Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

Wir möchten die Finanzierung aus dem CIRM-Zuschuss RB5-07409 bestätigen. J.M.M. dankt FuiBoon Kai, Dhruv Thakar und Roger Oria für verschiedene Diskussionen, die die Generierung und Fehlerbehebung dieser Methode geleitet haben. J.M.M. dankt auch dem UCSF Discovery Fellowship für die kontinuierliche Unterstützung seiner Arbeit.

Alle hier beschriebenen Methoden zur Verwendung von hESCs wurden vom Human Gamete, Embryo and Stem Cell Research (GESCR) Committee der University of California San Francisco zugelassen.
1. Herstellung von Siliziumwafer n. B. mit geometrischen Merkmalen
<ol><li>Erstellen Sie eine Fotomaske mit den gewünschten geometrischen Features. Verwenden Sie computergestützte Entwurfssoftware, um die Funktionen zu entwerfen. Für die Verwendung mit negativem Photoresist, machen Features undurchsichtig ...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

Um ein langes und detailliertes Protokoll zu vereinfachen, besteht diese Methode aus drei kritischen Stufen: 1) Erzeugung von ECM-Ligand auf Glasabdeckungen, 2) Übertragung der Muster auf Polyacrylamid-Hydrogele während der Polymerisation des Gels und 3) Saat-HESCs auf der gemusterten Hydrogel. Es gibt kritische Schritte, die in jeder dieser drei Phasen berücksichtigt werden müssen. Um auf den Glasabdeckungen Hochtreuemuster zu erzeugen, muss die Schablone fest auf den Deckelbeschlag gedrückt werden, um ein Auslaufe...

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) versprechen den Einsatz in der regenerativen Medizin und in der Gewebetechnik. Die pluripotente Natur dieser Zellen gibt ihnen die Möglichkeit, in jeden adulten Zelltyp zu differenzieren. Während große Fortschritte bei der Leitung des Schicksals von hESCs auf bestimmte Zelltypen gemacht wurden, ist es sehr schwierig geblieben, ganze Gewebe oder Organe de novo1,2,3,4, 5. Dies ist zu einem großen Teil auf ein begrenztes Verständnis der Mechanismen zurückzuführen, die die Bildung dieser Gewebe während der menschlichen Entwicklung vorantreiben. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind in den letzten Jahren eine Reihe von Methoden zur Modellierung des frühen Embryos und der nachfolgenden Entwicklungsstadien mit embryonalen Stammzellen6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kurz nach der Ableitung der ersten hESC-Linien14wurde nachgewiesen, dass embryoide Körper aus hESCs in der Lage waren, spontan Zellen der drei primären Keimschichten6zu produzieren. Aufgrund der inhärenten mangelnden Kontrolle über die Größe und Morphologie von embryoiden Körpern variierte die Organisation der Keimschichten jedoch erheblich und entsprach nicht der Organisation des frühen Embryos. In jüngerer Zeit entwickelten Warmflash et al. eine Methode, um Kolonien von hESCs auf Glassubstraten mittels Mikromusterung einzugrenzen, die Kontrolle und Konsistenz über die Größe und Geometrie derKolonien8 . In Gegenwart von BMP4, einem wichtigen Morphogen in der frühen Entwicklung, waren diese begrenzten Kolonien in der Lage, sich selbst reproduzierbare Spezifisierungsmuster an Schicksale zu organisieren, die die primären Keimschichten darstellen. Obwohl dies ein nützliches Modell für die Untersuchung der Mechanismen darstellte, mit denen primäre Keimschichten hergestellt werden, entsprachen die Muster der Schicksalsspezifikation nicht genau der Organisation und Morphogenese, die während der Embryogenese15beobachtet wurden. Eine getreuere Rekapitulation der frühen embryonalen Entwicklung wurde erreicht, indem hESCs in eine dreidimensionale extrazelluläre Matrix (ECM) von Matrigel11eingebettet wurden, was den bisher stärksten Beweis für die Fähigkeit von hESCs zur Selbstorganisation und Modellierung lieferte. die frühen Stadien der Embryogenese ex vivo. Diese Methode führt jedoch zu inkonsistenten Ergebnissen und ist daher unvereinbar mit einer Reihe von Assays, die verwendet werden könnten, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Selbstorganisation und Schicksalsspezifikation aufzudecken.
