Name: contusion spinal cord injury via a microsurgical laminectomy in the regenerative axolotl
Uploaded: 2019-10-20T14:45:00
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迈克尔·佩德森，奥胡斯大学，他的专业知识和时间在开发MRI协议和建立整个项目。彼得·阿格尔，奥胡斯大学，他的专业知识和时间在开发MRI协议。奥胡斯大学的斯特芬·林加德，他在开发MRI协议方面的专长和时间。A.P. Müller Maersk 基金会、里斯福基金会、Linex 基金会和 ELRO 基金会大力支持了 A.P. Müller Maersk 基金会在 axolotl 中开发 SCI 模型。

本研究遵循了关于动物伦理使用的所有适用的体制和政府条例。这项研究在批准ID下进行：2015-15-0201-0061由丹麦动物实验监察局进行。动物是墨西哥的斧头 （墨西哥阿姆比斯托马，平均身体质量 = STD： 12.12 g = 1.25 g）。
1. 准备
<ol><li>
准备麻醉用的轴药。
	<ol>
<li>使用高质量的非化学处理自来水。如果不可用，请使用 40% 霍尔特弗雷特的解决方案。</li>
		<li>?...

<ol>
	<li>Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+Long-Term+Survival+After+Spinal+Cord+Injury.">Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).</li><li>Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+management+and+quality+of+life+after+spinal+cord+injury.">Bladder management and quality of life after spinal cord injury.</a> American Journal of Physical Medicine &amp; Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).</li><li>Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stockholm+spinal+cord+injury+study:+1.+Medical+problems+in+a+regional+SCI+population.">The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population.</a> Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).</li><li>Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury+in+Denmark,+1990-2012:+a+hospital-based+study.">Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study.</a> Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).</li><li>Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+and+incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury.">Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury.</a> Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).</li><li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degenerative+and+regenerative+responses+of+injured+neurons+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals.">Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).</li><li>Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+mesencephalic+neurons+survive+and+extend+long+axons+across+peripheral+nervous+system+grafts+inserted+into+the+adult+rat+striatum.">Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum.</a> Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).</li><li>Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+long+spinal+axons+in+the+rat.">Regeneration of long spinal axons in the rat.</a> Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).</li><li>Butler, E. G., Ward, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+spinal+cord+following+ablation+in+urodele+larvae.">Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).</li><li>Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+control+of+miR-125b+levels+is+required+to+create+a+regeneration-permissive+environment+after+spinal+cord+injury:+a+cross-species+comparison+between+salamander+and+rat.">Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat.</a> Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).</li><li>Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+descending+axons+in+the+spinal+cord+of+the+axolotl.">Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl.</a> Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).</li><li>McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration+from+the+implanted+neurospheres.">Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres.</a> Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).</li><li>Thygesen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+blunt+spinal+cord+injury+model+in+the+regeneration+competent+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+tail.">A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail.</a> Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regeneration. , (1969).</li><li>Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb:+a+model+for+bone+development,+regeneration+and+fracture+healing.">The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing.</a> Bone. 40 (1), 45-56 (2007).</li><li>Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propofol+(2,6-diisopropylphenol)+is+an+applicable+immersion+anesthetic+in+the+axolotl+with+potential+uses+in+hemodynamic+and+neurophysiological+experiments.">Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments.</a> Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Progress+of+Physiology.">The Progress of Physiology.</a> The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li></ol>

由于脊髓损伤的风险很大，协议的关键步骤是去除脊柱过程，并根据需要扩大对脊髓管的骨质访问。如协议所述，强烈建议首先删除最颅骨过程。这将意味着更多的牛加工保护脊髓免受剪刀的击中。建议确保足够的手术治疗，这意味着不要使过小的主要切口。此外，当用钳子抓住任何东西时，必须始终考虑所施加的拉力方向。在抓地力失效和仪器滑移时，从脊髓上轻轻拉出，将保护脊髓。
<p cl...

