Name: pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Projektet finansierades av DFG (BE 4570/4-1) till S.B.

Den mikroflödessystem cellodling utfördes med kommersiella primära mänskliga navel venen endotelceller (huvec). Företaget isolerade cellerna med informerat samtycke av givaren. Denna studie var godkänd vid etikkommittén av manipulerar kammaren av det federalt påstår Baden-Wuerttemberg med hänvisa till numrerar 219-04.
Anmärkning: Se tabell över material för protokoll leveranser.
1. precultivation av primära endotelceller...

<ol>
	<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae:+transmission,+colonization+and+invasion.">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li><li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins.">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells.">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li><li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells.">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin(ogen)-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface.">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+plasmin(ogen)-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae.">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li><li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix,+dissolution+of+fibrin+and+transmigration.">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li><li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow.">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).</li><li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping.">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li><li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation.">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li><li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease:+Focus+on+acute+coronary+syndromes.">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li><li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells.">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li><li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section.">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li><li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Alb&#225;nez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation.">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li><li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions.">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li><li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues:+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology.">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li><li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip.">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li><li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+Structure,+assembly,+and+cardiovascular+implications.">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li><li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases.">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li><li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2012.+Microfluidic+3D+cell+culture:+potential+application+for+tissue-based+bioassays.">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li><li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions.">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li><li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers.">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li><li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo:+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system.">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li><li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies.">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , (2005).</li><li>Shaw, J. A., Shaw, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epithelial cell culture- a practical approach. , 218 (1996).</li><li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+(hpIgR)+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium.">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li><li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism.">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li><li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-cell+patterning+lab+chip:+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue.">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip.">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration-on-a-chip?+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine.">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li></ol>

Simuleringen av bakteriell interaktion med mechanosensitive Host proteiner såsom VWF kräver ett parfymera cellkultursystem som möjliggör generering av ett definierat, enkelriktat och kontinuerligt flöde av vätskor, vilket skapar tillförlitlig skjuvbelastning . Flera mikrofluidiska pumpsystem har redan beskrivits. En omfattande översyn från Bergmann et al. sammanfattar de viktigaste aspekterna av olika två-och tredimensionell cellkultur modeller17.
Den mikrofl?...