Angesichts dieser bestehenden Methoden und ihrer jeweiligen Grenzen versuchten wir, eine Methode zur reproduzierbaren Kultivierung von hESC-Kolonien definierter Geometrien unter Bedingungen zu entwickeln, die die extrazelluläre Umgebung des frühen Embryos modellieren. Um dies zu erreichen, verwendeten wir Polyacrylamid-Hydrogele mit abstimmbarer Elastizität, um die mechanischen Eigenschaften des Substrats zu steuern. Mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie an Hühnerembryonen im Gastrulationsstadium fanden wir heraus, dass die Elastizität des Epiblasts von Hunderten von Pascal bis zu einigen Kilopascal reichte. So konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen mit Elastizität in diesem Bereich, um als Substrat für hESC-Kolonien zu dienen. Wir haben unsere bisherigen Methoden zur Kultivierung von hESCs auf Polyacrylamid-Hydrogelen7,9 modifiziert, um eine robuste Kontrolle über die Geometrie der Kolonien zu ermöglichen. Dies gelang uns durch das erste Mustern von ECM-Liganden, nämlich Matrigel, auf Glashüllen durch mikrofabrizierte Schablonen, wie bereits berichtet16. Wir haben dann eine neuartige Technik entwickelt, um den gemusterten Liganden während der Polymerisation auf die Oberfläche von Polyacrylamid-Hydrogelen zu übertragen. Die Methode, die wir hier beschreiben, besteht darin, die Photolithographie zu verwenden, um einen Siliziumwafer mit den gewünschten geometrischen Mustern herzustellen, Stempel dieser geometrischen Merkmale mit Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen und diese Stempel zu verwenden, um die Schablonen zu erzeugen, die schließlich erlauben, Denligand auf die Oberfläche von Glasabdeckungen zu mustern und zu Polyacrylamid zu übertragen.
Neben der Rekapitulation der mechanischen Umgebung des frühen Embryos ermöglicht die Beschränkung von hESC-Kolonien auf Polyacrylamid die Messung zellgenerierter Kräfte mit Traktionskraftmikroskopie (TFM), wie in unserer vorherigen Methode9berichtet. Kurz gesagt, fluoreszierende Perlen können in das Polyacrylamid eingebettet und als Treuhandmarker verwendet werden. Zellgenerierte Kräfte werden berechnet, indem die Verschiebung dieser Perlen nach dem Aussaat von hESCs auf das gemusterte Substrat abgebildt wird. Darüber hinaus können die resultierenden Traktionskraftkarten mit traditionellen Assays wie Derimmunfärbung kombiniert werden, um zu untersuchen, wie die Verteilung zellgenerierter Kräfte in begrenzten hESC-Kolonien die nachgeschaltete Signalisierung regulieren oder modulieren kann. Wir erwarten, dass diese Methoden zeigen werden, dass mechanische Kräfte eine entscheidende Rolle bei der Musterung der Zellschicksalsspezifikation während der frühen embryonalen Entwicklung spielen, die derzeit übersehen wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

Menschliche embryonale Stammzellen zeigen eine einzigartige Fähigkeit, auf Morphogene in vitro zu reagieren, indem sie selbstorganisierende Muster der Zellschicksalsspezifikation, die der primären Keimschichtbildung während der Embryogenese entsprechen. Somit stellen diese Zellen ein mächtiges Werkzeug dar, mit dem die Mechanismen untersucht werden können, die die frühe menschliche Entwicklung vorantreiben. Wir haben eine Methode entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu kultivieren, die sowohl die Geometrie der Kolonien als auch ihre mechanische Umgebung kontrolliert, um die physikalischen Parameter zu rekapitulieren, die embryogenese. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die Fähigkeit, Polyacrylamid-Hydrogele mit definierten Mustern von extrazellulärem Matrixliganden an der Oberfläche zu erzeugen, um die Zellanhaftung zu fördern. Dies wird erreicht, indem Schablonen mit den gewünschten geometrischen Mustern hergestellt, diese Schablonen verwendet werden, um Muster aus extrazellulärem Matrixliganden auf Glasabdeckungen zu erzeugen, und diese Muster während der Polymerisation auf Polyacrylamid-Hydrogele übertragen werden. Diese Methode ist auch mit der Traktionskraftmikroskopie kompatibel, so dass der Benutzer die Verteilung der zellgenerierten Kräfte innerhalb der begrenzten Kolonien messen und abbilden kann. In Kombination mit biochemischen Standardtests können diese Messungen verwendet werden, um die Rolle zu untersuchen, die mechanische Hinweise bei der Schicksalsspezifikation und Morphogenese bei der frühen menschlichen Entwicklung spielen.

