Name: pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Проект финансировался DFG (BE 4570/4-1) в S.B.

Микрофлюидная культивация клеток осуществлялась с помощью коммерческих первичных эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVEC). Компания изолировала клетки с информированным согласием донора. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Doctors Chamber федеративного государства Баде...

<ol>
	<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+transmission,+colonization+and+invasion.">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li><li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins.">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells.">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li><li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells.">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin(ogen)-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface.">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+plasmin(ogen)-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae.">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix,+dissolution+of+fibrin+and+transmigration.">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li><li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow.">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).</li><li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping.">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li><li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation.">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li><li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease:+Focus+on+acute+coronary+syndromes.">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li><li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells.">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li><li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section.">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li><li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Alb&#225;nez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation.">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li><li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions.">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li><li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues:+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology.">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li><li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip.">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li><li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+Structure,+assembly,+and+cardiovascular+implications.">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li><li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases.">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li><li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2012.+Microfluidic+3D+cell+culture:+potential+application+for+tissue-based+bioassays.">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li><li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions.">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li><li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers.">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li><li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo:+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system.">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li><li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies.">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , (2005).</li><li>Shaw, J. A., Shaw, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).</li><li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+(hpIgR)+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium.">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li><li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism.">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li><li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-cell+patterning+lab+chip:+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue.">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-on-a-chip?+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine.">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li></ol>

Моделирование бактериального взаимодействия с механочувствительными белками-хостами, такими как VWF, требует сложной системы культуры клеток, которая позволяет генерировать определенный, однонаправленный и непрерывный поток жидкостей, тем самым создавая надежный стресс сдвига . Уже ?...

Патогенез пневмококковых инфекций характеризуется многогранным взаимодействием с разнообразием внеклеточных матричных соединений и компонентов гемостаза человека, таких как плазминоген и VWF1, 3,4,5,6,7,8. Мультидоменглиновая гликопротеина VWF служит ключевым регулятором сбалансированного гемостаза путем посредничества в наборе тромбоцитов и инкорпорации фибрина в месте образования сосудистого тромба9. Важность функционального, активного VWF для контроля кровотечения и заживления ран демонстрируетболезнь фон Виллебранд, распространенное наследственное кровотечение10.
Глобулярный VWF циркулирует в крови человека в концентрации до 14,0 мкг/мл11,10. В ответ на сосудистые травмы, локальный выпуск VWF эндотелиальных тел Вейбель Паладе (WBP) заметно увеличилось11,12. Предыдущие исследования показывают, что пневмококк приверженность человека эндотелиальных клеток и его производство порообразующего токсина пневмолиза значительно стимулирует светлую секрецию VWF13. Гидродинамические силы кровотока вызывают структурное открытие механоответственных доменов VWF. При норме потока 10 dyn/cm2 VWF мультимеризирует до длинных белковых струн длиной до нескольких сотен микрометров, которые остаются прикрепленными к субэндотелию10,12.
Чтобы понять функцию мультимеризированных струн VWF, генерируемых при стрессе сдвига при взаимодействии пневмококка с эндотелиальной поверхностью, был создан микрофлюидный подход к клеточной культуре. Использовалось микрофлюидное устройство с программно-управляемой системой насоса воздушного давления. Это позволило непрерывно, однонаправленное рециркуляции среды клеточной культуры с определенной скоростью потока. Таким образом, система применила определенный стресс сдвига на поверхности эндотелиальных клеток, которые оставались прикрепленными внутри специализированных слайдов канала. Этот подход позволил смоделировать силу сдвига в крови сосудистой системы человека, в которой строки VWF генерируются на дифференцированных эндотелиальных клетках при определенных постоянных условиях потока. Для этого эндотелиальные клетки культивировались в конкретных слайдах канала (см. Таблица материалов),которые были адаптированы для микроскопических анализов во время потока. Микрофлюидная насосная система обеспечивала высокоопределенную и контролируемую стрессовую ситуацию, необходимую для формирования расширенных струн VWF на сливочного эндотелиального клеточного слоя. После стимуляции VWF-секретации конфлентически выращенных человеческих пупочных клеток вены (HUVEC) гистаминовой добавкой, образование строки было вызвано применением сдвига стресс (я) 10 dyn/cm2. Стресс сдвига определяется как сила, действующая на клеточном слое. Он рассчитывается примерно в соответствии с Корниш и т.д. al.14 с уравнением 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
В тех случаях, когда стресс сдвига в dyn/cm2, вязкость в (dyn)/cm2, h q half of высота канала, w й половина ширины канала, и й s flowrate в mL/min.