本研究的总体目标是建立一种可控和可重复的显微外科方法，用于将钝和尖锐的SCI施加到axolotl（墨西哥的Ambystoma），从而产生一个再生脊髓损伤模型。
SCI是一个严重的条件，根据水平和程度，造成神经残疾的四肢以及受损的膀胱和肠道控制1，2，3。大多数SCI是高能量钝性创伤的结果，如交通事故和跌倒4，5。剧烈的损伤非常罕见。因此，最常见的宏观损伤类型是挫伤。
哺乳动物中枢神经系统（CNS）是一种非再生组织，因此在SCI之后神经组织没有恢复，另一方面，一些动物有一个有趣的能力，以再生组织，包括中枢神经系统组织。这些动物之一是弓形虫。它被广泛用于再生生物学的研究，并有兴趣在脊髓再生，因为它是脊椎动物9，10，11，12。
在轴线中，大多数SCI研究要么截肢整个尾巴，要么使脊髓的较大部分消融9，10，11，12。最近，一项新的研究发表在钝损伤13，模仿临床情况更好。虽然完全附属截肢在轴异体导致完全再生，一些非截肢为基础的再生现象依赖于临界尺寸缺陷（CSD）14，15。这意味着超过临界阈值的伤害不会再生。为了开发一种具有较高临床转化价值的再生模型，本研究调查了2毫米钝性创伤是否会超过CSD极限。
这种方法与研究小动物模型脊髓再生的研究人员相关，特别是在异种动物模型中。此外，它可能更普遍的利益，因为它展示了一种使用标准实验室设备来开发一种钝性创伤机制的方法，这种机制一般适用于小动物。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>25 g custom falling rod</td>
			<td>custom home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm PVC pipe</td>
			<td>custom home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Propanone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axolotl (Ambystoma mexicanum)</td>
			<td>Exoterra GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94-09-7</td>
			<td>ethyl 4-aminobenzoate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electromaget</td>
			<td>custom home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Excel 2010 or newer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Forceps and scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS550s</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics</td>
			<td>MS550s</td>
			<td>40 MHz center frequency, transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS700</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td>50 MHz center frequency, transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>any maker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft cloth</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>High frequency ultrasound system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contusion spinal cord injury via a microsurgical laminectomy in the regenerative axolotl

本研究的目的是在axolotl（墨西哥阿姆比托马）中建立一个标准化和可重复的再生钝脊髓损伤模型。大多数临床脊髓损伤都发生高能量钝性创伤，导致挫伤。然而，大多数研究在轴线脊髓已经进行了尖锐的创伤。因此，本研究旨在产生一种更具有临床相关性的再生模型。由于其令人印象深刻的再生能力，几乎任何组织，轴球被广泛用作模型在再生研究，并已广泛用于脊髓损伤（SCI）研究。在此协议中，异体通过浸入苯甲酸溶液进行麻醉。在显微镜下，一个角切口是双边的，正好对后肢有一个切口。从这个切口，有可能解剖和暴露的旋转过程。使用钳子和剪刀，进行两级拉平切除术，暴露脊髓。构建了一个由圆柱体中落杆组成的定制创伤装置，该装置用于诱导脊髓的挫伤。切口然后缝合，动物从麻醉中恢复。手术方法成功地暴露了脊髓。创伤机制可以产生脊髓的挫伤，由动物学、MRI和神经学检查证实。最后，脊髓从损伤中再生。该协议的关键步骤是去除旋转过程，而不会对脊髓造成损伤。此步骤需要培训以确保安全的程序。此外，伤口封闭高度依赖于在切口期间不对皮肤造成不必要的损伤。该协议是在对12只动物的随机研究中进行的。

该协议的目的是产生一个SCI，将瘫痪的电机和感觉功能对损伤。由于axolotl具有再生能力，它可以在几周内恢复功能，使研究人员能够在短时间内研究CNS再生。
麻醉为所有动物提供45分钟，没有经历早产的发作。所有动物在一小时内恢复，在接下来的星期十三、十六日，没有因麻醉而受损的迹象。
层切除术在所?...