Die größte Herausforderung, die es zu bewältigen gilt, hESCs in Kolonien kontrollierter Geometrie auf konformen Substraten zu kultizieren, besteht darin, ein homogenes Muster von ECM-Ligand auf der Oberfläche des Substrats zu erzeugen. Die bei dieser Methode vorgestellte Strategie besteht darin, zunächst das gewünschte Muster auf der Oberfläche eines Glasdeckels zu erzeugen und dieses Muster anschließend während der Polymerisation des Gels auf die Oberfläche eines Polyacrylamidh...

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Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Stammzellkolonien auf Hydrogelen mit vollständiger Kontrolle über die Steifigkeit des Hydrogels und die Geometrie der Kolonien zu kultitoren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Forschern ermöglicht, Stammzellkolonien unter Bedingungen zu kultiieren, die die physiologische Umgebung besser imitieren als Gewebekultur-Kunststoff. Achten Sie bei der ersten Durchführung dieses Protokolls darauf, ein paar zusätzliche Stellmittel für jedes Material zu generieren und einen fluoreszierenden Liganden zu verwenden, damit Sie bei jedem Schritt Fehler beheben und optimieren können.Diese Technik umfasst mehrere Schritte, die die präzise Positionierung verschiedener Materialien beinhalten. Es ist viel einfacher, die schriftlichen Anweisungen für dieses Protokoll zu verstehen, sobald Sie gesehen haben, dass es ausgeführt wurde. Um dieses Verfahren zu beginnen, mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu eins nach Gewicht und mischen Sie gründlich.Entgasen Sie diese Mischung in einem Trockengrund für 30 bis 60 Minuten oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Die PDMS-Mischung langsam und gleichmäßig über die Oberfläche des vorbereiteten Wafers gießen. Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen von der Oberfläche des Wafers zu lösen.Backen Sie das PDMS bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie dann das PDMS in etwa 10 mal 10 Millimeter Quadrate, die jeweils die Merkmale für einen einzigen versuchsweise Zustand enthalten. Diese werden als Stempel für den Rest des Protokolls bezeichnet.Danach PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis von acht zu eins nach Gewicht mischen und gründlich mischen. Entgasen Sie das Gemisch in einem Trockenturm für 30 bis 60 Minuten oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Als nächstes gießen Sie das PDMS langsam und gleichmäßig in eine saubere 100-Millimeter-Schale.Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen zu lösen. Backen Sie das PDMS bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie für jeden zuvor erzeugten Stempel ein Quadrat von 15 mal 15 Millimetern PDMS.Diese werden für den Rest des Protokolls als Flachplatten bezeichnet. Invertieren Sie jeden erzeugten Stempel auf eine flache Platte von PDMS, so dass die Features auf dem Ständer für in Kontakt mit einer flachen Platte von PDMS. Drücken Sie vorsichtig auf die Oberseite des Stempels mit Zangen, um einen gleichmäßigen Kontakt zu gewährleisten.Als nächstes legen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtendes Polymer an die obere Schnittstelle jedes Stempel- und Plattenpaares. Das Polymer wird zwischen den beiden durch Oberflächenspannung durch Schwerkraft unterstützt böse sein. Legen Sie einen kleinen Tropfen des UV-härtenden Polymers an die Ränder der Stempel- und Plattenschnittstelle.Dadurch wird ein Rahmen erstellt, der die Ligandenlösung hält. Dann legen Sie den Stempel vorsichtig und schlagen