Name: patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics
Uploaded: 2019-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

Biz CIRM hibe RB5-07409 gelen finansman kabul etmek istiyorum. J.M.M. fuiBoon Kai, Dhruv Thakar ve Roger Oria'ya bu yöntemin neslini ve sorun gidermelerini yönlendiren çeşitli tartışmalar için teşekkür eder. J.M.M. ayrıca UCSF Discovery Bursu'na çalışmalarının sürekli desteği için teşekkür eder.

Burada HESC kullanımı ile ilgili açıklanan tüm yöntemler California San Francisco Üniversitesi İnsan Gamete, Embriyo ve Kök Hücre Araştırma (GESCR) Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Geometrik özelliklere sahip silikon gofret hazırlanması
<ol><li>İstenilen geometrik özelliklere sahip bir fotomaske oluşturun. Özellikleri tasarlamak için bilgisayar destekli taslak yazılımını kullanın. Negatif photoresist ile kullanmak için, özellikleri opak ve maskenin geri ka...

<ol>
	<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).</li><li>Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering-derived+approaches+for+iPSC+preparation,+expansion,+differentiation+and+applications.">Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications.</a> Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).</li><li>Stevens, K. R., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Engineered+Tissues:+Clinical+Considerations.">Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+comprising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers.</a> Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+link+between+human+embryonic+stem+cell+organization+and+fate+using+tension-calibrated+extracellular+matrix+functionalized+polyacrylamide+gels.">Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels.</a> Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+developmental+force+distributions+in+reconstituted+embryonic+epithelia.">Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia.</a> Methods. 94, 101-113 (2016).</li><li>Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Mechanics+Orchestrate+Wnt-Dependent+Human+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).</li><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues.">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).</li><li>Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pluripotent+stem+cell-based+model+for+post-implantation+human+amniotic+sac+development.">A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development.</a> Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144, 976-985 (2017).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo.">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolding+guides+lumen+elongation+by+inducing+anisotropic+intercellular+mechanical+tension.">Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).</li></ol>

Uzun ve ayrıntılı bir protokolü basitleştirmek için, bu yöntem üç kritik aşamadan oluşur: 1) cam kapaklar üzerinde ECM ligand desenleri üreten, 2) jel polimerizasyonu sırasında poliakrilamid hidrojeller için desenler transfer, ve 3) üzerinde tohumlama hESCs desenli hidrojel. Bu üç aşamanın her birinde göz önünde bulundurulması gereken kritik adımlar vardır. Cam kapaklarda yüksek doğruluk desenleri oluşturmak için, ligand çözeltisinin sızmasını önlemek için şablon kapak kapağına s?...

