Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
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우리는 CIRM 교부금 RB5-07409에서 자금을 인정하고 싶습니다. J.M.M.은 이 방법의 생성과 문제 해결을 안내하는 다양한 토론에 대해 푸이분 카이, 드루프 타카르, 로저 오리아에게 감사드립니다. J.M.M.은 또한 UCSF 디스커버리 펠로우십에 그의 작품을 지속적으로 지원해 준 것에 감사드립니다.

hESCs의 사용에 관련된 여기에서 기술된 모든 방법은 캘리포니아 샌프란시스코 대학에 인간 Gamete, 태아 및 줄기 세포 연구 (GESCR) 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 기하학적 특징을 가진 실리콘 웨이퍼의 준비
<ol><li>원하는 기하학적 피쳐로 포토마스크를 작성합니다. 컴퓨터 지원 제도 소프트웨어를 사용하여 피처를 디자인합니다. 음수 포토레지스트와 함께 사용하십시오.<br...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

길고 상세한 프로토콜을 단순화하기 위해, 이 방법은 세 가지 중요한 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 유리 커버립에 ECM 리간드의 생성 패턴, 2) 겔의 중합 동안 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔로 패턴을 전송, 3) 에 시종 hESCs 패턴 하이드로겔. 이 세 단계 각각에서 고려해야 할 중요한 단계가 있습니다. 유리 커버립에 고충실도 패턴을 생성하기 위해 스텐실은 리간드 용액의 누출을 방지하기 위해 커?...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 재생 의학 및 조직 공학 응용 분야에서 사용하기위한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 이 세포의 다능성 성질은 그(것)들에게 어떤 성숙한 세포 모형으로 분화하는 기능을 줍니다. 특정 세포 유형에 hESCs의 운명을 지시에 큰 진전이 이루어진 동안, 그것은 전체 조직 또는 장기 de novo1,2,3,4를생성하는 것은 매우 어려운 남아있다 5. 이것은, 상당 부분에서, 인간 발달 도중 이 조직의 대형을 몰기 하는 기계장치의 한정된 이해 때문이. 지식의 이 격차를 메우기 위하여는, 배아줄기세포6,7,8,9를 가진 발달의 초기 태아 그리고 후속 단계를 모델링하는 방법의 수는 최근에 나타났습니다 ,10,11,12,13.
제1 hESC라인(14)의유도 직후, hESCs로부터 형성된 배아체가 3차 생식층6의세포를 자발적으로 생성할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 배아 체의 크기와 형태에 대한 통제의 본질적인 부족으로 인해, 배아 층의 조직은 크게 변화하고 초기 배아의 조직과 일치하지 못했다. 최근에는 Warmflash 등은 미세 패터닝을 통해 유리 기판에 hES의 식민지를 제한하는 방법을 개발하여 식민지의 크기와 기하학에 대한 제어 및 일관성을 제공합니다8. 초기 개발에서 중요한 모르포겐인 BMP4의 존재에서, 이러한 제한된 식민지는 1 차적인 세균 층을 나타내는 운명에 명세의 재현 가능한 패턴을 스스로 조직할 수 있었습니다. 이는 1차 생식층이 확립되는 기전을 연구하기 위한 유용한 모델을 제공했지만, 운명 명세의 패턴은 배아 발생 시 관찰된 조직 및 형태 형성과 정확하게 일치하지 않았다15. 초기 배아 발달의 보다 충실한 재수집은 matrigel11의3차원 세포 외 매트릭스(ECM)에 hESCs를 포함시킴으로써 달성되었으며, hESCs가 스스로 구성하고 모델링할 수 있는 능력에 대한 가장 강력한 증거를 제공합니다. 배아 발생 의 초기 단계 ex 생체. 그러나, 이 방법은 일관되지 않은 결과를 산출하고 따라서 자기 조직과 운명 명세의 근본적인 기계장치를 드러내기 위하여 이용될 수 있는 다수의 수의 검사와 호환되지 않습니다.
이러한 기존 방법과 각각의 한계를 감안할 때, 우리는 초기 배아의 세포 외 환경을 모델링하는 조건에서 정의 된 기하학의 hESC 콜로니를 재현 가능하게 배양하는 방법을 개발하고자했습니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 기판의 기계적 특성을 제어하기 위해 조정 탄성의 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔을 사용했다. 위분화 단계 닭 배아에 원자력 현미경 검사법을 사용하여, 우리는 epiblast의 탄성이 몇 킬로파스칼에 파스칼의 수백에서 구역 수색한다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리는 hESC 식민지를 위한 기판역할을 하기 위하여 이 범위에서 탄성을 가진 폴리아크릴아미드 하이드로겔생성에 집중했습니다. 우리는 콜로니의 기하학에 대한 강력한 제어를 제공하기 위해 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔7,9에 hCS를 배양하기위한 우리의 이전 방법을 수정했습니다. 우리는 이전에 보고 된바와같이, 마이크로 패브릭 스텐실을 통해 유리 커버 슬립에 ECM 리간드, 즉 matrigel을 먼저 패터닝하여 이를 달성했습니다. 그런 다음 중합 중에 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 패턴 리간드를 전달하는 새로운 기술을 설계했습니다. 여기서 설명하는 방법은 포토리소그래피를 사용하여 원하는 기하학적 패턴으로 실리콘 웨이퍼를 제작하고, 다디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 기하학적 특징의 스탬프를 만들고, 이러한 스탬프를 사용하여 스텐실을 생성하는 것을 포함합니다. 궁극적으로 유리 커버립의 표면에 리간드의 패터닝을 허용립과 폴리 아크릴 아미드로 전송.
초기 배아의 기계적 환경을 재요약하는 것 외에도, 폴리아크릴아미드에 hESC 콜로니를 제한하면 이전 방법9에보고된 바와 같이 견인력 현미경(TFM)으로 세포 생성 힘을 측정할 수 있습니다. 간단히 말해서, 형광 비드는 폴리아크릴아미드에 내장되어 수화물 마커로 사용될 수 있다. 세포 생성 힘은 패턴화된 기판 상에 hESCs를 시드한 후 이러한 비드의 변위를 이미징하여 계산됩니다. 또한, 생성된 견인력 맵은 면역 염색과 같은 전통적인 분석과 결합되어 제한된 hESC 콜로니에서 세포 생성 힘의 분포가 다운스트림 신호를 조절하거나 조절하는 방법을 조사할 수 있습니다. 우리는 이 방법들이 기계적 힘이 현재 간과되는 초기 배아 발달 도중 세포 운명 명세의 패터닝에 중요한 역할을 한다는 것을 밝힐 것으로 기대합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

