Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

نود ان نعترف بالتمويل من منحه CIRM RB5-07409. J.M.M. يود ان يشكر FuiBoon كاي ، Dhruv ثازار ، وروجر اوريا للمناقشات المختلفة التي استرشدت الجيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه الطريقة. كما يشكر J.M.M. الزمالة الاستكشافية لشركه UCSF للدعم المستمر لعمله.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا المتعلقة باستخدام hESCs من قبل لجنه البحوث البشرية والاجنه والخلايا الجذعية (جسر) في جامعه كاليفورنيا سان فرانسيسكو.
1. اعداد رقاقه السيليكون مع ميزات هندسية
<ol><li>إنشاء ضوئي مع الميزات الهندسية المطلوبة. استخدام برامج الصياغة بمساعده ...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

لتبسيط بروتوكول طويل ومفصل ، وهذا الأسلوب يتكون من ثلاث مراحل حرجه: 1) توليد أنماط من الربط ECM وعلي الزجاج الشفتين ، 2) نقل أنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره من هلام ، و 3) البذر hESCs علي منقوشة هيدروجيل. وهناك خطوات حاسمه يجب النظر فيها في كل من هذه المراحل الثلاث. من أجل توليد أنماط ?...

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تحمل وعدا كبيرا لاستخدامها في الطب التجديدي وتطبيقات هندسه الانسجه. الطبيعة المستحثة لهذه الخلايا تمنحهم القدرة علي التفريق في اي نوع من أنواع الخلايا البالغة. وعلي الرغم من الخطوات الكبيرة التي تم القيام بها في توجيه مصير hESCs إلى أنواع معينه من الخلايا ، فقد ظل من الصعب جدا توليد انسجه كامله أو أجهزه من نوفو1،2،3،4، 5- ويرجع ذلك ، في جزء كبير منه ، إلى فهم محدود للأليات التي تقود تشكيل هذه الانسجه اثناء التنمية البشرية. ومن أجل سد هذه الفجوة في المعرفة ، برز عدد من الطرق في السنوات الاخيره لنمذجة الاجنه المبكرة والمراحل اللاحقة من التنمية مع الخلايا الجذعية الجنينية6،7،8،9 ،10،11،12،13.
بعد فتره وجيزة من اشتقاق الخطوط الاولي لل hESC14، ثبت ان الأجسام الجنينية التي تشكلت من hesc كانت قادره علي إنتاج خلايا تلقائيا من الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاثة6. ومع ذلك ، ونظرا للافتقار المتاصل في السيطرة علي حجم وشكل الأجسام الجنينية ، فان تنظيم الطبقات الجرثومية اختلف كثيرا وأخفق في مضاهاة تنظيم الجنين المبكر. في الاونه الاخيره ، وارفلش وآخرون وضعت طريقه لحصر مستعمرات hESCs علي ركائز الزجاج عن طريق ميكروباتيرنينج ، وتوفير السيطرة والاتساق علي حجم وهندسه المستعمرات8. وفي وجود BMP4 ، وهو من المتحولين المهمين في التنمية المبكرة ، كانت هذه المستعمرات المحصورة قادره علي التنظيم الذاتي لأنماط قابله للتكرار من المواصفات لمصائر تمثل الطبقات الجرثومية الاوليه. وعلي الرغم من ان هذا يوفر نموذجا مفيدا لدراسة أليات التي يتم بها إنشاء طبقات الجرثومية الاوليه ، فان أنماط تحديد المصير لم تتطابق تماما مع التنظيم والنشاه التي لوحظت اثناء تولد الاجنه15. وقد تحققت خلاصه أكثر إخلاصا للتنمية الجنينية المبكرة من خلال تضمين الشهادات في مصفوفة ثلاثية الابعاد (ECM) من المصفوفة11، وتوفير اقوي الادله حتى الآن لقدره hescs علي التنظيم الذاتي والنموذج المراحل المبكرة من الاجنه الجسم السابق. ومع ذلك ، فان هذه الطريقة تسفر عن نتائج غير متسقة التالي فهي تتنافى مع عدد من المقايسات التي يمكن استخدامها للكشف عن أليات الاساسيه للتنظيم الذاتي ومواصفات المصير.