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere büyük umut tutun. Bu hücrelerin pluripotent doğası onlara herhangi bir yetişkin hücre tipi ne kadar ayırt etme yeteneği verir. HESC'lerin kaderini belirli hücre tiplerine yönlendirmede büyük adımlar atılsa da, tüm doku veya organların oluşturulması çok zor kalmıştır de novo1,2,3,4, 5. Bunun nedeni, büyük ölçüde, insan gelişimi sırasında bu dokuların oluşumunu sürücü mekanizmaların sınırlı bir anlayış. Bilgideki bu boşluğu doldurmak için, embriyonik kök hücreler6,7,8,9 ile erken embriyo ve sonraki gelişim aşamalarını modellemek için son yıllarda bir dizi yöntem ortaya çıkmıştır ,10,11,12,13.
İlk hESC hatlarının türetilmesinden kısa bir süre sonra14, hESC'lerden oluşan embriyoid cisimlerin üç ana mikrop tabakasının hücrelerini kendiliğinden üretebildiği gösterilmiştir6. Ancak, embriyoid cisimlerin büyüklüğü ve morfolojisi üzerinde kontrol doğal eksikliği nedeniyle, mikrop katmanları nın organizasyonu önemli ölçüde çeşitli ve erken embriyo organizasyonu maç başarısız oldu. Daha yakın zamanlarda, Warmflash ve ark. mikro desenleme yoluyla cam yüzeyler üzerinde hESC kolonileri sınırlamak için bir yöntem geliştirdi, kolonilerin boyutu ve geometrisi üzerinde kontrol ve tutarlılık sağlayan8. Erken gelişimde önemli bir morfojen olan BMP4'ün varlığında, bu sınırlı koloniler birincil mikrop tabakalarını temsil eden kaderlere göre kendi kendini organize edebilen tekrarlanabilir örüntüler üretebilme yeteneğine sahiplerdi. Bu, birincil mikrop tabakalarının oluşturuldurulan mekanizmaların incelenmesi için yararlı bir model sunmasına rağmen, kader belirtiminin kalıpları embriyogenez 15 sırasında gözlenen organizasyon ve morfogenez ile tam olarak uyuşmadı15. Erken embriyonik gelişimin daha sadık bir recapitulation üç boyutlu ekstrasellüler matris (ECM) matrigel11hESCs gömme tarafından elde edildi , kendi kendini organize ve model hESCyeteneği için bugüne kadar en güçlü kanıt sağlayan embriyogenez ex vivo erken aşamalarında. Ancak, bu yöntem tutarsız sonuçlar verir ve bu nedenle öz-organizasyon ve kader belirtimi temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek tahliller bir dizi ile uyumsuzdur.
Bu mevcut yöntemler ve bunların ilgili sınırlamaları göz önüne alındığında, erken embriyonun hücre dışı ortamını modelleyen koşullarda tanımlanmış geometrilerin hESC kolonilerini tekrartekrar örmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık. Bunu başarmak için, substrat mekanik özelliklerini kontrol etmek için ölçülabilir elastikiyet poliakrilamid hidrojeller kullanılır. Gastrulation aşamasındaki tavuk embriyolarında atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak epiblastın elastikiyetinin yüzlerce pascal'dan birkaç kilopascal'a kadar değiştiğine rastladık. Böylece, hESC kolonileri için substrat olarak hizmet vermek için bu aralıkta elastikiyeti ile poliakrilamid hidrojeller üretmeye odaklandık. Kolonilerin geometrisi üzerinde sağlam bir kontrol sağlamak için poliakrilamidhidrojeller 7,9 üzerinde hESCs kültür için önceki yöntemleri ni modifiye. Biz ilk desenleme ECM ligands, yani matrigel, cam kapakları üzerine mikrofabrikasi şablonlar aracılığıyla, daha önce rapor16ile elde etti. Daha sonra polimerizasyon sırasında poliakrilamid hidrojellerin yüzeyine desenli ligand aktarmak için yeni bir teknik tasarladık. Burada tanımladığımız yöntem, istenilen geometrik desenlerle silikon bir gofret üretmek için fotolitografi kullanmak, polidimethylsiloxane (PDMS) ile geometrik tezlerin pullarını oluşturmak ve bu pulları kullanarak şablonları oluşturmak için sonuçta cam kapakları yüzeyine ligand desenleme ve poliakrilamid transfer sağlar.
Erken embriyonun mekanik ortamının yeniden özetlenmesinin yanı sıra, hESC kolonilerinin poliakrilamid ile sınırlanması, önceki yöntemimizde bildirildiği gibi, çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) ile hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin ölçülmesini sağlar9. Kısaca, floresan boncuk poliakrilamid gömülü ve fiducial belirteçleri olarak kullanılabilir. Hücre tarafından oluşturulan kuvvetler, bu boncukların desenli substrat üzerine hESC'ler tohumladıktan sonra yer değiştirmelerinin görüntülenmesiyle hesaplanır. Ayrıca, ortaya çıkan çekiş kuvveti haritaları, sınırlı hESC kolonilerinde hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin dağılımının aşağı sinyalizasyonu nasıl düzenleyebileceğini veya modüle edebileceğini incelemek için immünboyama gibi geleneksel tahlillerle birleştirilebilir. Bu yöntemlerin, mekanik kuvvetlerin şu anda gözden kaçan erken embriyonik gelişim sırasında hücre kaderi spesifikasyonunun desenlemesinde kritik bir rol oynadığını ortaya çıkarmasını bekliyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical-bottom tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plastic petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm diameter #1 coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>18CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% bisacrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>313251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing-buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22623508</td>
			<td>Model: 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F8821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for coverslips)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (for wafers)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel holders</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-261-94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J16926A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HP88854100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes (delicate task wipes)</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout-DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner (for photolithography)</td>
			<td>Karl Suss America, Inc.</td>
			<td>Karl Suss MJB3 Mask Aligner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for traction force</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: Eclipse TE200 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized positioning stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model: HLD117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer)</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA 74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory film)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Sylgard 184)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9332171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for gasket</td>
			<td>Marian Chicago</td>
			<td>HT6135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic for spacer</td>
			<td>TAP Plastics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Polycarbonate sheet, .01 inch thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>424185000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-840-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71893-06</td>
			<td>Type P, 3 inch, silicon wafers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S472-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-3050 Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-sterilization box</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patterning the geometry of human embryonic stem cell colonies on compliant substrates to control tissue-level mechanics