인간 배아 줄기 세포는 배아 발생 시 1차 생식층 형성에 대응하는 세포 운명 사양의 자가 조직화 패턴에 의해 시험관내 모르포겐에 반응하는 독특한 능력을 입증한다. 따라서, 이 세포는 초기 인간 발달을 이끄는 기계장치를 검토하는 강력한 공구를 나타냅니다. 우리는 물리적 인 매개 변수를 재현하기 위해 식민지의 기하학과 기계적 환경 모두를 제어 할 수있는 준수 기질에 제한된 식민지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 배아 발생의 기초. 이 방법의 주요 특징은 세포 부착을 촉진하기 위해 표면에 세포 외 매트릭스 리간드의 정의 된 패턴과 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 생성하는 능력이다. 이것은 원하는 기하학적 패턴으로 스텐실을 제작하고, 이러한 스텐실을 사용하여 유리 커버슬립에 세포외 매트릭스 리간드패턴을 생성하고, 중합 중에 이러한 패턴을 폴리아크릴아미드 하이드로겔로 옮기는 것으로 달성됩니다. 이 방법은 또한 견인력 현미경 검사법과 호환되므로 사용자는 제한된 식민지 내에서 세포 생성 힘의 분포를 측정하고 매핑할 수 있습니다. 표준 생화학 분석과 함께, 이러한 측정은 초기 인간 개발 동안 운명 사양 및 형태 발생에서 기계적 단서가 재생역할을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

규정을 준수하는 기판상에서 제어된 기하학의 콜로니에서 hES를 배양하려고 시도할 때 극복해야 할 주요 과제는 기판의 표면에 ECM-리간드의 균질한 패턴을 생성하는 것이다. 이 방법에 제시된 전략은 먼저 유리 커버슬립의 표면에 원하는 패턴을 생성한 다음 겔의 중합 동안 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 그 패턴을 전달하는 것을포함한다(그림 ...

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Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