Результат уравнения 1 зависит от различных высот и ширины различных используемых слайдов (см. Таблица материалов). В этом исследовании был использован слайд канала Luer в 0,4 мкм, в результате чего коэффициент камерного слайда составил 131,6 (см. формулу 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
Вискозность среды при 37 градусах Цельсия составляет 0,0072 дина/см2 и использовался стресс сдвига 10 dyn/cm2. Это привело к скорости потока 10,5 мл/мин (см. формулу 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
Здесь подробно описана адаптация и продвижение процедуры культивирования микрофлюидных клеток с использованием однонаправленной системы ламинара для исследования и визуализации механизмов бактериальной инфекции в сосудистой системе хозяина. Поколение строк VWF на эндотелиальных слоях также может быть стимулировано с помощью других насосных систем, которые способны применять непрерывный и устойчивый стресс сдвига15.
После культивирования первичных эндотелиальных клеток для слияния в потоке и стимуляции формирования струнных VWF, пневмококки, выражающие красный флуоресценционный белок (RFP)16 были добавлены в эндотелиальный клеточный слой под постоянным микроскопическим контролем. Привязка бактерий к струнам VWF на поверхности эндотелиальных клеток была микроскопически визуализирована и контролироваться в течение трех часов в режиме реального времени с помощью флуоресцентных антител, маркированных VWF. При таком подходе, роль VWF как кофактор адгезии содействия бактериальной привязанности к сосудистому эндотелия была определена8.
В дополнение к микроскопической визуализации секреции белка и конформационных изменений, этот метод может быть использован для мониторинга отдельных шагов процессов бактериальной инфекции в режиме реального времени и количественное количество прикрепленных бактерий в разных точках времени Инфекции. Специфическая система насоса, управляемая программным обеспечением, также обеспечивает возможность культуры эндотелиальных ячеек в определенных условиях постоянного потока на срок до нескольких дней и обеспечивает определенную инкубацию импульсного среднего потока. Кроме того, этот метод может быть применен с использованием различных типов клеток. Адаптация протокола окрашивания также позволяет обнаруживать и визуализировать бактерии, интернализированные в эукариотические клетки.