Patogenesen av pneumokocker infektioner kännetecknas av en mångfacetterad interaktion med en mångfald av extracellulära matrix föreningar och komponenter i människans hemostas, såsom plasminogen ochVWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Den flera domäner glykoprotein VWF fungerar som nyckel regulator av en balanserad hemostas genom att förmedla trombocyter rekrytering och fibrin inkorporering vid platsen för vaskulär tromb formation9. Betydelsen av funktionell, aktiv VWF för blödningskontroll och sårläkning framgår av von Willebrands sjukdom, en vanlig ärftlig blödningssjukdom10.
Globulära VWF cirkulerar i det humana blodsystemet med en koncentration på upp till 14,0 μg/ml11,10. Som svar på vaskulär skada, den lokala utgåvan av VWF av endotelceller Weibel Palade organ (WBP) är markant ökade11,12. Tidigare studier visar att pneumokocker anslutning till humana endotelceller och dess produktion av Porbildande toxin pneumolysin stimulerar signifikant luminala VWF sekretion13. Blodflödets hydrodynamiska krafter inducerar en strukturell öppning av de mechanoresponsive VWF-domänerna. Vid flödeshastigheter på 10 dyn/cm2 den VWF multimerizes till långa protein strängar på upp till flera hundra mikrometer i längd som förblir knutna till subendotelet10,12.
För att förstå funktionen av multimerized VWF strängar som genereras under skjuvning stress i samspelet mellan pneumokocker med endoteliala ytan, en microfluidic-baserade cellkultur infektion strategi fastställdes. En mikrofluidisk enhet med ett programvarustyrt luft trycks pumpsystem användes. Detta möjliggjorde en kontinuerlig, enkelriktad återcirkulation av cellodlingsmedium med en definierad flödeshastighet. Därmed applicerade systemet en definierad skjuvning spänning på ytbehandla av endotelceller celler, som återstod fäst insida specialiserade kanaliserar glidbanor. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde simuleringen av skjuvning kraft inom blodströmmen av det mänskliga vaskulära systemet, där VWF strängar genereras på differentierade endotelceller under definierade konstanta flödesförhållanden. I detta syfte odlades endotelcellerna i specifika kanalbilder (se tabell över material), som anpassades för mikroskopiska analyser underflödet. Mikroflödessystem pumpsystem som den mycket definierade och kontrollerade skjuvning stress situation som krävs för bildandet av utökade VWF strängar på konfluenta endotelceller cell skiktet. Efter stimulering av VWF-utsöndring av samverkande odlas mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC) av histamin tillskott, var strängen bildandet induceras genom att tillämpa en skjuvning stress (ԏ) av 10 dyn/cm2. Skjuvspänningen definieras som den kraft som verkar på cell skiktet. Den beräknas ungefär enligt Cornish et. Al.14 med ekvation 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
Där ԏ = skjuvning stress i dyn/cm2, η = viskositet i (dyn ∙ s)/cm2, h = halva kanalens höjd, w = hälften av kanalbredden, och Φ = flöde i ml/min.
Resultatet av ekvation 1 beror på de olika höjderna och bredderna för de olika bilderna som används (se tabell över material). I denna studie användes en Luerkanalslide på 0,4 μm, vilket resulterade i en kammar bild faktor på 131,6 (se formel 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
Viskositeten hos mediet vid 37 ° c är 0,0072 dyn ∙ s/cm ² och en skjuvning stress på 10 dyn/cm ² användes. Detta resulterade i en flödeshastighet på 10,5 mL/min (se formel 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
Här beskrivs anpassning och avancemang av en mikroflödessystem cell odlings procedur med hjälp av ett enkelriktat laminärt flödessystem för utredning och visualisering av bakteriella infektions mekanismer i värd kärlsystemet i detalj. Generering av VWF strängar på endotelskikt kan också stimuleras genom att använda andra pumpsystem som kan tillämpa en kontinuerlig och stadig skjuvning stress15.
Efter odling av primära endotelceller till sammanflödet i flödet och stimulering av VWF sträng formation, pneumokocker uttrycker rött fluorescens protein (RFP)16 lades till endotelcellskiktet under konstant mikroskopisk kontroll. Fastsättning av bakterier till VWF strängar på ytan av endotelceller var mikroskopiskt visualiseras och övervakas för upp till tre timmar i realtid med hjälp av VWF-specifika fluorescerande-märkta antikroppar. Med detta tillvägagångssätt, var den roll som VWF som en vidhäftning kofaktor främja bakteriell kvarstad på vaskulära endotelet bestämdes8.
Förutom den mikroskopiska visualiseringen av proteinsekretion och kon Formations förändringar, kan denna metod användas för att övervaka enstaka steg av bakteriella infektions processer i realtid och för att kvantifiera mängden bifogade bakterier vid olika tidpunkter i Infektion. Det specifika programvarustyrda pumpsystemet ger också möjlighet att odla endotelcellerna under definierade konstanta flödesförhållanden i upp till flera dagar och möjliggör en definierad inkubation mellan pulsade medel. Dessutom kan denna metod tillämpas med hjälp av olika celltyper. Anpassning av infärgnings protokollet möjliggör också detektion och visualisering av bakterier internaliseras i eukaryotiska celler.
Detta manuskript beskriver detta avancerade experimentella protokoll som kan användas som en definierad, tillförlitlig och reproducerbar metod för en effektiv och mångsidig karakterisering av patofysiologiska processer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10303002</td>
			<td>with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Luer-syringe</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>9077136</td>
			<td>For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>eBioscience now thermo fisher</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td>protease mix used for gentle detachment of endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor350-conjugated Phalloidin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176751</td>
			<td>no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 &#181;l of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>BD 249210</td>
			<td>complex bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-25G</td>
			<td>solubilized, for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks with filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>392304</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of &#62; 2mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Allegra X-30</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B06314</td>
			<td>spinning down of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Z 216 MK</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>305.00 V05 - Z 216 M</td>
			<td>spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3886.2</td>
			<td>used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp for perfusion tubing</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10821</td>
			<td>for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td>incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37&#176;C and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18 AIC</td>
			<td>for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colombia blood agar plates</td>
			<td>Becton Dickinson GmbH</td>
			<td>PA-254005.06</td>
			<td>agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3440</td>
			<td>Comuter with pressure pump software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>3904.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101969</td>
			<td>orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGM supplement Mix</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-39215</td>
			<td>supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 &#181;g / mL heparin, 1 &#181;g / mL Hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECGMS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22010</td>
			<td>culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>biochrome now Merck</td>
			<td>S 0415</td>
			<td>supplement for cell culture, used for infection analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8822</td>
			<td>stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic Unit</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10903</td>
			<td>fluidic unit for flow cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (porcine)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G-1890-100g</td>
			<td>for precoating of microslide channel surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-7250-10MG</td>
			<td>for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td>
			<td>primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc73268</td>
			<td>stock concentration: 200 &#181;g/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Port</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10820</td>
			<td>for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 35M</td>
			<td>inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td>physically modified slides for fludic cultivation (&#956;&#8211;Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 &#956;l, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td>For preparation of ECGMS medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Pump</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10905</td>
			<td>air pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer cell counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH&#38;Co KG</td>
			<td>40442002</td>
			<td>microscopic counting chamber for HUVECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td>for cross linking of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Set</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the &#181;-slide L0.4Luer, at 37&#176;C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cuvettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>67,741</td>
			<td>(2 x optic) for OD measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumococcus-specific antiserum</td>
			<td>Pineda</td>
			<td></td>
			<td>raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene or Styrofoam plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>v1.5.4</td>
			<td>Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes 1.5/ 2.0mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706/ 72.695.500</td>
			<td>required for antibody dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes with 50 mL volume</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>6,25,48,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP-expressing pneumococci</td>
			<td>National Collection of Type Cultures, Public Health England</td>
			<td>10,319</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serological pipets 5, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1253.025/ 86.1254.025</td>
			<td>for pipeting larger volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td>for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td>
			<td>P030.2</td>
			<td>used for PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Photometer Libra S22</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2115-20</td>
			<td>measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389-500G</td>
			<td>for preparation of blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pneumococcus infection of primary human endothelial cells in constant flow