النظر إلى هذه الأساليب القائمة والقيود الخاصة بكل منها ، سعينا إلى تطوير طريقه للتكرار المستعمرات hESC من الهندسي المحددة في الظروف التي نموذج البيئة خارج الخلية من الجنين في وقت مبكر. لتحقيق ذلك ، استخدمنا polyالاكريلاميد هيدروجيل من مرونة انضباطي للسيطرة علي الخواص الميكانيكية للركيزة. باستخدام المجهر القوه الذرية علي أجنه الدجاج مرحله التذوق ، وجدنا ان مرونة العدسة تراوحت من مئات باسكال إلى عدد قليل من kilopascals. وهكذا ، ركزنا علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع مرونة في هذا النطاق لتكون بمثابه الركيزة لمستعمرات hESC. قمنا بتعديل طرقنا السابقة لزراعه الدهون علي بولياكرياميد هيدروجيل7،9 لتوفير السيطرة القوية علي هندسه المستعمرات. حققنا هذا من قبل الأول زخرفه ECM ligands ، وهي الأمومي ، علي الزجاج coverslips من خلال الاستنسل المجهرية ، كما ذكرت سابقا16. ثم قمنا بتصميم تقنيه جديده لنقل الاربطه المنقوشة إلى سطح الهلام المائي بولياكريلاميد خلال البلمره. الأسلوب الذي وصفناه هنا ينطوي علي استخدام التصوير الضوئي لصنع رقاقه السيليكون مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وخلق الطوابع من الميزات الهندسية مع polydimethylsiloxane (PDMS) ، واستخدام هذه الطوابع لتوليد الاستنسل التي تسمح في نهاية المطاف زخرفه من يجند علي سطح الشفتين الزجاجية ونقل إلى بولياكرياميد.
بالاضافه إلى تلخيص البيئة الميكانيكية للجنين في وقت مبكر ، وحصر المستعمرات hESC علي polyالاكريلاميد تمكن قياس القوات المتولدة من الخلايا مع المجهر قوه الجر (TFM) ، كما ذكر في الطريقة السابقة9لدينا. باختصار ، يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا من حبات الفلورسنت في بولياكريلاميد وتستخدم كعلامات ايماني. وتحسب القوات المتولدة من الخلايا عن طريق تصوير أزاحه هذه الخرز بعد البذر hESCs علي الركيزة منقوشة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الجمع بين خرائط قوه الجر الناتجة مع المقايسات التقليدية ، مثل المناعة ، لدراسة كيف يمكن لتوزيع القوات المتولدة من الخلايا في مستعمرات التردد الضيق المحصورة ان ينظم أو يعدل الإشارات الاماميه. ونتوقع ان تكشف هذه الأساليب عن ان القوات الميكانيكية تلعب دورا حاسما في زخرفه مواصفات قدر الخلية خلال التنمية الجنينية المبكرة التي يتم تجاهلها حاليا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

تظهر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية قدره فريدة علي الاستجابة للموفوينات في المختبر من خلال أنماط التنظيم الذاتي لمواصفات مصير الخلية التي تتوافق مع تكوين الطبقة الجرثومية الاوليه اثناء الاجنه. التالي ، تمثل هذه الخلايا أداه قويه لدراسة أليات التي تدفع بالتنمية البشرية المبكرة. لقد وضعنا طريقه للثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز المتوافقة التي توفر السيطرة علي كل من هندسه المستعمرات وبيئتها الميكانيكية من أجل تلخيص المعلمات المادية التي تكمن وراء تولد الاجنه. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو القدرة علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع أنماط محدده من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي السطح لتعزيز المرفقات الخلية. ويتحقق ذلك عن طريق افتعال الاستنسل مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وذلك باستخدام هذه الاستنسل لخلق أنماط من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي الزجاج الشفتين ، ونقل هذه الأنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره. هذا الأسلوب هو أيضا متوافق مع المجهر قوه الجر ، مما يسمح للمستخدم لقياس وتعيين توزيع القوات التي تولدها الخلايا داخل المستعمرات المحصورة. في تركيبه مع اختبارات الكيمياء الحيوية القياسية ، ويمكن استخدام هذه القياسات لفحص دور العظة الميكانيكية اللعب في تحديد المصير و تخلق خلال التنمية البشرية في وقت مبكر.

