 내피 세포를 가진 채널 슬라이드는 펌프 시스템의 유체 단위의 관류 튜브에 연결되고 세포 분화를 위한 일정한 흐름을 실시한다.VWF 현의 생성은 FITC 표지 폭스바겐F 특이적 항체를 사용하여 면역 형광 검출에 의해 현미경으로 모니터링되는 평방 센티미터 당 10 dyne 초의 전단 응력에서 히스타민 주입에 의해 유도되었다. 순환 매체에 박테리아를 발현하는 적색 형광 단백질을 주입한 후, 폭스바겐에 대한 폐렴구균 부착물은 450나노미터에서 형광 방출에 의해 실시간으로 현미경으로 시각화되었다. PFA를 사용하여 세포의 고정 후, 차동 면역 형광 염색은 특정 감염 시점의 세균 부착의 시각화를 제공합니다.이 절차의 가장 중요한 단계는 생리적 전단 응력 수준을 조정하고 극단적 인 펌프 압력 변동을 피함으로써 슬라이드 표면에 단단한 세포 부착을 보장하는 것입니다. 현미경 시각화 외에도, 이 기술은 새로운 항 감염의 약리학적 효과를 연구하고 혈관 감염 과정의 장기적인 결과를 분석하기 위해 적용될 수 있다. 이 펌프 시스템은 에어로졸을 통한 변속을 방지하기 위해 기압으로 세균 병원균을 침투시킵니다.생물 안전 예방 조치를 따르는 것이 좋습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

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Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

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고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...