Данная рукопись описывает этот передовой экспериментальный протокол, который может быть использован в качестве определенного, надежного и воспроизводимого подхода для эффективной и универсальной характеристики патофизиологических процессов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10303002</td>
			<td>with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Luer-syringe</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>9077136</td>
			<td>For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>eBioscience now thermo fisher</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>protease mix used for gentle detachment of endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176751</td>
			<td>no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 &#181;l of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>BD 249210</td>
			<td>complex bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-25G</td>
			<td>solubilized, for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks with filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>392304</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of &#62; 2mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-30</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B06314</td>
			<td>spinning down of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Z 216 MK</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>305.00 V05 - Z 216 M</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3886.2</td>
			<td>used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp for perfusion tubing</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10821</td>
			<td>for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td>incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18 AIC</td>
			<td>for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colombia blood agar plates</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>PA-254005.06</td>
			<td>agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3440</td>
			<td>Comuter with pressure pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3904.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101969</td>
			<td>orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGM supplement Mix</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-39215</td>
			<td>supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 &#181;g / mL heparin, 1 &#181;g / mL Hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGMS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>biochrome now Merck</td>
			<td>S 0415</td>
			<td>supplement for cell culture, used for infection analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8822</td>
			<td>stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic Unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td>fluidic unit for flow cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (porcine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-1890-100g</td>
			<td>for precoating of microslide channel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-7250-10MG</td>
			<td>for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td>
			<td>primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc73268</td>
			<td>stock concentration: 200 &#181;g/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Port</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10820</td>
			<td>for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 35M</td>
			<td>inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td>physically modified slides for fludic cultivation (&#956;&#8211;Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 &#956;l, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td>For preparation of ECGMS medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Pump</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10905</td>
			<td>air pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer cell counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH&#38;Co KG</td>
			<td>40442002</td>
			<td>microscopic counting chamber for HUVECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>for cross linking of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the &#181;-slide L0.4Luer, at 37&#176;C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67,741</td>
			<td>(2 x optic) for OD measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumococcus-specific antiserum</td>
			<td>Pineda</td>
			<td></td>
			<td>raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene or Styrofoam plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>v1.5.4</td>
			<td>Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes 1.5/ 2.0mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706/ 72.695.500</td>
			<td>required for antibody dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes with 50 mL volume</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,48,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP-expressing pneumococci</td>
			<td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td>
			<td>10,319</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipets 5, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.025/ 86.1254.025</td>
			<td>for pipeting larger volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td>for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>P030.2</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Photometer Libra S22</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2115-20</td>
			<td>measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow

Взаимодействие стрептококковой пневмонии с поверхностью эндотелиальных клеток опосредовано в кровотоке через механочувствительные белки, такие как фактор фон Виллебранд (VWF). Этот гликопротеин изменяет свою молекулярную конформацию в ответ на стресс сдвига, тем самым подвергая обязательные участки для широкого спектра взаимодействий хозяина-лигада. В целом, культивирование первичных эндотелиальных клеток под определенным потоком сдвига, как известно, способствует специфической клеточной дифференциации и образованию стабильного и тесно связанного эндотелиального слоя, напоминающего физиологию внутренней слизистой оболочки кровеносных сосудов . Таким образом, функциональный анализ взаимодействий между бактериальными патогенами и сосудами-хозяевами с использованием механочувствительных белков требует создания насосных систем, которые могут имитировать физиологические силы потока, которые, как известно, влияют на поверхность сосудистых клеток.
Микрофлюидическое устройство, используемое в данном исследовании, обеспечивает непрерывную и бесприсрадаемую рециркуляцию жидкостей с определенной скоростью потока. Компьютерная система насоса воздушного давления применяет определенный стресс сдвига на эндотелиальных поверхностях клеток, генерируя непрерывный, однонаправленный и контролируемый средний поток. Морфологические изменения клеток и бактериальной привязанности могут микроскопически контролироваться и количественно в потоке с помощью специальных слайдов канала, которые предназначены для микроскопической визуализации. В отличие от инфекции культуры статических клеток, которая в целом требует фиксации образца до иммунной маркировки и микроскопических анализов, микрофлюидные слайды позволяют как флуоресценции на основе обнаружения белков, бактерий и клеточных компонентов после фиксации образца; серийное окрашивание иммунофлуоресценции; и прямое обнаружение на основе флуоресценции в режиме реального времени. В сочетании с флуоресцентными бактериями и специфическими флуоресценцией помечены антитела, эта процедура инфекции обеспечивает эффективную систему визуализации нескольких компонентов для огромного спектра научных приложений, связанных с сосудистыми процессами.

Культирование первичного HUVEC в постоянном однонаправленном потоке приводит к образованию сливательного и плотно упакованного клеточного слоя, который способствует генерации клеточных WPB, наполненных механочувствительным VWF13,14. Этот протокол описывает...

Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Это исследование описывает микроскопический мониторинг пневмококка соблюдения фон Willebrand фактор строки, производимые на поверхности дифференцированных человеческих первичных эндотелиальных клеток под сдвига стресс в определенных условиях потока. Этот протокол может быть расширен до детальной визуализации конкретных клеточных структур и количественной оценки бактерий путем применения дифференциальных иммуностоинных процедур.

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Использование этой эндотелиальной клеточной культуры позволяет усвоить ситуацию в кровотоке. И в этой ситуации мы можем проанализировать процессы бактериальной инфекции, включая выявление бактериальных переносчиков, а также клеточных переносчиков, которые участвуют в этом процессе. Этот метод прокладывает путь к изучению влияния бактериальных инфекций на целостность сосудов, включая влияние на механизмы морфогенеза, на реакцию воспаления и иммунную регуляции.Этот метод требует специальной обработки эндотелиальных клеток и, следовательно, визуальное описание лучше, чем просто устное объяснение. Этот метод дает представление о ряде других областей исследований, коррелирующих с перфлитированных сосудистых систем, таких как эндотелиальная дифференциация клеток, заживление ран, генезис опухоли и ангиогенез. Одним из ключевых шагов является стандартизированное культивирование клеток, а также точная обработка первичных эндотелиальных клеток.Этот метод требует некоторых специальных обработки клеточной культуры, которые не могут быть ясны только словесные объяснения. Для начала работайте в стерильной среде с помощью чистой скамейки. Используйте пипетку, чтобы впрыснуть 100 микролитров 2%-стерильного фильтрованного свиного желатина PBS раствора в один резервуар с температурным уравновешенным слайдом канала.Поместите желатин покрытием канал слайд на тонкий полистирол или пенополистирола пластины для предотвращения падения температуры слайда с одним миллилитров люэр шприц, чтобы добавить 100 микролитров из четырех раз 10 до пятого миллилитров HUVEC подвески в слайд для семян и культивировать HUVEC. Инкубировать канал слайд с HUVEC в течение 60 минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. После этого заполните каждый средний резервуар на обоих концах слайда канала 60 микролитров среды ЭКГМС.Инкубировать еще один час при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Затем, чтобы настроить микрофлюидный насос, сначала подключите equilibrated перфузии набор для блока насоса, заполнить 13,6 миллилитров ECGMS среды и начать программное обеспечение управления насосом. В меню установки жидкостного блока выберите адекватный набор перфузии и тип камерного слайда с помощью прокрутки вниз по окнам.Выберите 0.007 dyne второй квадратный сантиметр в программном обеспечении для средней вязкости. Вне инкубатора соедините стеклянную бутылку, наполненную сухими бусинками кремнезема, с трубами давления воздуха. Выберите параметры потока в программном меню, установите давление до 40 миллибар и промыть насосные трубки с жидкой средой, начав непрерывный средний поток.Мы гарантируем плотное вложение клеток с помощью субвлиятельно выращенных HUVECs и дополнительно сосредоточиться на получении пузырьков воздуха из системы, а также с использованием независимого питания для насосной системы. Нажмите на соединения труб, чтобы удалить пузырьки воздуха и убедиться, что пузырьки воздуха не циркулируют в насосной системе. Для подключения слайда канала, остановить циркуляцию потока в программном обеспечении управления насосом и удерживать средний поток и перфузии трубки путем зажима труб вблизи соединения Luer.Подключите слайд канала, избегая тем самым пузырьков воздуха. В программном обеспечении управления насосом передовые вкладке, использовать создатель цикла программного обеспечения инструмента для программы желаемого цикла стресса стрижки для выращивания потока. Программа уровня стресса стрижки для циркуляции потока и начать долгосрочную перфузию.