이 프로토콜을 통해 연구자들은 하이드로겔의 강성과 식민지의 기하학을 완벽하게 제어하여 하이드로겔에 줄기 세포 식민지를 배양할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 조직 배양 플라스틱보다 생리적 환경을 더 잘 모방하는 조건에서 줄기 세포 식민지를 배양할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜을 처음 수행할 때는 모든 물질을 몇 개 더 생성하고 각 단계에서 문제를 해결하고 최적화할 수 있도록 형광 리간드를 사용해야 합니다.이 기술은 다양한 재료의 정확한 위치를 포함하는 여러 단계를 포함한다. 이 프로토콜이 수행된 것을 본 후에는 이 프로토콜에 대한 서면 지침을 이해하는 것이 훨씬 쉽습니다. 이 절차를 시작하려면 PDMS 베이스를 PDMS 경화제와 10 대 1 비율로 혼합하고 완전히 혼합하십시오.이 혼합물을 건조기에서 30~60분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 탈가스를 제거합니다. 준비된 웨이퍼의 표면에 PDMS 혼합물을 천천히 고르게 붓습니다. 작업 표면의 접시를 탭하여 웨이퍼 표면에서 기포를 방출합니다.PDMS를 섭씨 70도에서 2시간 동안 굽고 실온으로 식힙니다. 그런 다음 PDMS를 약 10mm 사각형으로 잘라내고 각각 단일 실험 조건에 대한 특징을 포함합니다. 이를 프로토콜의 나머지 부분에 대한 우표라고 합니다.그 후 PDMS 베이스를 PDMS 경화제와 8대 1의 비율로 혼합하고 철저히 섞는다. 30~60분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 혼합물을 건조기에서 탈가스로 드게합니다. 다음으로 PDMS를 100mm 의 깨끗한 접시에 천천히 고르게 붓습니다.작업 표면의 접시를 탭하여 기포를 방출합니다. PDMS를 섭씨 70도에서 2시간 동안 굽고 실온으로 식힙니다. 이전에 생성된 각 스탬프에 대해 15mm 의 PDMS 사각형을 잘라냅니다.이를 프로토콜의 나머지 부분에 대해 플랫 슬래브로 지칭됩니다. 생성된 각 스탬프를 PDMS의 평평한 슬래브에 반전하여 스탠드의 피쳐가 PDMS의 평평한 슬래브와 접촉하도록 합니다. 스탬프 상단을 집게로 부드럽게 눌러 접촉도 보장합니다.다음으로, 각 스탬프와 슬래브 쌍의 상단 인터페이스에 UV 치료 가능한 폴리머의 작은 방울을 놓습니다. 중합체는 중력에 의해 지원 표면 장력에 의해 둘 사이에 사악할 것입니다. 스탬프 및 슬래브 인터페이스의 가장자리에 UV 치료 가능한 폴리머의 작은 방울을 놓습니다.이렇게 하면 리간드 솔루션을 보유하는 테두리가 만들어집니다. 그런 다음 조심스럽게 스탬프를 놓고 쌍을 UV 살균 상자에 넣습니다. 멸균 STR 전원 설정을 사용하고 10 분 동안 노출하십시오.그 후, UV 살균 상자에서 쌍을 제거하고 UV 치료 가능한 폴리머에서 형성 된 평평한 슬래브와 스텐실을 누르면서 부드럽게 스탬프를 제거하기 위해 두 쌍의 집게를 사용합니다. 집게를 사용하여 스텐실을 조심스럽게 제거하고 PDMS의 평평한 슬래브와 접촉하는 표면이 위를 향하고 있도록 반전하십시오. 반전된 스텐실을 UV 멸균 상자에 다시 넣습니다.멸균 STR 전원 설정을 사용하고 3 분 동안 노출하십시오. 집게를 사용하여 각 스텐실 플랫 사이드를 산세척 커버슬립에 조심스럽게 배치하여 커버 슬립에 특징이 중심이 되도록 합니다. 각 스텐실 위에 실험실 필름의 작은 조각을 배치합니다.스텐실과 커버슬립 사이의 강한 접촉을 만들기 위해 스텐실을 단단히 고르게 누릅니다. 커버 슬립을 스텐실로 접시에 놓습니다. 이 접시를 플라즈마 클리너에 넣고 고출력 플라즈마를 30초 간 적용합니다.그런 다음 리간드 용액을 각 스텐실의 표면에 파이펫합니다. 10~10mm 평방 스탬프로 만든 스텐실의 경우 스텐실당 100마이크로리터를 적용하십시오. 그 후, 실험실 필름에 커버 슬립이 들어있는 접시를 감싸고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오.먼저 집게를 사용하여 커버슬립을 스텐실로 씻어 멸균 PBS가 함유된 접시에 잠깐 담급한다. 커버슬립을 스텐실로 침수하여 PBS의 두 번째 단계로 잠급하여 다시 씻어낸다. 커버슬립을 깨지 않도록 주의하여 커버슬립 표면에서 스텐실을 제거합니다.다음으로, PBS 세척에서 소금을 제거하기 위해 초순수물이 함유된 접시에 커버슬립을 잠깐 담급한다. 커버슬립의 가장자리를 터치하여 섬세한 작업 닦아 여분의 물을 심지냅니다. 질소와 같은 불활성 가스 아래 덮개 미끄러짐을 건조시십시오.