Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

我们想感谢CIRM赠款RB5-07409的资助。J.M.M.感谢FuiBoon Kai、DhruvThakar和RogerOria为指导这种方法的生成和故障排除进行的各种讨论。J.M.M.还感谢UCSF发现奖学金对他的工作的持续支持。

此处描述的所有与使用 hESCs 相关的方法均已获得加州大学旧金山分校人类游戏、胚胎和干细胞研究 （GESCR） 委员会的批准。
1. 具有几何特征的硅晶圆的制备
<ol><li>创建具有所需几何特征的照片蒙版。使用计算机辅助绘图软件设计功能。对于负光刻，使特征不透明，蒙版的其余部分透明。 注：对于在 18 mm 直径盖玻片上进行图案化，将每个实验条件的特征组合到 10 x 10 mm ?...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

为了简化一个漫长而详细的协议，此方法包括三个关键阶段：1） 在玻璃盖玻片上生成 ECM 配体图案，2） 在凝胶聚合过程中将图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶，以及 3） 在图案水凝胶。在这三个阶段中，每个阶段都必须考虑一些关键步骤。为了在玻璃盖玻上生成高保真图案，必须将模具牢固地压在盖玻片上，以防止配体溶液泄漏，并且必须在向模具表面添加配体溶液后清除所有气泡（<strong class="xfig...

人类胚胎干细胞（hESCs）在再生医学和组织工程应用中具有很大的应用前景。这些细胞的多能性质使它们能够分化成任何成人细胞类型。虽然在将hESCs的命运引向特定细胞类型方面已经取得巨大进展，但仍然很难产生整个组织或器官，即第1、2、3、4， 5.这在很大程度上是由于对在人类发展期间推动这些组织形成的机制了解有限。为了填补这一知识空白，近年来出现了一些方法，用胚胎干细胞6、7、8、9对早期胚胎及其发育阶段进行建模。 ，10，11，12，13.
在第一个hESC线14的产生后不久，证明由hESC形成的胚胎体能够自发地产生三个初级生殖层6的细胞。然而，由于对胚胎体的大小和形态固有的缺乏控制，生殖层组织差异很大，无法与早期胚胎的组织相匹配。最近，Warmflash等人开发了一种通过微模式将hESC的菌落限制在玻璃基板上的方法，从而对菌落8的大小和几何体提供控制和一致性。在BMP4（早期发育中的重要形态原）的存在下，这些受限菌落能够自组织地对代表主要生殖层的命运进行可重复的规格模式。虽然这为研究原始生殖层的建立机制提供了一个有用的模型，但命运规范的模式与胚胎发生过程中观察到的组织和形态形成不完全匹配。通过将hESCs嵌入母体11的三维细胞外基质（ECM）实现对早期胚胎发育的更忠实的回顾，为hESC自我组织和建模的能力提供了迄今为止最有力的证据胚胎形成的早期外体。但是，此方法会产生不一致的结果，因此与可用于揭示自组织和命运规范的基本机制的一些检测不兼容。
鉴于这些现有方法和各自的局限性，我们寻求开发一种方法，在模拟早期胚胎细胞外环境的条件下，对已定义的几何体的hESC菌落进行可重复的培养。为此，我们使用可调弹性的聚丙烯酰胺水凝胶来控制基材的机械性能。利用原子力显微镜对胃化阶段的鸡胚胎，我们发现表粒的弹性范围从几百帕斯卡到几千帕斯卡不等。因此，我们专注于生产具有弹性的聚丙烯酰胺水凝胶，作为hESC菌落的基质。我们修改了我们以前在聚丙烯酰胺水凝胶7、9上培养hESCs的方法，以对菌落的几何结构进行强有力的控制。我们通过首先将ECM配体（即母体凝胶）图案通过微制模具在玻璃盖上实现，如之前报道的16。然后，我们设计了一种新技术，在聚合过程中将图案配体转移到聚丙烯酰胺水凝胶的表面。我们在这里描述的方法包括使用光刻法来制造具有所需几何图案的硅晶片，用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 创建这些几何特征的图章，并使用这些图章生成模具，最终允许配体图案到玻璃盖玻片表面，并转移到聚丙烯酰胺。
除了重述早期胚胎的机械环境外，将hESC菌落限制在聚丙烯酰胺上，还能用牵引力显微镜（TFM）测量细胞产生的力，如我们之前的方法9所述。简而言之，荧光珠可以嵌入聚丙烯酰胺，并用作基准标记。通过将 hESCs 播种到图案基板上后，通过成像这些磁珠的位移来计算细胞生成的力。此外，生成的牵引力图可与传统测定（如免疫染色）相结合，以检查在密闭的 hESC 菌落中细胞生成力的分布如何调节或调节下游信号。我们期望这些方法将揭示，机械力在细胞命运规范的模式设计中起着关键作用，而目前这种发育是被忽视的。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