İnsan embriyonik kök hücreleri, embriyogenez sırasında birincil mikrop tabakası oluşumuna karşılık gelen hücre kader özelliklerinin kendi kendini organize eden kalıpları ile morfojenlere in vitro yanıt verme yeteneğini gösterir. Böylece, bu hücreler ile erken insan gelişimini sürücü mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç temsil eder. İnsan embriyonik kök hücrelerini, kolonilerin geometrisi ve mekanik çevreleri üzerinde kontrol sağlayan uyumlu yüzeyler üzerinde, sınırlı kolonilerde kültüre getirmek için bir yöntem geliştirdik. altında yatan embriyogenez. Bu yöntemin en önemli özelliği hücre eki teşvik etmek için yüzeyde ekstrasellüler matriks ligand tanımlanmış desenleri ile poliakrilamid hidrojeller oluşturmak için yeteneğidir. Bu, istenilen geometrik desenlerle şablonlar üreterek, bu şablonları kullanarak cam kapaklar üzerinde hücre dışı matris ligand desenleri oluşturarak ve polimerizasyon sırasında bu desenlerin poliakrilamid hidrojellere aktarılması yla elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda çekiş kuvveti mikroskobu ile uyumludur, böylece kullanıcı hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin sınırlı koloniler içindeki dağılımını ölçer ve haritalayabilir. Standart biyokimyasal tahlillerle birlikte, bu ölçümler mekanik ipuçlarının erken insan gelişimi sırasında kader belirtimi ve morfogenezde oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir.

Uyumlu yüzeylerüzerinde kontrollü geometri kolonilerinde hESC'lerin kültüre alınmasında aşılması gereken temel zorluk, substrat yüzeyinde homojen bir ECM-ligand deseni oluşturmaktır. Bu yöntemde sunulan strateji, önce cam bir kapak kayması yüzeyinde istenilen desenin üretilmesini ve daha sonra jelin polimerizasyonu sırasında bu desenin poliakrilamid hidrojel yüzeyine aktarılmasını içerir (Şekil 1 A). Bu nedenle, hidr...

Watch this Scientific Journal Video about Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics at JoVE.com