التحدي الرئيسي الذي يجب التغلب عليه في محاولة للثقافة hESCs في مستعمرات الهندسة الخاضعة للرقابة علي ركائز متوافقة هو توليد نمط متجانس من ECM-ligand علي سطح الركيزة. وتتضمن الاستراتيجية المقدمة في هذه الطريقة أولا توليد النمط المطلوب علي سطح الزجاج الزجاجي ثم بعد ذلك نقل هذا ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

يمكن ان تكون منقوشة الدهون مصفوفة خارج الخلية علي المواد الهلامية بولياكريلاميد لتمكين ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز متوافقة. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع المجهر قوه الجر والاختبارات البيوكيميائية لفحص التفاعل بين هندسه الانسجه ، والقوات المتولدة من الخلايا ، ومواصفات مصير.

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

يسمح هذا البروتوكول للباحثين بثقافة مستعمرات الخلايا الجذعية على الهيدروجيل مع السيطرة الكاملة على كل من صلابة الهيدروجيل وهندسة المستعمرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بثقافة مستعمرات الخلايا الجذعية في ظروف تحاكي البيئة الفسيولوجية بشكل أفضل من البلاستيك ثقافة الأنسجة. عند تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى، تأكد من توليد عدد قليل من المواد الإضافية واستخدام ليغاند الفلورسنت بحيث يمكنك استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسينها في كل خطوة.تتضمن هذه التقنية خطوات متعددة تتضمن تحديد المواقع الدقيقة للمواد المختلفة. من الأسهل بكثير فهم التعليمات المكتوبة لهذا البروتوكول بمجرد رؤيتها يتم تنفيذه. لبدء هذا الإجراء، مزيج قاعدة PDMS مع عامل علاج PDMS في نسبة 10 إلى واحد حسب الوزن ومزيج شامل.Degas هذا الخليط في مجفف لمدة 30 إلى 60 دقيقة أو حتى تتم إزالة كل من فقاعات الهواء. ببطء وبتعادل صب خليط PDMS على سطح رقاقة أعدت. اضغط على الطبق على سطح العمل لإطلاق سراح أي فقاعات الهواء من سطح الرقاقة.خبز PDMS في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قطع PDMS إلى ما يقرب من 10 في 10 ملليمتر المربعات ، كل تحتوي على ميزات لحالة تجريبية واحدة. وسوف يشار إلى هذه الطوابع كأختام لبقية البروتوكول.بعد ذلك، قم بخلط قاعدة PDMS مع عامل علاج PDMS بنسبة ثمانية إلى واحد حسب الوزن، واخلطي جيداً. Degas الخليط في مجفف لمدة 30 إلى 60 دقيقة أو حتى تتم إزالة كل من فقاعات الهواء. المقبل، ببطء وبتعادل صب PDMS في طبق نظيفة 100 ملليمتر.اضغط على الطبق على سطح العمل للافراج عن أي فقاعات الهواء. خبز PDMS في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لكل طابع تم إنشاؤه سابقًا، قطع 15 في 15 ملليمتر مربع من PDMS.وسوف يشار إلى هذه الألواح المسطحة لبقية البروتوكول. عكس كل طابع ولدت على لوح مسطح من PDMS بحيث الميزات على حامل في اتصال مع لوح مسطح من PDMS. اضغط بلطف على الجزء العلوي من الطابع مع ملقط لضمان حتى الاتصال.المقبل، ووضع قطرة صغيرة من البوليمر UV-curable في واجهة أعلى من كل ختم وزوج لوح. سوف يكون البوليمر شريراً بين الاثنين بسبب التوتر السطحي الذي تساعده الجاذبية. ضع قطرة صغيرة من البوليمر UV-curable حول حواف واجهة الطابع وبلاطة.