Interaktion av Streptococcus pneumoniae med ytan av endotelceller förmedlas i blodflödet via mechanosensitive proteiner såsom von Willebrands faktorn (VWF). Detta glykoprotein förändrar dess molekylära konformation som svar på skjuvning stress, därigenom exponera bindningsställen för ett brett spektrum av värd-ligand interaktioner. I allmänhet är odling av primära endotelceller under ett definierat skjuvflöde känt för att främja den specifika cellulära differentieringen och bildandet av ett stabilt och tätt sammanlänkat endotelskikt som liknar fysiologin hos det inre fodret i ett blodkärl . Således kräver funktionell analys av interaktioner mellan bakteriella patogener och värd kärl med mechanosensitive proteiner inrättandet av pumpsystem som kan simulera de fysiologiska flödes krafterna som är kända för att påverka ytan av vaskulära celler.
Den mikroflödessystem enhet som används i denna studie möjliggör en kontinuerlig och diskuterar återcirkulation av vätskor med en definierad flödeshastighet. Det datorstyrda luft trycks pumpsystemet tillämpar en definierad skjuvbelastning på endotelcellytor genom att generera ett kontinuerligt, enkelriktat och kontrollerat medium flöde. Morfologiska förändringar av cellerna och bakteriell kvarstad kan mikroskopiskt övervakas och kvantifieras i flödet med hjälp av speciella kanalbilder som är utformade för mikroskopisk visualisering. I motsats till statisk cellkultur infektion, som i allmänhet kräver ett prov fixering före immun märkning och mikroskopiska analyser, den mikroflödessystem slides möjliggöra både fluorescens-baserad detektion av proteiner, bakterier, och cellulära komponenter efter prov upptagning; seriell immunofluorescenscfärgning; och direkt fluorescensbaserad detektion i realtid. I kombination med fluorescerande bakterier och specifika fluorescensmärkta antikroppar, denna infektion förfarande ger en effektiv multipel komponent visualisering system för ett stort spektrum av vetenskapliga tillämpningar relaterade till vaskulära processer.

Odling primär huvec i ett konstant enkelriktat flöde resulterar i bildandet av ett konflytande och tätt packade cellskikt som främjar generering av cellulära wpbs fylld med den mechanosensitive VWF13,14. Detta protokoll beskriver användningen av en luft trycks pump-baserade, diskuterar cirkulationssystem för infektions analys som kräver imitera skjuvning stress situationen i människans blodflöde.
Detta system möjliggör en d...