Paare in eine UV-Sterilisationsbox. Verwenden Sie die sterile STR-Leistungseinstellung und legen Sie 10 Minuten frei.Danach entfernen Sie die Paare aus der UV-Sterilisationsbox und verwenden Sie zwei Zangenpaare, um den Stempel vorsichtig zu entfernen, während Sie die flache Platte und Schablone, die sich aus dem UV-härtenden Polymer gebildet haben, gedrückt halten. Entfernen Sie die Schablone mit Zangen vorsichtig und invertieren Sie sie so, dass die Oberfläche, die mit der flachen Platte von PDMS in Berührung kommt, nach oben gerichtet ist. Legen Sie die invertierten Schablonen wieder in die UV-Sterilisationsbox.Verwenden Sie die sterile STR-Leistungseinstellung und legen Sie sie drei Minuten lang frei. Mit Zangen, legen Sie sorgfältig jede Schablone flache Seite nach unten auf eine Säure gewaschen Abdeckungschlupf, um sicherzustellen, dass die Funktionen auf dem Deckel-Slip zentriert sind. Legen Sie ein kleines Stück Laborfolie auf jede Schablone.Drücken Sie fest und gleichmäßig auf die Schablone, um einen starken Kontakt zwischen der Schablone und dem Coverslip herzustellen. Legen Sie die Deckelschlüpfer mit Schablonen in eine Schüssel. Legen Sie diese Schale in einen Plasmareiniger und wenden Sie Hochleistungsplasma für 30 Sekunden auf.Dann pipette die Ligandenlösung auf die Oberfläche jeder Schablone. Für Schablonen aus 10 mal 10 Millimeter quadratischen Stempeln 100 Mikroliter pro Schablone auftragen. Danach die Schale mit den Deckelschlüpfern in Laborfolie wickeln und über Nacht bei vier Grad Celsius brüten.Waschen Sie zunächst den Deckelmitschablon mit Schablone, indem Sie Zangen verwenden, um ihn kurz in eine Schüssel mit sterilem PBS zu tauchen. Untertauchen Sie den Deckelmitschablon enden mit Schablone in eine zweite Stufe von PBS, um ihn wieder zu waschen. Entfernen Sie die Schablone von der Oberfläche des Deckels, wobei Sie darauf achten, den Abdeckzettel nicht zu brechen.Als nächstes tauchen Sie den Deckelrutsch kurz in eine Schüssel mit reinem Wasser, um Salze aus den PBS-Wäschen zu entfernen. Berühren Sie die Kante des Deckelslipzufahrt zu einem empfindlichen Aufgabenwisch, um überschüssiges Wasser abzuleiten. Trocknen Sie den Deckel schlupf unter einem inerten Gas wie Stickstoff.Bereiten Sie dann eine Polyacrylamidlösung vor, um die gewünschte Hydrogelelastizität zu erhalten. Für jeden gemusterten Coverslip, bereiten Sie eine Glutaraldehyd aktiviert Boden bedeckt Lippe mit einem Abstandsraum auf der Oberseite platziert. Pipette zwischen 75 und 150 Mikroliter Polyacrylamidlösung in der Mitte jedes Glutaraldehyd aktivierten Deckelrutsches.Mit Zangen legen Sie einen gemusterten Schlupf auf jede Glutaraldehyd aktiviert Abdeckungen rutschen mit Polyacrylamid und Abstandsgeber, so dass der gemusterte Liganden zeigt sich der Polyacrylamid-Lösung. Legen Sie jedes Polyacrylamid-Sandwich vorsichtig in einen Kappenhalter mit Gewinden, die mit 15 Milliliter konischen Bodenrohren kompatibel sind. Schrauben Sie ein 15 Milliliter konisches Unterrohr in jeden Kappenhalter, um die Polyacrylamid-Sandwiches an Ort und Stelle zu halten.Zentrifuge zu Polyacrylamid-Sandwiches in den Rohren in Schwenkeimern bei 200-fachem G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie in Rohrregale, um die Orientierung für weitere 50 Minuten zu halten, um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten. Entfernen Sie dann die Sandwiches aus den Rohren und tauchen Sie sie in PBS ein.Die Schale in Laborfolie wickeln und bei Raumtemperatur drei Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius brüten. Danach verwenden Sie ein Skalpell und Zange, um vorsichtig das Muster zu entfernen, um Slips und den Abstandsraum aus dem Polyacrylamid-Sandwich zu bedecken, während er in PBS versunken bleibt. Platzieren Sie jeden Deckelrutsch mit gemusterten Polyacrylamid in einen Kappenhalter.Dichtungsort auf der Oberseite des Deckels und um das Polyacrylamid, wo sich der Abstandser befand. Schrauben Sie ein abgesästes 15 Millimeter konisches Unterrohr in den Kappenhalter und bilden einen Brunnen mit dem gemusterten Polyacrylamid an der Unterseite. Diese Baugruppen passen für eine einfache Handhabung in die Bohrungen einer Standard 12 Wellplatte.Verwenden Sie bei dieser Technik einen fluoreszierenden Liganden, um sicherzustellen, dass das gewünschte Muster auf der Oberfläche des Glasdeckelschlupfes entsteht und während der Polymerisation erfolgreich auf die Oberfläche des Polyacrylamidhydrogels übertragen wird. Das ultimative Erfolgsmaß für diese Methode ist die Fähigkeit, hESCs in gewünschten Geometrien auf den gemusterten Hydrogelen zu kultitonischen. Wenn die hESCs wie im Textprotokoll beschrieben kultiviert werden, vermehren sie sich in der Regel, um die gemusterten Geometrien um 48 bis 72 Stunden abzuschließen, sobald der Y27632 vollständig aus dem Medium entfernt wurde.Die Kultivierung von hESC-Kolonien in begrenzten Geometrien auf Polyacrylamid-Hydrogelen ermöglicht die Messung zellgenerierter Traktionskräfte mittels Traktionskraftmikroskopie. Diese Messungen werden durch Einbettung von Fluoreszenzmikrosphären in das Hydrogel und Bildgebung der Positionen dieser Perlen vor und nach der Aussaat von hESCs durchgeführt. Die Bilder der Perlenpositionen können verwendet werden, um Karten von Perlenverschiebungen zu erzeugen, die anschließend zur Berechnung der zugrunde liegenden Traktionsspannungen verwendet werden können.In kreisförmigen Kolonien von hESCs finden sich die größten Traktionsspannungen in der Nähe des randnahen Rands der Kolonien, während das Zentrum der Kolonien gleichmäßig niedrige Zugspannungen aufweisen. Trotz der beobachteten ungleichmäßigen Verteilungen von Traktionsspannungen zeigen hESCs, die als gemusterte Kreise unter Wartungsbedingungen kultiviert werden, eine einheitliche Expression des Pluripotenzmarkers Okt 3/4 und des Zelladhäsionsmoleküls E-Cadherin. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, menschliche Embryonen mithilfe menschlicher embryonaler Stammzellen besser zu modellieren, was letztlich zu wichtigen Erkenntnissen über die Entwicklung des Menschen führt.Dieses Verfahren kann für jede Anwendung angepasst werden, bei der ein Forscher darauf abzielt, Zellen in definierten Geometrien auf weichen Hydrogelen zu kultiieren. Dieses Verfahren ist mit den meisten biochemischen Säuren kompatibel und ermöglicht es Forschern, Fragen darüber zu beantworten, wie Dinge wie Gewebegeometrie und zellgenerierte Kräfte die Proteinexpression und Zellsignalisierung beeinflussen. Viele Forscher verwenden heute menschliche embryonale Stammzellen, um die frühe menschliche Entwicklung zu modellieren.Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, diese wichtigen Fragen unter Bedingungen zu beantworten, die eine physiologische Umgebung besser nachahmen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
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Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

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Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...