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Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

这份手稿提出了手术治疗方案，用于对再生轴虫（Ambystoma墨西哥）造成控制性钝和尖锐的脊髓损伤。

通过再生轴虫中通过显微外科拉米切口进行损伤的脊髓损伤

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

该协议是首次引入标准化的挫伤型损伤在轴角脊髓再生研究中。这种技术的主要优点是，它模仿在日常诊所看到的创伤，增加了未来发现能够被翻译的可能性。挫伤装置可用于脊髓损伤的其他小型动物模型。手术技术是困难的，尤其是拉明切除术。因此，建议在进入体内手术之前，对大量动物进行活体外手术。首先，在手术纺织品布上放置一个标准培养皿，在立体显微镜下设置手术台。将麻醉斧头放在 Petri 盘上的易用位置，用纸巾包裹，使尾巴露出来。识别后肢，并使用一把微型剪刀，使第一个切口只是对它们。从龙骨进行垂直切口，直到感觉到旋转过程的骨质突出。横向延伸切口，使切口遍历尾部的整个宽度，并抓住带钳子的旋转过程，以确保适当的深度。然后将垂直切口在两侧的旋转过程下方延伸一毫米。将动物放在一边，从垂直切口的腹口开始，为体重为 10 到 20 克的动物进行大约 15 毫米的水平切口。使用剪刀立即通过水平切口解剖，直到椎柱在中线感觉到。然后将动物打开另一边，然后重复这个过程。从两侧解剖后，通过中线解剖，连接两个水平切口。然后，将自由的尾巴和龙骨移动到一侧，以暴露旋转过程。将动物放在容易的位置，头部朝向外科医生的非占力侧，并使用一对钳子抓住旋转过程，只是对后肢的侧身。向动物的头部轻轻抬起。将一把微型剪刀的刀片水平放在工艺周围，轻轻切割，露出脊髓。抓住旋转过程，将过程抓到刚刚拆下的流程，然后重复该过程。在旋转过程中，您必须保持恒定的提升，以确保它不会在切除时对脊髓造成伤害。如果暴露区域不够宽，使用两对钳子抓住脊髓两侧的层，然后用温和的运动横向扭动它们。删除旋转过程时，可能需要在多个步骤中完成此操作。因此，暴露脊髓可能需要几分钟。要引入挫伤型损伤，请使用培养皿将动物转移到创伤单元，并在脊髓上照上手电筒。然后，使用微调节器将挫伤性创伤单元圆柱放在暴露的脊髓上方，并降低气缸，直到它与层压水平。将落杆连接到磁铁上，将所需的下降高度调节油缸放在创伤装置上。接下来，将落杆放在气缸上，关闭电磁铁将杆掉落在裸露的脊髓上，并使用高度调节螺钉将杆向上抬起。如果引入剧烈损伤，在完美的垂直切口中切割脊髓，然后重复切割两毫米到身体的肌肉侧。感觉剪刀的刀片沿着脊髓管的腹部刮擦，以确保切口完成，并解除脊髓从运河。要关闭手术伤口，请从水平切口的最多刻部分放置 10 点 O 尼龙缝合线，将伤口合上一层，然后向切口的垂直部分工作。当达到一个角度时，转动培养皿并缝合其他水平切口，然后在垂直切口上设置缝合线。在终止麻醉之前，使用高频超声波获取损伤图像。将传感器的尖端与动物的长度轴对齐，将其淹没到苯并凯恩溶液中，直到它仅比动物后肢后面的龙骨高出几毫米。识别受伤地点，并根据手稿指示获取图像。完成后，将斧头返回到麻醉液，将 Petri 盘淹没在五厘米深的淡水中，让动物滑走。使用此协议创建的脊髓损伤在受伤和假斧弓上使用血氧素染色进行验证。为了确认再生，组织学科在受伤后九周准备。图像显示受伤动物的脊髓连接重新建立。受伤和再生，我们其次是检查神经功能。动物对尾部刺激的反应得分较高，表示触觉和触觉功能较高。在受伤的动物中，受伤后三周神经功能丧失，九周内逐渐恢复。脊髓损伤也使用超声波图形成像进行可视化，从而能够可视化后动脉作为血管完整性的标志。高场MRI扫描在受伤后立即进行，在三、六和九周。这些扫描能够可视化水肿和恢复脊髓完整性。扫描后立即受伤后，容易发出噪音。耐心细致的手术将为在切除术后成功完成手术铺平道路，而不会过早地损伤脊髓。按照这个程序，可以应用几种体内方法，如成像和电生理技术。

Research

JoVE Journal

Medicine

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科研

医学

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Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

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Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

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