Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende finansieringen fra CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. vil gerne takke FuiBoon Kai, Dhruv thakar og Roger Oria for forskellige diskussioner, der guidede generering og fejlfinding af denne metode. J.M.M. også takke UCSF Discovery Fellowship for den løbende støtte af hans arbejde.

Alle metoder, der er beskrevet her vedrørende brugen af hESCs er blevet godkendt af human gamete, embryo og stamcelleforskning (GESCR) udvalg på University of California San Francisco.
1. fremstilling af silicium wafer med geometriske egenskaber
<ol><li>Opret en Mask med ønskede geometriske egenskaber. Brug computerstøttet redaktionel software til at designe funktionerne. Til brug med negative photoresist, gøre funktioner uigennemsigtige og resten af masken gennemsigtig. Bemærk: til...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

For at forenkle en lang og detaljeret protokol består denne metode af tre kritiske stadier: 1) generering af ECM ligand på glas dæksedler, 2) overførsel af mønstrene til polyacrylamid silicagelrogeler under Polymeriseringen af gelen og 3) såning af hESCs på mønstrede hydrogel. Der er kritiske skridt, der skal tages i betragtning i hver af disse tre etaper. For at skabe high-fidelity mønstre på glasset dæksedler, skal stencilen være solidt presset på dækglas for at forhindre lækage af ligand opløsning og a...

Humane embryonale stamceller (hESCs) holder stort løfte om anvendelse i regenerativ medicin og vævsteknik applikationer. Den pluripotente karakter af disse celler giver dem mulighed for at differentiere sig til enhver voksen celletype. Mens der er gjort store fremskridt med hensyn til at dirigere hESCs skæbne til bestemte celletyper, har det været meget vanskeligt at generere hele væv eller organer de Novo1,2,3,4, 5. Dette skyldes for en stor del, at en begrænset forståelse af de mekanismer, der drev dannelsen af disse væv under menneskelig udvikling. For at udfylde dette hul i viden er der i de senere år blevet udviklet en række metoder til at modellere det tidlige embryon og de efterfølgende udviklingsstadier med embryonale stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort efter afledningen af de første hESC linjer14, blev det påvist, at embryooide organer dannet af hESCs var i stand til spontant at producere celler af de tre primære kimlag6. Men på grund af den iboende mangel på kontrol over størrelsen og morfologi af embryooid organer, organiseringen af kimlag varierede betydeligt og undlod at matche organiseringen af det tidlige embryo. For nylig, Warmflash et al. udviklet en metode til at begrænse kolonier af hESCs på glas substrater via micropatterning, der giver kontrol og konsistens over størrelsen og geometri af kolonierne8. I nærværelse af BMP4, en vigtig morphogen i tidlig udvikling, disse lukkede kolonier var i stand til selv at organisere reproducerbare mønstre specifikation til skæbner, der repræsenterer de primære kimlag. Selv om dette gav en nyttig model for at studere de mekanismer, som primære kimlag er etableret, de mønstre af skæbne specifikation ikke præcist matche organisationen og morfogenesis observeret under embryo Genesis15. En mere trofast rekapitaliering af tidlig fosterudvikling blev opnået ved at indlejre hESCs i en tredimensionel ekstracellulær matrix (ECM) af matrigels11, hvilket giver de stærkeste beviser til dato for evnen af hESCs til selv-organisere og model de tidlige stadier af embryogenese ex vivo. Men denne metode giver inkonsekvente resultater og er derfor uforenelig med en række analyser, der kunne bruges til at afsløre de underliggende mekanismer for selvorganisering og skæbne specifikation.
I betragtning af disse eksisterende metoder og deres respektive begrænsninger søgte vi at udvikle en metode til reproducerbart dyrkning af hESC-kolonier af definerede geometrier under forhold, der modellere det ekstracellulære miljø i det tidlige embryon. For at opnå dette, brugte vi polyacrylamid silicagelrogeler af tunbar elasticitet til at kontrollere de mekaniske egenskaber af substratet. Ved hjælp af atomkraften mikroskopi på gastrulation-Stage kylling embryoner, vi fandt, at elasticiteten i epiblast varierede fra hundredvis af Pascal til et par kilopascals. Derfor fokuserede vi på at generere polyacrylamid silicagelrogeler med elasticitet i dette interval for at fungere som substrat for hesc-kolonier. Vi ændrede vores tidligere metoder til dyrkning af hESCs på polyacrylamid silicagelrogeler7,9 for at give solid kontrol over koloniens geometri. Vi opnåede dette ved første mønstring ECM ligands, nemlig matrigel, på glas dæksedler gennem mikrofremstillede stencils, som tidligere rapporteret16. Derefter designede vi en ny teknik til at overføre det mønstrede ligand til overfladen af polyacrylamid silicagelrogeler under Polymeriseringen. Den metode, vi beskriver her, involverer brug af fotolitografi til at fabrikere en silicium wafer med de ønskede geometriske mønstre, skabe stempler af disse geometriske egenskaber med Polydimethylsiloxan (PDMS), og ved hjælp af disse stempler til at generere de stencils, der i sidste ende tillader mønstret af ligand på overfladen af glas dæksedler og overførsel til polyacrylamid.
Ud over at rekapitulere det mekaniske miljø i det tidlige embryon gør det at begrænse hESC-kolonier på polyacrylamid det muligt at målecelle genererede kræfter med trækkraft mikroskopi (TFM), som rapporteret i vores tidligere metode9. Kort sagt kan fluorescerende perler indlejres i polyacrylamid og anvendes som fiducial markører. Celle genererede kræfter beregnes ved at afbilde forskydningen af disse perler efter såning af hESCs på det mønstrede substrat. Desuden kan de resulterende trækkraft kort kombineres med traditionelle assays, såsom immun farvning, at undersøge, hvordan fordelingen af celle-genererede kræfter i lukkede hESC kolonier kan regulere eller moduere downstream signalering. Vi forventer, at disse metoder vil afsløre, at mekaniske kræfter spiller en afgørende rolle i mønstret af celle skæbne specifikation under tidlig fosterudvikling, der i øjeblikket overset.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