人类胚胎干细胞通过细胞命运规范的自组织模式，在胚胎形成过程中与原发生殖层形成相对应，表现出独特的能力，对体外形态作出反应。因此，这些细胞是一个强大的工具，用以检查推动早期人类发展的机制。我们开发了一种方法，在符合要求的基质的密闭菌落体中培养人类胚胎干细胞，以控制菌落的几何及其机械环境，以便重新概括物理参数，胚胎发生的基础。该方法的主要特点是能够生成具有定义细胞外基质配体的形态的聚丙烯酰胺水凝胶，以促进细胞附着。这是通过制造具有所需几何图案的模具，使用这些模具在玻璃盖玻片上创建细胞外基质配体图案，并在聚合过程中将这些图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶中来实现的。该方法还与牵引力显微镜兼容，允许用户测量和绘制在密闭菌落区内细胞生成力的分布图。结合标准生化测定，这些测量可用于检查机械线索在早期人类发展过程中的命运规范和形态形成中的作用。

试图在符合要求的基材上培养受控几何体中的 hESC 时，需要克服的主要挑战是在基材表面生成同质的 ECM-配体图案。此方法中提出的策略是首先在玻璃盖玻片表面生成所需的图案，然后在凝胶聚合过程中将该图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶表面（图1）因此，在进行水凝胶聚合和图案转移之前，必须确保在玻璃盖玻片表面成功创建所需的图?...

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Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

细胞外基质配体可以图案化在聚丙烯酰胺水凝胶上，使人类胚胎干细胞在符合要求的基质上的封闭菌落中培养。该方法可与牵引力显微镜和生化测定相结合，以检查组织几何、细胞生成力和命运规格之间的相互作用。

