Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

نشكر البروفيسور د. مادن علي العديد من المناقشات المفيدة في هذا المشروع. نشكر البروفيسور d. bolon لهديه من البلازميد التي تحتوي علي لفائف ملفوف GCN4 الأمثل. ونشكر الدكتور ب. قوه علي نيمو البلازميدات. ونشكر كريستينا ر. ارنولدي ، وتمار باساشفيلي ، وإيمي ا. كينيدي لإظهارها هذا الاجراء. ونشكر المرفق الأساسي لعلم البلورات البيولوجية وأقسام الكيمياء والكيمياء الحيوية & بيولوجيا الخلية في دارتموث لاستخدام معدات علم البلورات والافراد البيولوجيين لدعمهم. استخدم هذا البحث AMX beamline من المصدر الوطني للضوء Synchrotron الثاني ، وهو مكتب وزاره الطاقة الامريكيه لمرفق المستخدم العلوم تعمل لمكتب وزاره العلوم من قبل مختبر بروكهافن الوطني ببموجب العقد رقم DE-SC0012704. نشكر الموظفين في NSLS II علي دعمهم. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R03AR066130 ، R01GM133844 ، R35GM128663 و P20GM113132 ، ورواية Munck-بفيفيركورن والمنحة التفاعلية.

1. تصميم بناء لبلورات
<ol><li>استنساخ تسلسل نيمو-EEAA كما في المنشور السابق12 في متجه للتعبير في e. كولاي باستخدام المروج T7 ، بما في ذلك العلامة الطرفية N-histidine وموقع انشقاق البروتياز. ملاحظه: في هذا البروتوكول ، استخدمنا متجه معدله لتشمل N-محطه سداسية histidine العلامة والتبغ حفر ال...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

كانت محاولات بلوره نيمو في النموذج غير المنضم غير ناجحه ، بما في ذلك محاولات استخدام البروتين بالطول الكامل والعديد من ثوابت الاقتطاع التي تشمل مجال ربط IKK. الخصائص الفيزيائية الحيوية لدينا من مجال الربط ikk من نيمو (بقايا 44-111) بواسطة ثنائيه التعميم ، nmr الطيفية والفلورية المتباينة أشارت إل?...