Начните с пяти дина на квадратный сантиметр, который соответствует скорости потока 5,44 миллилитров в минуту в течение 30 минут с последующим непрерывным потоком при стрессе стрижки 10 дине на квадратный сантиметр, что соответствует скорости потока 10,85 миллилитров в минуту. Управление сбалансированной прокачкой резервуара. Поместите жидкий блок с подключенным слайдом канала в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе.Запустите управление программным обеспечением микроскопа и отрегулируйте основные настройки для микроскопического мониторинга флуоресценции, выбрав соответствующие настройки фильтра. Для микроскопической визуализации поместите жидкостный блок в 37 градусов по Цельсию нагревательной камеры. Поместите слайд канала на сцену довоенной микроскопа.Контроли морфологии клеток и целостности слоя HUVEC до инъекции гистамина и бактерий в циркуляцию потока. Поддерживайте настройку потока. Индуцировать высвобождение VWF из эндотелиальных жизнеспособных органов Palade путем введения 136 микролитров 100 миллимолярный раствор гистамина фонда через инъекционный порт в ECGMS среды циркулирующих в перфузии трубки.Для обнаружения иммунофлюоресценции многомерных струн VWF в циркулирующие 13,6 миллилитров среды ЭКГМС вводят 20 микрограммов конъюгированных антител VWF. Для количественной оценки пневмококкового крепления к струнам VWF, генерируемым на поверхностях клеток HUVEC, ввисьйте 1,35 раза от 10 до восьмого CFU на миллилитр RFP, выражая пневмококки в максимальном объеме одного миллилитра в среду ЭКГМС с помощью порта впрыска. Выберите цель погружения масла 63X для увеличения микроскопа и отрегулируйте настройки фильтра флуоресценции в программном обеспечении микроскопа к каналу RFP с фильтром обнаружения 540 нанометров для обнаружения RFP, выражаюго пневмококки.Для количественной оценки бактериального крепления к строкам VWF создайте снимки стеков из не менее 30 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит приблизительно 10 морфологически нетронутых HUVEC, и подсчитайте количество пневмококков. Для оценки бактериальной привязанности после фиксации до иммунофлуоресцентного окрашивания, остановить поток, удалить 10 миллилитров среды ЭКГМС из резервуаров насоса, и добавить 10 миллилитров PBS дополнены 5%paraformaldehyde и продолжить в соответствии с рукописью. В этом протоколе основные экспериментальные шаги начинаются с предварительного культивирования первичных эндотелиальных клеток для субвлияния в колбы клеточной культуры.Клетки затем посеяны в желатин покрытием слайд канала. Бактерии выращиваются на агарных пластинах с последующим культивированием в сложной жидкой среде и средней фазе журнала. Для микрофлюидной клеточной культуры слайд канала с эндотелиальными клетками соединен с перфузиоными трубками жидкого блока насосной системы и подвергается постоянному потоку для дифференциации клеток.Поколение струн VWF было вызвано инъекцией гистамина при стрессе с разрывом 10 дина на квадратный сантиметр и микроскопически контролировалось с помощью обнаружения иммунофлюоресценции с использованием специфических антител VWF с маркировкой FITC. После инъекции красного белка флуоресценции, выражаюного бактерии в циркулирующую среду, вложение пневмококка в струны VWF было микроскопически визуализировано в режиме реального времени с помощью флуоресцентного излучения на 450 нанометров. После фиксации клеток с помощью PFA, дифференциальное окрашивание иммунофторесценции обеспечивает визуализацию бактериальной привязанности в определенных точках времени инфекции.Наиболее важным шагом этой процедуры является обеспечение плотного крепления клеток на поверхности слайда путем корректировки физиологического уровня стресса стрижки и избежания экстремальных колебаний давления насоса. Помимо микроскопической визуализации, этот метод может быть применен для изучения фармакологического воздействия новых противоинфекционых, а также для анализа долгосрочных последствий сосудистых инфекционных процессов. Эта насосная система перфусирует бактериальные патогены давлением воздуха, чтобы предотвратить любую передачу через аэрозоли.Рекомендуется соблюдать меры биобезопасности.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...