Humane embryonale stamceller viser en unik evne til at reagere på morfogener in vitro ved selvorganiserende mønstre af celle skæbne specifikation, der svarer til primær kimlag dannelse under embryogenese. Således, disse celler repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge de mekanismer, der kører tidligt menneskelig udvikling. Vi har udviklet en metode til dyrkning af humane embryonale stamceller i lukkede kolonier på kompatible substrater, der giver kontrol over både Koloniernes geometri og deres mekaniske miljø for at rekapitulere de fysiske parametre, der ligger til grund for embryogenesis. Det vigtigste træk ved denne metode er evnen til at generere polyacrylamid silicagelrogeler med definerede mønstre af ekstracellulære matrix ligand på overfladen for at fremme celle fastgørelse. Dette opnås ved fabrikning stencils med de ønskede geometriske mønstre, ved hjælp af disse stencils til at skabe mønstre af ekstracellulære matrix ligand på glas dæksedler, og overføre disse mønstre til polyacrylamid silicagelrogeler under polymerisering. Denne metode er også kompatibel med Traction Force mikroskopi, så brugeren kan måle og kort fordelingen af celle-genererede kræfter inden for de lukkede kolonier. I kombination med standard biokemiske assays, kan disse målinger bruges til at undersøge den rolle mekaniske signaler spiller i skæbne specifikation og morfogenese under tidlig menneskelig udvikling.

Den største udfordring at overvinde i forsøget på at kultur hESCs i kolonier af kontrolleret geometri på kompatible substrater er at generere et homisk mønster af ECM-ligand på overfladen af substratet. Den strategi, der præsenteres i denne metode, indebærer først at generere det ønskede mønster på overfladen af en glas dækseddel og derefter overføre dette mønster til overfladen af en polyacrylamid hydrogel under polymerisering af gelen (figur 1</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Ekstracellulære matrix ligander kan mønstrede på polyacrylamid silicagelrogeler for at muliggøre kulturen af humane embryonale stamceller i indelukkede kolonier på kompatible substrater. Denne metode kan kombineres med Traction Force mikroskopi og biokemiske analyser for at undersøge samspillet mellem vævs geometri, celle genererede kræfter og skæbne specifikation.