이어서, 원하는 하이드로겔 탄성을 얻기 위해 폴리아크릴아미드 용액을 준비한다. 패턴이 있는 각 커버슬립에 대해, 위에 스페이서가 놓인 글루타랄데히드 활성화 된 바닥 커버 입술을 준비합니다. 각 글루타랄데히드 활성화 커버슬립의 중심에 폴리 아크릴아미드 용액의 75~150마이크로리터 사이의 파이펫.포셉을 사용하여 패턴 리간드가 폴리아크릴아미드 용액을 향하도록 폴리아크라이하이드 활성화 커버슬립과 폴리아크라일아미드를 장착한 스페이서에 슬립을 덮기 위해 패턴을 배치합니다. 각 폴리아크릴아미드 샌드위치를 15밀리리터 원추형 바닥 튜브와 호환되는 실이 있는 캡 홀더에 조심스럽게 배치합니다. 15 밀리리터 원추형 바닥 튜브를 각 캡 홀더에 나사로 고정하여 폴리아크릴아미드 샌드위치를 제자리에 고정시하십시오.원심분리기에서 폴리아크릴아미드 샌드위치를 스윙 버킷에 200회 G로 200회 G로 실온에서 10분간 샌드위치로 바릅니다. 원심분리기에서 튜브를 제거하고 튜브 랙에 배치하여 전체 중합을 보장하기 위해 50분 동안 방향을 유지합니다. 그런 다음 튜브에서 샌드위치를 제거하고 PBS에 담급니다.접시를 실험실 필름으로 감싸고 실온에서 3시간 또는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양합니다. 그 후 메스와 집게를 사용하여 PBS에 잠긴 채로 폴리아크라일아미드 샌드위치에서 슬립과 스페이서를 덮는 패턴을 조심스럽게 제거합니다. 각 커버슬립을 패턴 폴리아크라일아미드를 캡 홀더에 넣습니다.커버 슬립 의 상단과 스페이서가 위치한 폴리 아크릴 아미드 주위에 개스킷의 장소. 톱질된 15mm 원추형 바닥 튜브를 캡 홀더에 넣고 바닥에 패턴폴리아크라일라미드를 잘 형성합니다. 이 어셈블리는 쉽게 취급할 수 있는 표준 12 웰 플레이트의 우물에 적합합니다.이 기술을 수행할 때, 유리 커버 슬립의 표면에 원하는 패턴이 생성되고 중합 중에 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 표면으로 성공적으로 전달되도록 형광 리간드를 사용한다. 이 방법의 성공의 궁극적 인 척도는 패턴 하이드로겔에 원하는 형상에서 hESC를 배양 할 수있는 능력입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양하면 hESC는 일반적으로 Y27632가 미디어에서 완전히 제거되면 패턴 형상을 48~72시간 으로 완료합니다.폴리아크릴아미드 하이드로겔의 밀폐된 기하학에서 hESC 콜로니를 배양하면 견인력 현미경을 사용하여 세포에서 생성된 견인력의 측정이 허용됩니다. 이러한 측정은 하이드로겔에 형광 마이크로스피어를 포함하고 hESC를 시드하기 전과 후에 이러한 구슬의 위치를 이미징하여 이루어집니다. 비드 위치의 이미지는 비드 변위 맵을 생성하는 데 사용할 수 있으며, 이 변위는 기본 견인력 응력을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.hESC의 원형 식민지에서 가장 큰 견인 응력은 식민지의 주변 가장자리 근처에서 발견되며 식민지 의 중심은 균일하게 낮은 견인 응력을 표시합니다. 견인력의 관찰되지 않은 균일분포에도 불구하고, hESC는 유지보수 조건에서 패턴원으로 배양하고, 흉부 마커 10월 3/4및 세포 접착 분자 E-cadherin의 균일한 표현을 표시한다. 이 기술은 연구원이 인간 배아 줄기 세포를 사용하여 인간 배아를 더 잘 모델링하는 것을 가능하게 할 것입니다 궁극적으로 인간이 어떻게 발전하는지에 중요한 통찰력으로 이끌어 냅니다.이 절차는 연구원이 소프트 하이드로겔에 정의된 형상에서 세포를 배양하는 것을 목표로하는 모든 응용 분야에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 절차는 대부분의 생화학산과 호환되므로 연구자들은 조직 기하학과 세포 생성 힘과 같은 것이 단백질 발현 및 세포 신호에 미치는 영향에 대한 질문에 대답할 수 있습니다. 많은 연구원은 지금 초기 인간 발달을 모형하기 위하여 인간적인 배아 줄기 세포를 이용하고 있습니다.이 기술은 연구원이 더 나은 생리환경을 모방하는 조건에서 이 중요한 질문에 대답할 수 있게 해 줄 것입니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

연구

생체공학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

폴리 (ε 카프로 락톤) 전기 방사 원사에 인간 중간 엽 줄기 세포의 첨부 파일을 최적화

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...