Watch this Scientific Journal Video about Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow at JoVE.com

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Denna studie beskriver den mikroskopiska övervakningen av pneumokocker anslutning till von Willebrands faktor strängar som produceras på ytan av differentierade mänskliga primära endotelceller under skjuvning stress i definierade flödesförhållanden. Detta protokoll kan utökas till detaljerad visualisering av specifika cellstrukturer och kvantifiering av bakterier genom att tillämpa differentiell immunofärgning procedurer.

Pneumokocker infektion av primära humana endotelceller i konstant flöde

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Användningen av detta endotelcellsodlingssystem möjliggör assimilering av situationen i blodflödet. Och med denna situation kan vi analysera bakteriella infektionsprocesser även med identifiering av bakterievektorer och även av cellvektorer som är involverade i denna process. Denna teknik banar väg för att utforska effekterna av bakteriella infektioner på den vaskulära integriteten, även inklusive påverkan på morfogenmekanismer, på inflammationssvar och immunreglering.Denna teknik kräver en viss speciell hantering av endotelcellerna och därför är en visuell beskrivning bättre än bara en verbal förklaring. Denna metod ger insikter i flera andra områden av forskning korrelerade med perfunderade vaskulär system såsom endotel cell differentiering, sårläkning, tumör genesis och angiogenes. Ett av nyckelstegen är standardiserad cellodling samt noggrann hantering av primära endotelceller.Denna teknik kräver några speciella cellkultur hantering som inte kunde vara klart genom att bara verbal förklaring. Till att börja, arbeta i en steril miljö med hjälp av en ren bänk. Använd en pipettering för att injicera 100 mikroliter av en 2%steril filtrerad porcin gelatin PBS lösning i en enda reservoar av en temperatur ekviliraterad kanal slide.Placera den gelatinbelagda kanalsglaset på en tunn polystyren- eller frigolitplatta för att förhindra att glidtemperaturen sjunker med en milliliter Luer-spruta för att lägga till 100 mikroliter av de fyra gångerna 10 till den femte per milliliter HUVEC-suspensionen i bilden för att seeda och odla HUVEC. Inkubera kanalspjälet med HUVEC i 60 minuter vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Efter det fyller du upp varje medium reservoar i båda ändar av kanalen glida med 60 mikroliter ekg-medel.Inkubera i ytterligare en timme vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Nästa, för att justera mikrofluidisk pump, först ansluta den ekvilomedelade perfusion inställd på pumpenheten, fyll med 13,6 milliliter EKGMS medium och starta pumpen kontroll programvara. I menyn för inställningen av fluidiska enheten väljer du den adekvata perfusionsuppsättningen och typ av kammarrutschbana med hjälp av rullen nedåt i fönstren.Välj 0.007 dyne sekund per kvadratcentimeter i mjukvaran för medelviskositet. Utanför inkubatorn, anslut en glasflaska fylld med torksilispärlor till lufttryckslangen. Välj flödesparametrar i programvarans meny, ställ in trycket på 40 millibar och spola pumprören med vätskemediet genom att starta det kontinuerliga mediumflödet.Vi säkerställer en stram cell fastsättning genom att använda subkonfluensa odlade HUVECs och dessutom fokusera på att få luftbubblor ur systemet samt med hjälp av oberoende strömförsörjning för pumpsystemet. Knacka vid slanganslutningarna för att ta bort luftbubblor och se till att inga luftbubblor cirkulerar i pumpsystemet. För anslutning av kanalsglaset, stoppa flödescirkulationen i pumpens reglerprogramvara och håll fast mellanflödet och perfusionsslangen genom att spänna fast rören nära Luer-anslutningen.Anslut kanalbilden och därigenom undvika luftbubblor. I pumpen kontroll programvara avancerade fliken, använd programvaran verktyget cykel skapare för att programmera önskad skjuvning stresscykler för flöde odling. Programmera skjuvningsstressnivåerna för flödescirkulation och starta långsiktig perfusion.Börja med fem dyne per kvadratcentimeter vilket motsvarar en flödeshastighet på 5,44 milliliter per minut under 30 minuter följt av kontinuerligt