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Hücre dışı matriks ligandlar poliakrilamid hidrojeller üzerine uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı kolonilerde insan embriyonik kök hücrelerin kültürünü sağlamak için desenli olabilir. Bu yöntem, doku geometrisi, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler ve kader özellikleri arasındaki etkileşimi incelemek için çekiş kuvveti mikroskobu ve biyokimyasal tahlillerle kombine edilebilir.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Bu protokol, araştırmacıların hem hidrojel sertliği hem de kolonilerin geometrisi üzerinde tam kontrol esahip hidrojeller üzerinde kök hücre kolonileri kültür sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, araştırmacıların doku kültürü plastikten daha iyi fizyolojik ortamı taklit eden koşullarda kök hücre kolonilerini kültüre almalarına olanak sağlamasıdır. Bu protokolü ilk kez gerçekleştirirken, her malzemeden birkaç ekstra malzeme ürettiğinizi ve her adımda sorun giderebileceğinizve optimize edebilirsiniz diye floresan bir ligand kullandığınızdan emin olun.Bu teknik, çeşitli malzemelerin hassas konumlandırma içeren birden çok adım içerir. Bu protokolün gerçekleştirildiğini gördükten sonra bu protokol için yazılı talimatları anlamak çok daha kolaydır. Bu yordamı başlatmak için PDMS tabanını PDMS kür leme maddesi ile 10'a 1 oranında ağırlıkla karıştırın ve iyice karıştırın.Degas 30 ila 60 dakika veya tüm hava kabarcıkları kaldırılana kadar bir kurutucu bu karışımı. PdMS karışımını yavaş ve eşit bir şekilde hazırlanan gofretyüzeyine dökün. Gofret yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalışma yüzeyinde çanak dokunun.PdMS'yi 70 derecede iki saat pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Daha sonra PDMS'yi her biri tek bir deneysel koşul için özellikler içeren yaklaşık 10 ila 10 milimetre kare şeklinde kesin. Bunlar, protokolün geri kalanı için pul olarak adlandırılır.Bundan sonra, PDMS tabanını SEKIZe bir ağırlık oranında PDMS kürleme maddesi ile karıştırın ve iyice karıştırın. Karışımı 30 ila 60 dakika veya tüm hava kabarcıkları uzaklaştırılAna kadar kurutucuda degazlayın. Daha sonra, yavaş ve eşit temiz bir 100 milimetrelik çanak içine PDMS dökün.Herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalışma yüzeyinde çanak dokunun. PdMS'yi 70 derecede iki saat pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Daha önce oluşturulan her damga için 15'e 15 milimetrelik PDMS karesi kesin.Bunlar, protokolün geri kalanı için düz levhalar olarak anılacaktır. Oluşturulan her damgayı, standdaki özelliklerin düz bir PDMS levhasıyla temas etmesi için düz bir PDMS levhasına ters çevirin. Hatta temas sağlamak için pullu larla pulun üstüne hafifçe bastırın.Daha sonra, her pul ve levha çiftinin üst arayüzüne UV-tedavi edilebilir polimer küçük bir damla yerleştirin. Polimer yerçekimi tarafından desteklenen yüzey gerilimi tarafından ikisi arasında kötü olacaktır. Pul ve levha arabiriminin kenarlarına UV-tedavi edilebilir polimer küçük bir damla yerleştirin.Bu ligand çözüm tutacak bir kenarlık oluşturur. Sonra dikkatlice bir UV sterilizasyon kutusuna damga ve tokat çiftleri yerleştirin. Steril STR güç ayarını kullanın ve 10 dakika boyunca açığa çıkarın.Bundan sonra, UV sterilizasyon kutusundan çiftleri çıkarın ve UV-tedavi edilebilir polimer oluşan düz levha ve şablon aşağı tutarken yavaşça damga kaldırmak için forseps iki çift kullanın. Forceps kullanarak, şablonu dikkatlice çıkarın ve PDMS'nin düz levhasıyla temas eden yüzeyin yukarı bakacak şekilde tersine çevirin. Ters kalıpları UV sterilizasyon kutusuna geri yerleştirin.Steril STR güç ayarını kullanın ve üç dakika boyunca açığa çıkarın. Forceps kullanarak, dikkatle bir asit yıkanmış coverslip üzerine aşağı her şablon düz tarafı yerleştirilir özellikleri kapak kayma üzerinde ortalanmış olduğundan emin olun. Her şablonüstüne laboratuvar filmi küçük bir parça yerleştirin.Şablon ve kapak arasında güçlü bir temas oluşturmak için şablonu sıkıca ve eşit bir şekilde bastırın. Bir tabak içinde şablonlar ile kapak fişleri yerleştirin. Bu yemeği bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve 30 saniye boyunca yüksek güçlü plazma uygulayın.Sonra, her şablonun yüzeyine ligand çözeltisi pipet. 10 ila 10 milimetre kare puldan yapılan şablonlar için şablon başına 100 mikrolitre uygulayın. Bundan sonra, laboratuvar film kapak fişleri içeren çanak sarın ve bir gecede dört derece santigrat de kuluçka.