يتم تنشيط مسار NF-κB استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات ، بما في ذلك السايتوكينات والمنتجات الميكروبية والإجهاد ، لتنظيم التعبير عن الجينات المستهدفة المسؤولة عن الاستجابة التهابيه والمناعية ، وموت الخلايا أو البقاء علي قيد الحياة والانتشار1. الامراض بما في ذلك التهابات والمناعة الذاتية والسرطان2,3,4,5 وقد ارتبطت إلى فرط تنشيط المسار, الذي جعل التحوير NF-κb النشاط هدفا رئيسيا لتطوير العلاجات الجديدة6,7.
ويتميز المسار NF-κB الكنسي علي وجه الخصوص من المسار غير المتعارف عليه ، والمسؤولة عن الغدد الليمفاوية وتنشيط ب الخلية ، من قبل الاعتماد السابق علي نيمو البروتين السقالات (NF-κB المغير الاساسيه8) لتجميع ikk-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. مجمع IKK هو المسؤول عن فوسفولات IκBα (المثبط من κB) التي تستهدف ذلك للتدهور ، وتحرير الدمامل NF-κB لنقل إلى نواه للنسخ الجيني1 التالي هو هدف جذاب لتطوير مثبطات لتعدل NF-κb النشاط.
تركز أبحاثنا علي توصيف التفاعل بين البروتين والبروتين بين نيمو و IKKβ ، والتي تستهدف نيمو لتطوير مثبطات جزيئات صغيره من تكوين مجمع IKK. مجال ملزم الحد الأدنى من نيمو ، المطلوبة لربط IKKβ ، ويشمل بقايا 44-111 ، وتم تحديد بنيتها في مجمع مع الببتيد المقابلة ل IKKβ تسلسل 701-7459. نيمو و ikkβ تشكل حزمه أربعه الحلزون حيث يستضيف نيمو ديمر الهلاليين من ikkβ (701-745) في أخدود مفتوح ممدود مع واجهه تفاعل موسعه. IKKβ (734-742) ، والمعروف أيضا باسم المجال نيمو ملزمه (بنك دبي الرئيسي) ، ويعرف أهم بقعه ساخنه للربط ، حيث تريبتوفانس الاساسيه اثنين (739,741) دفن عميقا داخل الجيب نيمو. تفاصيل هيكل معقده يمكن ان تساعد في التصميم القائم علي هيكل والأمثل لمثبطات جزيء صغير استهداف نيمو. في الوقت نفسه ، فانه من الصعب ان ملزمه لجزيء صغير أو الببتيد من شانه ان يعيد في نيمو التغيير المطابق الكامل (اي ، فتح واسعه من نيمو ملفوف لفائف dimer) الناجمة عن ربط IKKβ طويلة (701-745) ، كما لوحظ في الكريستال ، وبنيه غير منضم نيمو أو نيمو منضما إلى مثبط جزيء صغير قد تمثل هدفا أفضل لتصميم المخدرات المستندة إلى بنيه والمثبط الأمثل.
وقد ثبت الطول الكامل نيمو وأصغر بنيات اقتطاع تشمل مجال IKK-ربط المستعصية لتحديد هيكل في شكل غير منضم عن طريق الاشعه السينية البلورات والرنين المغناطيسي النووي (NMR) طرق10، مما دفعنا إلى تصميم نسخه محسنه من مجال ikk ملزم من نيمو. في الواقع, نيمو (44-111) في شكل غير منضم فقط مطوية جزئيا ويخضع للتبادل المطابق ونحن لذلك تعيين لتحقيق الاستقرار هيكلها ديميريك, ملفوف لفائف اضعاف والاستقرار, مع الحفاظ علي تقارب ملزمه ل IKKβ. من خلال إلحاق ثلاثه من الهبات من الديميريك المثالي لفائف ملفوفه11 في N-و C-تيرميني من البروتين ، وسلسله من أربعه طفرات النقطة ، ونحن ولدت نيمو-eeaa ، بناء ديميريك تماما ومطوية في لفائف ملفوف ، التي أنقذت صله ikk الربط إلى نطاق نانومولار كما لوحظ لكامل طول نيمو12. كميزه اضافيه ، كنا نامل ان محولات ملفوف لفائف (علي أساس تسلسل GCN4) من شانه ان يسهل تبلور والمساعدة في نهاية المطاف في تحديد هيكل الاشعه السينية عن طريق استبدال الجزيئية. وقد استخدمت محولات ملفوف لفائف بالمثل لزيادة الاستقرار ، وتحسين السلوك الحل وتسهيل بلوره للفائف ملفوف تريميريك وشظايا الأجسام المضادة13،14. يتم التعبير عن نيمو-EEAA بسهوله وتنقيتها من اساسيكوجيا. القولونية الخلايا مع العلامة كليفابل Histidine ، هو قابل للذوبان ، مطوية في لفائف ديميريك ملفوف مستقره وتبلور بسهوله ، مع انكسار إلى 1.9 Å. وجود المناطق ملفوف لفائف أمر من GCN4 يمكن ان تساعد بالاضافه إلى ذلك في التدريج البيانات من بلورات نيمو-EEAA من قبل الاستبدال الجزيئي باستخدام الهيكل المعروف من GCN415.
النظر إلى النتائج التي تم الحصول عليها مع apo-نيمو-EEAA ، ونحن نعتقد ان البروتوكولات الموصوفة هنا يمكن أيضا ان تطبق علي بلوره نيمو-EEAA في وجود الببتيدات الصغيرة (مثل الببتيد بنك دبي المحلي) أو مثبطات جزيء صغير ، مع الهدف من فهم متطلبات تثبيط نيمو والتحسين القائم علي الهيكل من مثبطات الرصاص النظر إلى اللدونة والطبيعة الديناميكية للعديد من المجالات ملفوف لفائف16، واستخدام محولات لفائف ملفوف يمكن العثور علي تطبيق أكثر عمومية في مساعده التصميم الهيكلي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

نيمو هو بروتين السقالات الذي يلعب دورا أساسيا في المسار NF-κB عن طريق تجميع IKK-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. عند التنشيط ، فان مجمع IKK فوسفولات الجزيئات IκB مما يؤدي إلى النقل النووي NF-κB وتفعيل الجينات المستهدفة. تثبيط التفاعل نيمو/IKK هو نموذج علاجي جذاب لتشكيل النشاط المسار NF-κB ، مما يجعل نيمو هدفا لتصميم مثبطات واكتشاف. لتسهيل عمليه الاكتشاف والاستفادة المثلي من مثبطات نيمو ، قمنا بهندسة بناء محسن للمجال الملزم IKK من نيمو الذي من شانه ان يسمح لتحديد هيكل البروتين في شكل apo وبينما يرتبط بمثبطات الوزن الجزيئي الصغيرة. هنا ، نقدم الاستراتيجية المستخدمة للتصميم والتعبير والتوصيف الهيكلي للمجال الملزم IKK من نيمو. يتم التعبير عن البروتين في الخلايا القولونية ، solubilized تحت ظروف الدفن وتنقيتها من خلال ثلاث خطوات الكروماتوغرافي. نناقش البروتوكولات الخاصة بالحصول علي بلورات لتحديد الهيكل ووصف استراتيجيات الحصول علي البيانات وتحليلها. وسوف تجد البروتوكولات تطبيق واسعه لهيكل تحديد المجمعات من نيمو ومثبطات جزيء صغير.

