Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

CIRM助成金RB5-07409からの資金提供を認めしたいと思います。J.M.M.は、この方法の生成とトラブルシューティングを導いた様々な議論のために、フイブーンカイ、ドゥルヴ・タカール、ロジャー・オリアに感謝したいと思います。J.M.M.はまた、UCSFディスカバリー・フェローシップに感謝し、彼の仕事を継続的にサポートしてくださった。

HESCの使用に関してここに記載されているすべての方法は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のヒトゲームテ、胚および幹細胞研究(GESCR)委員会によって承認されています。
1. 幾何学的特徴を持つシリコンウェーハの準備
<ol><li>目的のジオメトリ フィーチャを持つフォトマスクを作成します。コンピュータ支援の製図ソフトウェアを使用して、機能を設計します。...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

長く詳細なプロトコルを簡素化するために、この方法は、1)ガラスカバースリップ上のECMリガンドのパターンを生成する、2)ゲルの重合時にポリアクリルアミドヒドロゲルにパターンを移す、および3)上のhESCのシードという3つの重要な段階で構成されています。パターン化されたヒドロゲル。これらの 3 つの段階のそれぞれで考慮する必要がある重要な手順があります。ガラスカバースリッ?...

ヒト胚性幹細胞(HESC)は、再生医療や組織工学の応用に大きな期待を寄せています。これらの細胞の多能性の性質は、それらに任意の成人細胞タイプに分化する能力を与える。hESCの運命を特定の細胞型に導く上で大きな進歩がなされているが、組織全体や器官de novo1、2、3、4を生成することは非常に困難なままである。 5.これは、大部分は、ヒトの発達中にこれらの組織の形成を駆動するメカニズムの限られた理解に起因する。この知識のギャップを埋めるために、近年、胚幹細胞6、7、8、9を用いて初期胚とその後の発達段階をモデル化する方法が数多く出現している。 ,10,11,12,13.
第1hESCライン14の導出直後に、HESCから形成された胚体体が3つの一次生殖層6の細胞を自発的に産生することができることが実証された。しかし、胚体の大きさと形態に対する本質的な制御の欠如のために、生殖層の組織は有意に変化し、初期胚の組織と一致しなかった。さらに最近では、Warmflashらは、マイクロパターニングを介してガラス基板上のHESCのコロニーを閉じ込める方法を開発し、コロニー8のサイズと形状に対する制御と一貫性を提供した。初期の開発における重要な形態原であるBMP4の存在下で、これらの限定コロニーは、一次胚芽層を表す運命に対する仕様の再現可能なパターンを自己組織化することが可能であった。これは、原発性生殖層が確立されるメカニズムを研究するための有用なモデルを提供したが、運命指定のパターンは、胚形成時に観察された組織および形態形成と正確に一致しなかった15。初期胚発生のより忠実な要約は、マトリゲル11の3次元細胞外マトリックス(ECM)にHESCを埋め込むことによって達成され、HESCが自己組織化し、モデル化する能力に関するこれまでで最も強力な証拠を提供した。胚発生の初期段階は生体内である。しかし、この方法は一貫性のない結果をもたらし、自己組織化と運命指定の根本的なメカニズムを明らかにするために使用できる多くのアッセイと互換性がありません。
これらの既存の方法とそれぞれの限界を考えると、我々は初期胚の細胞外環境をモデル化する条件下で定義された幾何学のhESCコロニーを再現可能に培養する方法を開発しようとした。これを達成するために、我々は、基板の機械的特性を制御するために、調整弾性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用しました。胃の胚に原子力顕微鏡を用いて、エピブラストの弾力性は数百個のパスカルから数キロパスカルまで及ぶことがわかった。そこで、hESCコロニーの基板として機能するために、この範囲で弾力性のあるポリアクリルアミドヒドロゲルの生成に焦点を当てました。我々は、コロニーの幾何学を堅牢に制御するために、ポリアクリルアミドヒドロゲル7、9上でHESCを培養するための以前の方法を変更した。我々は、以前に報告された16のように、マイクロファブリファリングステンシルを介してガラスカバーリップ上のECMリガンド、すなわちマトリゲルを最初にパターン化することによってこれを達成しました。その後、重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面にパターン化されたリガンドを移す新しい技術を設計した。ここで説明する方法は、所望の幾何学的パターンでシリコンウェーハを製造するためにフォトリソグラフィーを使用し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)でこれらの幾何学的特徴のスタンプを作成し、これらのスタンプを使用してステンシルを生成することを含みます。最終的には、ガラスカバーの表面にリガンドのパターニングを可能にし、ポリアクリルアミドに転送します。
初期胚の機械的環境を要約することに加えて、ポリアクリルアミドにhESCコロニーを閉じ込め、我々の前の方法9で報告したように、牽引力顕微鏡(TFM)を用いて細胞発生力の測定を可能にする。簡単に言えば、蛍光ビーズはポリアクリルアミドに埋め込まれ、受託マーカーとして使用することができる。細胞発生力は、パターン基板にHESCを播種した後のこれらのビーズの変位をイメージングすることによって計算される。さらに、得られた牽引力マップは、免疫染色などの従来のアッセイと組み合わせて、閉じ込められたhESCコロニーにおける細胞発生力の分布が下流シグナリングを調節または調節する方法を調べることができます。これらの方法は、現在見過ごされている初期の胚発生時に、機械的な力が細胞運命仕様のパターン化において重要な役割を果たしていることを明らかにすることを期待する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