هذا يخلق الحدود التي سوف تعقد الحل يغاند. ثم ضع بعناية الطوابع وصفعة أزواج في مربع تعقيم الأشعة فوق البنفسجية. استخدم إعداد طاقة STR العقيمة وفضح لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، إزالة أزواج من مربع التعقيم الأشعة فوق البنفسجية واستخدام اثنين من أزواج من ملقط لإزالة بلطف الطابع في حين عقد أسفل لوح مسطح والاستنسل التي شكلت من البوليمر UV-curable. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية الاستنسل وعكس ذلك بحيث السطح الذي هو في اتصال مع لوح مسطح من PDMS تواجه لأعلى. ضع الاستنسل المقلوب مرة أخرى في صندوق تعقيم الأشعة فوق البنفسجية.استخدام إعداد السلطة STR العقيمة وفضح لمدة ثلاث دقائق. باستخدام ملقط، وضعت بعناية كل جانب الاستنسل شقة أسفل على غطاء حمض غسلها مع التأكد من أن تتركز الميزات على زلة الغطاء. ضع قطعة صغيرة من فيلم المختبر على رأس كل استنسل.اضغط بقوة وبشكل ثابت لأسفل على الاستنسل لإنشاء اتصال قوي بين الاستنسل وأغطية. ضع زلات الغلاف مع الاستنسل في طبق. ضع هذا الطبق في منظف البلازما وتطبيق البلازما عالية الطاقة لمدة 30 ثانية.ثم، ماصة الحل ligand على سطح كل استنسل. بالنسبة للستينيل المصنوعة من 10 في 10 ملليمتر الطوابع مربعة، وتطبيق 100 ميكروليتر في الاستنسل. بعد ذلك، لف الطبق الذي يحتوي على زلات الغلاف في فيلم المختبر واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.أولاً، اغسل غطاء الأغطية باستنسل باستخدام ملقط لغمره لفترة وجيزة في طبق يحتوي على PBS معقمة. غمر الغطاء مع الاستنسل في مرحلة ثانية من برنامج تلفزيوني لغسله مرة أخرى. إزالة الاستنسل من سطح غطاء مع الحرص على عدم كسر غطاء.بعد ذلك ، غمر الأغطية لفترة وجيزة في طبق يحتوي على مياه فائقة الخطورة لإزالة الأملاح من يغسل PBS. لمس حافة غطاء إلى مهمة حساسة مسح لإستباء المياه الزائدة بعيدا. جفف زلة الغطاء تحت غاز خامل مثل النيتروجين.ثم، إعداد حل بولياكريلاميد للحصول على مرونة هيدروجيل المطلوب. لكل غطاء منقوشة، وإعداد glutaraldehyde تنشيط أسفل يغطي الشفة مع مفتاح وضعت على القمة. ما بين 75 و 150 ميكرولترات من محلول البولي أكريلاميد إلى مركز كل الجلاتارالديهيد تنشيط الأغطية.باستخدام ملقط، ووضع نمط زلة لتغطية على كل الجلوتارالديهيد زلة الأغطية المنشطة مع polyacrylamide و spacer بحيث يواجه الليغاند منقوشة حل polyacrylamide. ضع بعناية كل شطيرة بولي أكريلاميد في حامل غطاء مع خيوط متوافقة مع أنابيب قاعية مخروطية 15 ملليلتر. المسمار أنبوب أسفل مخروطي 15 ملليلتر في كل حامل الغطاء لعقد السندويشات polyacrylamide في مكان.أجهزة الطرد المركزي إلى سندويشات polyacrylamide في الأنابيب في دلاء سوينغ في 200 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي ووضعها في رفوف أنبوب للحفاظ على التوجيه لمدة 50 دقيقة إضافية لضمان البلمرة الكاملة. ثم، إزالة السندويشات من الأنابيب وغمرها في برنامج تلفزيوني.