Mønster for geometrien af humane embryonale stamcelle kolonier på kompatible substrater til kontrol af Vævsniveau mekanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Denne protokol giver forskerne mulighed for at dyrke stamcellekolonier på hydrogels med fuld kontrol over både stivheden af hydrogel og geometri kolonierne. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver forskerne mulighed for at kultur stamceller kolonier under forhold, der bedre efterligner det fysiologiske miljø end væv kultur plast. Når du udfører denne protokol for første gang, skal du sørge for at generere et par ekstra af hvert materiale og bruge en fluorescerende ligand, så du kan foretage fejlfinding og optimere ved hvert trin.Denne teknik indebærer flere trin, der involverer den præcise placering af forskellige materialer. Det er meget nemmere at forstå de skriftlige instruktioner til denne protokol, når du har set det udført. For at starte denne procedure, bland PDMS base med PDMS hærdningsmiddel på en 10 til et forhold efter vægt og bland grundigt.Afgas denne blanding i en ekssiccator i 30 til 60 minutter, eller indtil alle luftbobler er fjernet. Hæld langsomt og jævnt PDMS-blandingen over overfladen af den forberedte wafer. Bank skålen på arbejdsfladen for at frigøre eventuelle luftbobler fra waferens overflade.Bag PDMS ved 70 grader Celsius i to timer og lad det køle af til stuetemperatur. Skær derefter PDMS i ca. 10 gange 10 millimeter firkanter, der hver indeholder funktionerne for en enkelt eksperimentel tilstand. Disse vil blive omtalt som frimærker for den resterende del af protokollen.Derefter blandes PDMS-basen med PDMS-hærdningsmiddel i forholdet mellem otte og én efter vægt, og blandes grundigt. Afgas blandingen i en ekssiccator i 30 til 60 minutter, eller indtil alle luftbobler er fjernet. Dernæst langsomt og jævnt hæld PDMS i en ren 100 millimeter skål.Tryk på skålen på arbejdsfladen for at frigøre luftbobler. Bag PDMS ved 70 grader Celsius i to timer og lad det køle af til stuetemperatur. For hvert tidligere genereret stempel skal du skære et 15 gange 15 millimeter kvadrat af PDMS.Disse vil blive omtalt som flade plader for resten af protokollen. Inverter hver genereret stempel på en flad plade af PDMS sådan, at funktionerne på standen for i kontakt med en flad plade af PDMS. Tryk forsigtigt på toppen af stemplet med vicesser for at sikre jævn kontakt.Dernæst placere en lille dråbe UV-hærdige polymer på toppen interface af hvert stempel og plade par. Polymeren vil være ond mellem de to af overfladespænding bistået af tyngdekraften. Placer en lille dråbe af UV-hærdning polymer omkring kanterne af stempel og plade interface.Dette skaber en kant, der holder ligandløsningen. Derefter forsigtigt placere stempel og slag par i en UV sterilisation boks. Brug den sterile STR-effektindstilling, og udsæt i 10 minutter.Derefter skal du fjerne parrene fra UV-steriliseringsboksen og bruge to par vicesser til forsigtigt at fjerne stemplet, mens du holder den flade plade og stencil nede, der dannes fra den UV-hærdelige polymer. Brug hænde, forsigtigt fjerne stencil og invertere det således, at overfladen, der er i kontakt med den flade plade af PDMS vender opad. Placer de omvendte stencils tilbage i UV-steriliseringsboksen.Brug den sterile STR-effektindstilling, og udsæt i tre minutter. Ved hjælp af kraftbeslag, omhyggeligt placeret hver stencil flad side ned på en syre vasket coverslip og sørg for, at funktionerne er centreret på dækslet slip. Placer et lille stykke laboratoriefilm oven på hver stencil.Tryk godt og jævnt ned på stencilen for at skabe stærk kontakt mellem stencilen og dækslæbet. Læg dækslet med stencils i en skål. Sæt denne parabol i en plasma renere og anvende high-power plasma i 30 sekunder.Derefter pipette ligand løsning på overfladen af hver stencil. For stencils lavet af 10 gange 10 millimeter kvadratiske frimærker, anvende 100 mikroliter pr stencil. Efter dette, wrap fadet indeholder dækslet glider i laboratoriefilm og inkuberes ved fire grader Celsius natten over.Først vaskes dækslæden med stencil ved hjælp af vinkler til kortvarigt at nedsænke den i en skål, der indeholder steril PBS. Nedsænk dækslingen med stencil i en anden fase af PBS for at vaske den igen. Fjern stencilen fra overfladen af dækslæbet, og pas på ikke at bryde dækslæbet.Dernæst nedsænkes dækslet kortvarigt i en skål, der indeholder ultrarent vand, for at fjerne salte fra PBS vasker. Tryk på kanten af dækslet til en delikat opgave tørre at væge væk overskydende vand. Tør dækslet under en inert gas som nitrogen.Derefter forberede en polyarylamid løsning for at opnå den ønskede hydrogel elasticitet. For hver mønstret coverslip, forberede en glutaraldehyd aktiveret bunddæksler læbe