ヒト胚性幹細胞は、胚発生時の一次胚層形成に対応する細胞運命仕様の自己組織化パターンにより、インビトロでモルフォゲンに応答するユニークな能力を示す。したがって、これらの細胞は、初期の人間の発達を駆動するメカニズムを調べる強力なツールを表します。我々は、コロニーの幾何学と機械的環境の両方を制御する準拠基板上の閉じ込められたコロニーにヒト胚性幹細胞を培養する方法を開発した。胚発生の根にはこの方法の主な特徴は、細胞の付着を促進するために表面に細胞外マトリックスリガンドの定義されたパターンを有するポリアクリルアミドヒドロゲルを生成する能力である。これは、所望の幾何学的パターンを持つステンシルを製造し、これらのステンシルを使用してガラスカバーリップ上の細胞外マトリックスリガンドのパターンを作成し、重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルにこれらのパターンを移すことによって達成される。この方法はまた牽引力顕微鏡と互換性があり、ユーザーが限られたコロニー内の細胞発生力の分布を測定し、マッピングすることを可能にする。標準的な生化学的アッセイと組み合わせることで、これらの測定値を使用して、初期のヒト開発時の運命の仕様と形態形成における機械的手がかりの役割を調べることができます。

準拠基板上の制御された幾何学のコロニーでHESCを培養しようとする主な課題は、基板の表面にECM-リガンドの均質なパターンを生成することです。この方法で提示される戦略は、最初にガラスカバースリップの表面に所望のパターンを生成し、その後、ゲルの重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面にそのパターンを転送することを含みます(図1...

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Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