在符合标准的基质上对人类胚胎干细胞菌落的几何结构进行模式化，以控制组织级力学

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

该协议允许研究人员在水凝胶上培养干细胞菌落，完全控制水凝胶的刚度和菌落的几何形状。这项技术的主要优点是，它允许研究人员在比组织培养塑料更好的模拟生理环境的条件下培养干细胞菌落。首次执行此协议时，请确保生成一些额外的每种材料，并使用荧光配体，以便您在每个步骤中进行故障排除和优化。此技术涉及多个步骤，涉及各种材料的精确定位。一旦看到此协议执行后，就更容易理解该协议的书面说明。要开始此过程，请将 PDMS 基座与 PDMS 固化剂混合，按重量以 10 比 1 的比例混合，然后彻底混合。在干燥器中解气 30 至 60 分钟，或直到清除所有气泡。缓慢且均匀地将 PDMS 混合物倒在准备好的晶圆表面。点击工作表面上的盘，从晶圆表面释放任何气泡。PDMS 在 70 摄氏度下烘烤两小时，并允许其冷却至室温。然后将 PDMS 切成大约 10 到 10 毫米的正方形，每个都包含单个实验条件的特征。这些将被称为协议其余部分的标记。在此之后，将 PDMS 基座与 PDMS 固化剂混合，按重量按 8 比 1 的比例混合，然后彻底混合。将混合物在干燥器中解气 30 至 60 分钟，或直到清除所有气泡。接下来，缓慢而均匀地将 PDMS 倒入干净的 100 毫米盘中。点击工作表面上的盘子以释放任何气泡。PDMS 在 70 摄氏度下烘烤两小时，并允许其冷却至室温。对于以前生成的每个图章，切割 15 微 15 毫米的 PDMS。对于协议的其余部分，这些板将称为平板。将每个生成的图章倒置到 PDMS 的平板上，使支架上的特征与 PDMS 的平板接触。用钳子轻轻压在邮票顶部，以确保均匀接触。接下来，在每个邮票和板对的顶部界面放置一小滴紫外线固化聚合物。聚合物在重力辅助下的表面张力作用下，在两者之间会很邪恶。在冲压和板界面的边缘周围放置一小滴紫外线固化聚合物。这将创建一个边框，该边框将保存配体解决方案。然后小心地将邮票和拍打对放入紫外线灭菌盒中。使用无菌 STR 电源设置并曝光 10 分钟。在此之后，从紫外线灭菌箱中去除对，并使用两对钳子轻轻取出邮票，同时按住从 UV 固化聚合物形成的平板和模具。使用钳子，小心地拆下模具并将其反转，使与 PDMS 平板接触的表面朝上。将倒置的模具放回紫外线灭菌盒中。使用无菌 STR 电源设置并曝光三分钟。使用钳子，小心地将每个模具平放在酸洗盖玻片上，确保特征以盖滑为中心。在每个模具上放置一小块实验室薄膜。牢固且均匀地按下模具，在模具和盖玻片之间形成牢固的接触。将带模具的盖板放在盘子中。将这盘放在等离子清洁剂中，并应用高功率等离子 30 秒。然后，将配体溶液移液到每个模具的表面。对于由 10 张 10 毫米方形邮票制作的模具，每个模具应用 100 微升。之后，将含有盖板的盘子包裹在实验室膜中，并在四摄氏度下孵育过夜。首先，用模具清洗盖玻片，用钳子将盖玻片短暂地淹没在含有无菌 PBS 的盘中。将带模具的盖玻片淹没到 PBS 的第二阶段，再次清洗。从盖玻片表面取下模具，小心不要打破盖玻片。接下来，将盖玻片短暂地淹没在含有超纯水的盘中，以去除 PBS 洗涤中的盐。触摸盖玻片的边缘，以一个微妙的任务擦拭，以吸走多余的水。在惰性气体（如氮气）下干燥盖滑。然后，准备聚丙烯酰胺溶液，以获得所需的水凝胶弹性。对于每个图案盖玻片，准备一个谷胱甘肽激活的下盖唇，上面放置一个空格。75 至 150 微升多聚丙烯酰胺溶液之间的移液器，以每个谷胱甘肽激活盖玻片的中心。使用钳子，将图案覆盖滑到每个谷胱甘肽激活盖上，用聚丙烯酰胺和分流器滑动，使图案配体面对聚丙烯酰胺溶液。小心地将每个聚丙烯酰胺三明治放入一个盖架中，其螺纹与 15 毫升锥形底部管兼容。将 15 毫升锥形底部管拧入每个盖座，将聚丙烯酰胺三明治固定到位。在室温下以200倍G的200倍G离心至挥流桶管中的聚丙烯酰胺三明治，10分钟。从离心机中拆下管子，并将其放在管架中，以保持方向 50 分钟，以确保完全聚合。然后，从管子中取出三明治，将其淹没在 PBS 中。将菜用实验室膜包裹，在室温下孵育三小时或四摄氏度过夜。在此之后，使用手术刀和钳子小心地去除图案，以覆盖从聚丙烯酰胺三明治的滑移和空间，而它仍然淹没在PBS。将每个带图案聚丙烯酰胺的盖玻片放入盖座。垫片放在盖滑的顶部和垫片位于聚丙烯酰胺周围。将锯掉的 15 毫米锥形底部管拧入盖架，形成底部有图案的聚丙烯酰胺的井。这些组件可放入标准 12 孔板的孔中，便于操作。执行此技术时，使用荧光配体确保在玻璃盖滑表面创建所需的图案，并在聚合过程中成功转移到聚丙烯酰胺水凝胶表面。此方法最终的成功衡量标准是能够在图案水凝胶上所需的几何形状中培养 hESC。如文本协议中所述，当进行培养时，一旦 Y27632 从介质上完全删除，hESC 通常会激增，以完成图案几何，48 到 72 小时。在聚丙烯酰胺水凝胶上的密闭几何中培养hESC菌落，允许使用牵引力显微镜测量细胞产生的牵引力。这些测量通过在水凝胶中嵌入荧光微球，并在播种HESC之前和之后成像这些珠子的位置。珠子位置的图像可用于生成珠位移图，随后可用于计算基础牵引应力。在 HESC 的圆形菌落中，最大的牵引应力位于菌落的外围边缘附近，而菌落的中心显示均匀的低牵引力应力。尽管观察到牵引应力的不均匀分布，但海塞在维护条件下培养成图案圆，10 月 3 日至 4 日显示多能标记和细胞粘附分子 E-cadherin 的均匀表达。这项技术将使研究人员能够利用人类胚胎干细胞更好地模拟人类胚胎，最终对人类如何发育产生重要的见解。此过程可适用于研究人员旨在培养软水凝胶上定义几何体中的细胞的任何应用。该程序与大多数生化酸兼容，使研究人员能够回答有关组织几何和细胞生成力如何影响蛋白质表达和细胞信号的问题。许多研究人员现在利用人类胚胎干细胞来模拟早期人类发育。这项技术将使研究人员在更好地模拟生理环境的条件下回答这些重要问题。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

海藻酸钠微胶囊作为一个人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的繁殖和分化的3D平台，以不同的谱系

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

科研

生物工程

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

开发，扩展，<em&gt;在体内</em&gt;从人类胚胎干细胞（hESCs）监测人类NK细胞和诱导多能干细胞（iPS细胞）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

在光刻技术定义的聚对二甲苯-C细胞图案：二氧化硅<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

优化人骨髓间充质干细胞附着在聚（ε己内酯）静电纺纱线

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

使用粘性图案构建3D纸微流体装置

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

二维和三维 i 型胶原蛋白基质角质形成细胞增殖的评价

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞中的单细胞光学作用潜在测量

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Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

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Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

使用水凝胶图案化技术控制细胞粘附，用于牵引力显微镜的应用

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...