لف الطبق في فيلم المختبر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات أو في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك، استخدم مشرط وملاطة لإزالة بعناية نمط لتغطية زلات وفواصل من شطيرة polyacrylamide في حين أنها لا تزال مغمورة في برنامج تلفزيوني. ضع كل غطاء مع بوليكريلاميد منقوشة في حامل الغطاء.مكان طوقا على رأس زلة الغطاء وحول polyacrylamide حيث كان موجودا في الفضاء. المسمار منشار قبالة أنبوب القاع المخروطية 15 ملليمتر في حامل الغطاء، وتشكيل بئر مع بوليكريلاميد منقوشة في الجزء السفلي. هذه التجميعات تندرج في آبار لوحة 12 جيدا القياسية لسهولة التعامل معها.عند تنفيذ هذه التقنية، استخدم رابطة فلورية لضمان إنشاء النمط المطلوب على سطح زلة الغطاء الزجاجي، ونقلها بنجاح إلى سطح هيدروجيل البولي أكريلاميد أثناء البلمرة. المقياس النهائي للنجاح لهذا الأسلوب هو القدرة على ثقافة hESCs في هندستها المطلوبة على الهيدروجيلات المنقوشة. عندما مثقف كما هو موضح في بروتوكول النص، تتكاثر hESCs عادة لإكمال الأشكال الهندسية منقوشة من 48 إلى 72 ساعة بمجرد إزالة Y27632 تماما من وسائل الإعلام.زراعة مستعمرات hESC في هندستها الضيقة على hydrogels polyacrylamide يسمح قياس قوى الجر التي تولدها الخلايا باستخدام المجهر قوة الجر. يتم إجراء هذه القياسات عن طريق تضمين مجهر الفلورس في الهيدروجيل وتصوير مواضع هذه الخرز قبل وبعد البذر hESCs. ويمكن استخدام صور مواضع الخرزة لتوليد خرائط لإزاحات الخرز التي يمكن استخدامها فيما بعد لحساب ضغوط الجر الأساسية.في المستعمرات الدائرية من hESCs ، تم العثور على أكبر ضغوط الجر بالقرب من الحافة الطرفية للمستعمرات ، في حين أن مركز المستعمرات يعرض ضغوطًا منخفضة بشكل موحد. على الرغم من التوزيعات غير موحدة لوحظ من ضغوط الجر، hESCs مثقف كدوائر منقوشة في ظروف الصيانة، عرض تعبير موحد من علامة متعددة الأطراف أكتوبر 3/4 وخلية التصاق جزيء E-cadherin. وستتيح هذه التقنية للباحثين أن يُحسنوا نمذجة الأجنة البشرية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رؤى مهمة حول كيفية تطور البشر.يمكن تكييف هذا الإجراء لأي تطبيق يهدف فيه الباحث إلى زراعة الخلايا في هندسات محددة على الهيدروجيلات الناعمة. هذا الإجراء متوافق مع معظم الأحماض الكيميائية الحيوية، مما يسمح للباحثين بالإجابة على أسئلة حول كيفية تأثير أشياء مثل هندسة الأنسجة والقوى المولدة للخلايا على التعبير عن البروتين وإشارات الخلايا. ويستخدم العديد من الباحثين الآن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لنموذج التنمية البشرية المبكرة.هذه التقنية سوف تسمح للباحثين للإجابة على هذه الأسئلة الهامة في الظروف التي تحاكي أفضل بيئة فسيولوجية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

تحسين مرفق من الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية على بولي (ε-caprolactone) خيوط Electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

طريقة ثقافية للحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية الكويسنت

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

السيطرة على هندسة الخلية من خلال الأشعة تحت الحمراء الليزر بمساعدة Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...