このプロトコルは、ヒドロゲルの剛性とコロニーの幾何学の両方を完全に制御して、ヒドロゲル上の幹細胞コロニーを培養することを可能にする。この技術の主な利点は、研究者が組織培養プラスチックよりも生理的環境をよりよく模倣する条件で幹細胞コロニーを培養することができるということです。このプロトコルを初めて実行する場合は、各ステップでトラブルシューティングと最適化ができるように、すべての材料を数個生成し、蛍光リガンドを使用してください。この手法には、さまざまな材料の正確な位置決めを含む複数のステップが含まれます。このプロトコルの説明書を理解する方が、このプロトコルを見た方が簡単です。この手順を開始するには、PDMSベースとPDMS硬化剤を10対1の重量比で混合し、十分に混合します。この混合物をデシケーターで30〜60分間、またはすべての気泡が除去されるまで脱気する。調製したウェハの表面上にPDMS混合物をゆっくりと均等に注ぎます。作業面の皿をタップして、ウエハの表面から気泡を放出します。PDMSを摂氏70度で2時間焼き、室温まで冷まします。その後、PDMSを約10~10ミリメートルの正方形に切断し、それぞれが単一の実験条件の特徴を含みます。これらは、プロトコルの残りの部分のスタンプと呼ばれます。この後、PDMSベースをPDMS硬化剤と混ぜ合わせ、8対1の重量比で、十分に混合します。30〜60分間、またはすべての気泡が除去されるまで、デシケータ中の混合物を脱気する。次に、ゆっくりと均等にきれいな100ミリメートル皿にPDMSを注ぎます。作業面の皿をタップして、気泡を放出します。PDMSを摂氏70度で2時間焼き、室温まで冷まします。以前に生成されたスタンプごとに、PDMSの15%15ミリメートル平方をカットします。これらは、プロトコルの残りの部分ではフラットスラブと呼ばれます。PDMS のフラットスラブに接触するスタンドの機能を PDMS のフラット なスラブに、生成された各スタンプを反転します。スタンプの上部を鉗子で軽く押して、接触を確実にします。次に、各スタンプとスラブペアの上部の界面に、UV硬化性ポリマーの小さな滴を置きます。ポリマーは重力によって助けとなる表面張力によって2つの間に邪悪になる。スタンプとスラブの界面のエッジの周りに、UV硬化性ポリマーの小さなドロップを配置します。これにより、リガンド溶液を保持する境界が作成されます。その後、慎重にスタンプを置き、UV滅菌ボックスにペアを平手打ち。滅菌STR電源設定を使用し、10分間公開します。この後、UV滅菌ボックスからペアを取り出し、2組の鉗子を使用して、UV硬化性ポリマーから形成された平らなスラブとステンシルを押さえながらスタンプをそっと取り除きます。鉗子を使用して、慎重にステンシルを取り外し、PDMSの平らなスラブに接触している表面が上向きになるように反転させます。反転したステンシルを UV 滅菌ボックスに戻します。滅菌STR電源設定を使用し、3分間公開します。鉗子を使用して、各ステンシルを平らに平らにして酸洗浄カバースリップに慎重に置き、特徴がカバースリップの中心であることを確認します。各ステンシルの上に小さな実験室のフィルムを置きます。ステンシルをしっかりと押し下げて、ステンシルとカバースリップの間に強い接触を作り出します。カバースリップを皿にステンシルで入れます。この皿をプラズマクリーナーに入れ、30秒間高出力プラズマを塗布します。次いで、リガンド溶液を各ステンシルの表面にピペットする。10~10ミリメートルの平方フィートから作られたステンシルの場合は、1枚あたり100マイクロリットルを適用します。この後、カバースリップを含む皿を実験室フィルムに包み、一晩摂氏4度でインキュベートします。まず、鉗子を使用して、滅菌PBSを含む皿に簡単に水没させることで、カバースリップをステンシルで洗います。カバースリップをステンシルに沈め、PBSの第2段階に浸し、再び洗浄します。カバースリップを壊さないために注意してカバースリップの表面からステンシルを取り外します。次に、超純水を含む皿にカバースリップを簡単に沈め、PBSの洗剤から塩を取り除きます。カバースリップの端を触って繊細な作業に拭き取り、余分な水を吸い取ります。カバースリップを窒素などの不活性ガスで乾燥させます。次いで、ポリアクリルアミド溶液を調製し、所望のヒドロゲル弾性を得る。パターン化されたカバースリップごとに、グルタルアルデヒド活性化ボトムカバーリップを上に置いたスペーサーで準備します。各グルタルアルデヒド活性化カバースリップの中心にポリアクリルアミド溶液の75と150マイクロリットル間のピペット。