med en spacer placeret på toppen. Pipette mellem 75 og 150 mikroliter polyarylamidopløsning til midten af hver glutaraldehyd aktiveret coverslip.Brug af en hændel, placere en mønstret til at dække slip på hver glutaraldehyd aktiveret dækker slip med polyacrylamid og spacer sådan, at den mønstrede ligand vender polyacryamid opløsning. Hver polyabruamidesandwich anbringes forsigtigt i en hætteholder med tråde, der er kompatible med 15 milliliter koniske bundrør. Skru et 15 milliliter konisk bundrør ind i hver hætteholder for at holde polyarylamidsandwicherne på plads.Centrifuge til polyarylamid sandwich i rørene i swing spande på 200 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern rørene fra centrifugen og læg dem i rørstativer for at opretholde retningen i yderligere 50 minutter for at sikre fuld polymerisering. Fjern derefter sandwicherne fra rørene og nedsænk dem i PBS.Wrap skålen i laboratoriet film og inkubere ved stuetemperatur i tre timer eller ved fire grader Celsius natten over. Derefter skal du bruge en skalpel og en vis for omhyggeligt at fjerne mønsteret til at dække glider og afstandsfra polyakrylamid sandwich, mens det forbliver nedsænket i PBS. Placer hver dækslet med mønstret polyaylamid i en hætteholder.Pakningssted oven på dækslet og omkring polyarylamiden, hvor afstandsuddeleren var placeret. Skru en savet-off 15 millimeter konisk bundrør i hætten indehaveren, danner en brønd med den mønstrede polyarylamid i bunden. Disse samlinger passer ind i brøndene på en standard 12 brøndplade for nem håndtering.Når du udfører denne teknik, skal du bruge en fluorescerende ligand for at sikre, at det ønskede mønster er skabt på overfladen af glasdækslet slip, og held overføres til overfladen af polyarylamid hydrogel under polymerisering. Det ultimative mål for succes for denne metode er evnen til at dyrke HESCs i ønskede geometrier på de mønstrede hydrogels. Når hESCs er dyrket som beskrevet i tekstprotokollen, formeres hESC'erne typisk for at fuldende de mønstrede geometrier med 48 til 72 timer, når Y27632 er helt fjernet fra mediet.Dyrkning af hESC-kolonier i lukkede geometrier på polyacrylamidhydrogeler gør det muligt at måle cellegenererede trækkraftkræfter ved hjælp af trækkraftmikroskopi. Disse målinger foretages ved at integrere fluorescensmikrosfærer i hydrogel og billeddannelse af disse perlers positioner før og efter såning af HESC'er. Billederne af perlepositionerne kan bruges til at generere kort over perleforskydninger, som efterfølgende kan bruges til at beregne de underliggende trækkraftbelastninger.I cirkulære kolonier af HESC'er findes de største trækkraftbelastninger nær koloniernes perifere kant, mens koloniernes centrum udviser ensartet lav trækkraft. På trods af de observerede ikke-ensartede fordelinger af trækkraft belastninger, hESCs dyrket som mønstrede cirkler i vedligeholdelsesforhold, vise ensartet udtryk for pluripotency markør Oktober 3 / 4 og celle adhæsion molekyle E-cadherin. Denne teknik vil gøre det muligt for forskere bedre at modellere menneskelige embryoner ved hjælp af menneskelige embryonale stamceller i sidste ende fører til vigtig indsigt i, hvordan mennesker udvikler sig.Denne procedure kan tilpasses til enhver anvendelse, hvor en forsker har til formål at dyrke celler i definerede geometrier på bløde hydrogels. Denne procedure er kompatibel med de fleste biokemiske syrer, så forskerne kan besvare spørgsmål om, hvordan ting som vævsgeometri og cellegenererede kræfter påvirker proteinudtryk og cellesignalering. Mange forskere bruger nu menneskelige embryonale stamceller til at modellere tidlig menneskelig udvikling.Denne teknik vil give forskerne mulighed for at besvare disse vigtige spørgsmål under forhold, der bedre efterligner et fysiologisk miljø.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning på fotolitografisk Defineret Parylene-C: SiO<sub&gt; 2.</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimering Binding af humane mesenchymstamceller på Poly (ε-caprolacton) elektrospundne Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Brug Adhesive mønstret Konstruér 3D Paper mikrofluidenheder

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Evaluering af keratinocytter spredning på to - og tre - dimensionelle Type I kollagen substrater

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kultur metode til at opretholde hvilende humane hæmatopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Kontrol af cellegeometri gennem infrarød laserassisteret mikromaling

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Kontrol af celle vedhæftning ved hjælp af Hydrogel mønstre teknikker til applikationer i Traction Force Mikroskopi

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...