İlk olarak, kısa bir süre steril PBS içeren bir çanak batırmak için forceps kullanarak şablon ile coverslip yıkayın. Tekrar yıkamak için PBS ikinci aşamasına şablon ile coverslip batırın. Kapağın yüzeyindeki şablonu kapağı kırmamaya dikkat edin.Daha sonra, pbs yıkama tuzları kaldırmak için ultra saf su içeren bir çanak içinde kısaca coverslip batırın. Fazla suyu uzaklaştırmak için kapak kaymasının kenarına hassas bir görev silme ye dokunun. Nitrojen gibi inert bir gaz Altında kapak kayma kuru.Sonra, istenilen hidrojel elastikiyetini elde etmek için bir poliakrilamid çözeltisi hazırlayın. Her desenli coverslip için, bir glutaraldehit aktif alt hazırlamak üstüne yerleştirilen bir spacer ile dudak kapakları. Pipet arasında 75 ve 150 mikrolitre poliakrilamid çözeltisi her glutaraldehit merkezine aktif coverslip.Forseps kullanarak, her glutaraldehit üzerine kayma kapsayacak şekilde desenli yerleştirin poliakrilamid ve spacer ile kayma poliakrilamid ve spacer ile kayma böylece desenli ligand poliakrilamid çözeltisi karşı karşıya. Dikkatle 15 mililitre konik alt tüpler ile uyumlu iplikleri ile bir kap tutucu içine her poliakrilamid sandviç yerleştirin. Yerinde poliakrilamid sandviç tutmak için her kap tutucu içine 15 mililitrekonik alt tüp vida.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 kez G kez salıncak kovatüpleri poliakrilamid sandviç santrifüj. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve tam polimerizasyon sağlamak için yönünü 50 dakika daha korumak için tüp raflara yerleştirin. Daha sonra sandviçleri tüplerden çıkarın ve PBS'ye batırın.Laboratuvar filmi çanak sarın ve oda sıcaklığında üç saat veya dört derece santigrat gecede kuluçka. Bundan sonra, pbs batık kalır ise poliakrilamid sandviç ve kaymaları ve spacer kapsayacak şekilde desen dikkatlice kaldırmak için bir neşter ve forceps kullanın. Bir kapak tutucu içine desenli poliakrilamid ile her coverslip yerleştirin.Contanın kapak fişinin üstüne ve spacer'In bulunduğu poliakrilamidin etrafına yer. Testereyle kesilmiş 15 milimetrelik konik alt tüpü kapak tutucuya vidalayın, alttaki desenli poliakrilamid ile bir kuyu oluşturarak. Bu montajlar kolay kullanım için standart 12 kuyu plakakuyularına sığar.Bu tekniği yaparken, cam kapak yüzeyinde istenilen desenin oluşturulduğundan ve polimerizasyon sırasında poliakrilamid hidrojelin yüzeyine başarılı bir şekilde aktarıldığından emin olmak için floresan ligand kullanın. Bu yöntemiçin başarının nihai ölçüsü, desenli hidrojeller üzerinde istenilen geometrilerde hESC'leri kültüredebilme yeteneğidir. Metin protokolünde belirtildiği gibi kültürlü olduğunda, HESC'ler genellikle desenli geometrileri Y27632 medyadan tamamen kaldırıldıktan sonra 48 ila 72 saat boyunca tamamlamak için çoğalır.Poliakrilamid hidrojellerde sınırlı geometrilerde hESC kolonilerinin kültüre edilmesi, çekiş kuvveti mikroskobu kullanılarak hücre tarafından oluşturulan çekiş kuvvetlerinin ölçülmelerine izin verir. Bu ölçümler floresan mikrosferlerin hidrojele yerlebir edilmesi ve bu boncukların fideleme den önce ve sonra konumlarının görüntülenmesi ile yapılır. Boncuk pozisyonlarının görüntüleri, daha sonra altta yatan çekiş gerilimlerini hesaplamak için kullanılabilecek boncuk yer değiştirmelerinin haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.HESC'lerin dairesel kolonilerinde, en büyük çekiş gerilimleri kolonilerin çevre kenarına yakın bulunurken, kolonilerin merkezi düzgün bir şekilde düşük çekiş gerilimleri gösterir. Çekiş gerilimlerinin gözlenen tek düze olmayan dağılımlarına rağmen, bakım koşullarında desenli daireler olarak kültürlenen HESC'ler, pluripotency marker Oct 3/4 ve hücre yapışma molekülü E-kadherinin tek tip ekspresyonu gösterirler. Bu teknik, araştırmacıların insan embriyolarını insan embriyolarını daha iyi modellemelerine olanak sağlayacak ve sonuçta insanların nasıl geliştiğine dair önemli içgörülere yol açacaktır.Bu prosedür, bir araştırmacının yumuşak hidrojeller üzerinde tanımlanmış geometriler deki hücreleri kültüre getirmeyi amaçladığı herhangi bir uygulamaya uyarlanabilir. Bu prosedür çoğu biyokimyasal asitle uyumludur ve araştırmacıların doku geometrisi ve hücre tarafından oluşturulan kuvvetler gibi şeylerin protein ekspresyonunu ve hücre sinyalini nasıl etkilediği hakkındaki soruları yanıtlamalarına olanak sağlar. Birçok araştırmacı şimdi erken insan gelişimini modellemek için insan embriyonik kök hücreleri kullanıyor.Bu teknik, araştırmacıların fizyolojik ortamı daha iyi taklit eden koşullarda bu önemli soruları yanıtlamalarına olanak sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Poli (ε-kaprolakton) electrospun İplik İnsan Mezenkimal Kök Hücre Ek Optimize

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...