鉗子を使用して、パターン化されたリガンドがポリアクリルアミド溶液に面するようにポリアクリルアミドとスペーサーで各グルタルアルデヒド活性化カバースリップにスリップをカバーするパターンを置きます。慎重に15ミリリットルの円錐状の底管と互換性のあるスレッドを持つキャップホルダーに各ポリアクリルアミドサンドイッチを置きます。15 ミリリットルの円錐状の底管を各キャップ ホルダーにねじ込み、ポリアクリルアミド サンドイッチを所定の位置に保持します。管内のポリアクリルアミドサンドイッチに対する遠心分離機を、室温で10分間Gの200倍のGでスイングバケット内のチューブにサンドイッチする。遠心分離機からチューブを取り出し、チューブラックに入れて、さらに50分間配向を維持し、完全な重合を確実にします。その後、チューブからサンドイッチを取り出し、PBSに浸します。皿を実験室のフィルムで包み、室温で3時間または一晩摂氏4度でインキュベートします。この後、メスと鉗子を使用して、PBSに沈んだまま、ポリアクリルアミドサンドイッチからスリップとスペーサーをカバーするパターンを慎重に取り除きます。パターン化されたポリアクリルアミドを含む各カバースリップをキャップホルダーに入れる。カバースリップの上とスペーサーが置かれたポリアクリルアミドの周りにガスケットの場所。鋸で切った15ミリメートルの円錐形の底管をキャップホルダーにねじ込み、下部にパターン化されたポリアクリルアミドを付けて井戸を形成します。これらのアセンブリは容易な処理のための標準的な12の井戸の版の井戸に合う。この技術を行う場合、蛍光リガンドを使用して、ガラスカバースリップの表面に所望のパターンが作成され、重合時にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面に正常に転化することを確認します。この方法の成功の究極の尺度は、パターン化されたヒドロゲル上の所望の幾何学でhESCを培養する能力である。テキストプロトコルで概説されているように培養すると、HESCは通常、Y27632がメディアから完全に取り除かれると、パターン化されたジオメトリを48〜72時間完了するために増殖します。ポリアクリルアミドヒドロゲル上の閉じ込められた幾何学でhESCコロニーを培養することは牽引力顕微鏡を使用して細胞発生の牽引力の測定を可能にする。これらの測定は、蛍光微小球をヒドロゲルに埋め込み、hESCを播種する前後にこれらのビーズの位置をイメージングすることによって行われます。ビード位置のイメージを使用して、ビード変位のマップを生成し、その後、基礎となるトラクション応力の計算に使用できます。hESCの円形コロニーでは、最大の牽引応力はコロニーの周辺端付近に見られ、コロニーの中心は一様に低い牽引応力を示す。観察されたトラクションストレスの不均一な分布にもかかわらず、維持条件でパターン化された円として培養されたhESCは、多能性マーカー10月3/4および細胞接着分子E-カドヘリンの均一な発現を示す。この技術により、研究者はヒト胚性幹細胞を使用してヒト胚をより良くモデル化し、最終的にはヒトがどのように発達するかについての重要な洞察につながる。この手順は、研究者が柔らかいヒドロゲル上の定義された幾何学中の細胞を培養することを目指すあらゆる用途に適応することができる。この手順は、ほとんどの生化学的酸と互換性があり、研究者は、組織の幾何学や細胞生成力などのものがタンパク質発現および細胞シグナル伝達にどのような影響を与えるかについての質問に答えることを可能にする。多くの研究者は現在、初期のヒトの発達をモデル化するためにヒト胚性幹細胞を使用しています。この技術は、研究者が生理学的環境をよりよく模倣する条件でこれらの重要な質問に答えることを可能にする。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

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ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

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Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

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静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...