flöde vid skjuvningsstress på 10 dyne per kvadratcentimeter vilket motsvarar en flödeshastighet 10,85 milliliter per minut. Styrbalanserad reservoarpumpning. Placera fluidic enheten med den anslutna kanalsglaset i en inkubator på 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Starta mikroskopmjukvarans styrning och justera principinställningarna för den fluorescens mikroskopiska övervakningen genom att välja lämpliga filterinställningar. För mikroskopisk visualisering, placera den fluidiska enheten i 37 grader Celsius värmekammare. Placera kanalbilden på scenen i ett förkrigsmedsmikroskop.Kontrollera cellmorfologin och huvec-skiktens integritet före injektion av histamin och bakterier till flödescirkulationen. Underhåll flödesinställningen. Framkalla utsläpp av VWF från endotel viable Palade organ genom att injicera 136 mikroliter av en 100 millimolar histamin stamlösning genom en injektion port i EKGMS medium som cirkulerar i perfusion slangar.För immunofluorescens detektering av multimerized VWF strängar, injicera 20 mikrogram av en VWF specifika FITC konjugerad antikropp i en volym av 200 mikroliter pbs i cirkulerande 13,6 milliliter av EKGMS medium. För att kvantifiera Pneumokocktillsats till VWF-strängarna som genereras på HUVEC-cellytor injicerar du 1,35 gånger 10 till åttonde CFU per milliliter RFP som uttrycker Pneumokocker i en maximal volym på en milliliter i EKGMS-mediet med hjälp av injektionsporten. Välj en 63X olje nedsänkning mål för mikroskop förstoring och justera fluorescens filter inställningar i mikroskopet programvara till RFP kanal med en 540 nanometer detektion filter för detektering av RFP uttrycker Pneumokocker.För kvantifiering av bakteriell fastsättning till VWF-strängarna, skapa ögonblicksbilder av Z-stackar med minst 30 representativa fältvyer som var och en innehåller cirka 10 morfologiskt intakt HUVEC och räkna mängden Pneumokocker. För att utvärdera bakteriell fastsättning efter fixering före immunofluorescerande färgning, stoppa flödet, ta bort 10 milliliter EKGMS medium från pumpen reservoarer, och tillsätt 10 milliliter PBS kompletteras med 5%paraformaldehyd och fortsätt enligt manuskriptet. I detta protokoll börjar de experimentella stegen i principen med en förodling av primära endotelceller till delkonfluens i cellodlingskolvar.Celler är sedan sådd i en gelatin-belagda kanal slide. Bakterier odlas på agarplattor följt av odling i en komplex flytande medium till mitten log fas. För mikrofluidisk cellodling ansluts en kanalsglas med endotelceller till perfusionsrören i en fluidisk enhet i pumpsystemet och utsätts för konstant flöde för celldifferentiering.Genereringen av VWF strängarna var framkallas genom histamin injektion vid en skjuvning stress av 10 dyne sekund per kvadratcentimeter och mikroskopiskt övervakas av immunofluorescens upptäckt med hjälp fitc-märkt VWF specifika antikroppar. Efter injektion av röda fluorescens protein uttrycker bakterier till cirkulerande medium, Pneumococcus fastsättning till VWF strängarna var mikroskopiskt visualiseras i realtid genom fluorescens utsläpp vid 450 nanometer. Efter fixering av cellerna med hjälp av PFA, differentiell immunofluorescens färgning ger visualisering av bakteriell fastsättning vid specifika infektion tidspunkter.Det viktigaste steget i detta förfarande är att säkerställa en stram cell fastsättning på glidytan genom att justera fysiologiska skjuvning stressnivåer och undvika extrema pumpens tryck fluktuationer. Förutom den mikroskopiska visualiseringen kan denna teknik tillämpas för att studera farmakologiska effekter av nya anti-infective och även för att analysera långsiktiga konsekvenser av de vaskulära infektionsprocesserna. Detta pumpsystem perfuses bakteriella patogener genom lufttryck för att förhindra varje överföring via aerosoler.Det rekommenderas att följa de försiktighetsåtgärder som gäller biosäkerhet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Val av Plasmodium falciparum Parasiter för Cytoadhesion till Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Små RNA transfektion i primära humana Th17 celler genom Next Generation elektroporering

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...