الاستنساخ والتعبير وتنقيه مجال الربط IKK من نيمو. البروتوكول المتبع في هذه الدراسة للحصول علي التسلسل النهائي من نيمو-EEAA (الشكل 1ا) ، الذي أنتج بلورات جوده الانكسار ، وشملت التعبير وتوصيف جميع البنيات الوسيطة ، بما في ذلك أضافه محولات لفائف ملفوف في N-و أو ...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

ونحن نقدم وصفا للبروتوكولات الخاصة بتحديد هيكل المجال الملزم IKK من نيمو بواسطة البلورات بالاشعه السينية. وتشمل الأساليب التعبير البروتين, تنقيه وتوصيف وكذلك استراتيجيات لتحسين الكريستال الناجحة وهيكل تحديد البروتين في شكله غير منضم.

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

يسهل هذا البروتوكول تحديد الهيكل الناجح للمجال الملزم IKK NEMO، في شكله غير منضم. وتفاصيل إنتاجه وتبلوره. البروتوكول، يستفيد من هذا التثبيت من تأكيد الأصلي من الجزء المجال ملزم IKK من نيمو، من خلال محولات ملف الملف، والتي تسهل التبلور وتحديد الهيكل.البيولوجيا الهيكلية من نيمو، كهدف، يوفر ميزة هامة في تطوير مثبطات NEMO لعلاج أمراض المناعة الذاتية والتهابات والسرطان. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لتحديد هيكل المجمعات NEMO، مع الببتيد أو مثبطات جزيء صغير لاكتشاف المخدرات أو التحسين. البروتين إعادة التكفير والتركيز، خلال مرحلة إنتاج البروتين، هي أساسية للحصول على خافض NEMO نقية.الحد من التجميع وضمان القابلية للذوبان في ظل ظروف التبلور. وسوف يكون إثبات الإجراءات تمار وإيمي، طلاب الدراسات العليا في مختبرنا. تبدأ بإضافة 20 ملليلتر من محلول مرق رائع.و 20 ميكرولترات من 100 مليغرام لكل ميل المليلتر من الأمبيسيلين. إلى قارورة 125 ملليلتر إرلينماير تليها microliters قليلة من الخلية الجلسرين الأسهم، من 80 درجة مئوية التخزين، من BL21DE3 الخلايا المختصة.تحولت مع ناقلات. بعد هز ثقافة البداية بين عشية وضحاها، في 37 درجة مئوية و 220 التناوب في الدقيقة الواحدة، وتمييع الخلايا إلى OD600 من 0.1 و 250 ملليلتر من مرق رائع. وأضيف الأمبيسيلين إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر.عندما تصل إلى OD600 من الثقافة 0.8 إلى 1، إضافة IPTG إلى الثقافة، إلى تركيز 500 ميكرومولار. وتنمو الخلايا لمدة أربع ساعات، في 37 درجة مئوية، حتى OD600 تصل إلى 6-10. في نهاية الحضانة ، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.وإعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر من العازلة تحلل. تقسيم الخلايا التي أعيد تعليقها إلى اثنين من 20 إلى 25 ملليلتر aliquots. واستخدام الصحافة الفرنسية لتطبيق ما يقرب من 25،000 جنيه لكل بوصة مربعة من الضغط على الخلايا، مرتين إلى ثلاث مرات لكل aliquot، في غرفة باردة.بعد ذلك ، أضف اليوريا إلى الخلايا ، إلى تركيز نهائي من ثمانية أضراس. واحتضان حل الخلية على منصة هزاز لمدة ساعتين إلى 16 ساعة، في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي، نقل ال ليسات إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة، إلى ما لا يقل عن ثلاثة أرباع كامل، لكل أنبوب.و (أولرتا) للطرد المركزي لمدة 45 دقيقة decant الماحشات في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. وتحميل اليوريا المحتضنة على عمود IMAC، في ثلاثة ملليلتر في الدقيقة الواحدة.عندما يتم تشغيل كافة من supernatant خلال العمود، قم بغسل العمود 10 وحدات تخزين عمود، مع المخزن المؤقت الربط، في ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. وأداء التدرج elution من البروتين نيمو-ETAA من 10 إلى 500 إيميدازول ميليمولار, أكثر من 12 تدرج حجم العمود. جمع 1 ملليلتر aliquots من eluate ، في لوحة جمع الكسور.بعد تحليل صفحة SDS ، اسحب الكسور التي تحتوي على البروتين المستهدف النقي وقياس تركيز البروتين عن طريق مقايسة برادفورد ، وفقًا للبروتوكول القياسي. حدد الكسور المراوغة، التي تحتوي على البروتين. لشق علامة HIS6 وإزالة imidazole الزائدة من العينة، إضافة بروتياز TEV، في نسبة الوزن واحد إلى 10، من البروتين المشقوق TEV، إلى عينة البروتين الهدف.و تمدد العينة بين عشية وضحاها في أربعة لترات من 20 ملليمولار تريس. 150 ميليمولار كلوريد الصوديوم واثنين من ملمور DTT الحل. في صباح اليوم التالي، قم بتحميل عينة TEV المشقوقة NEMO-EEAA، على عمود IMAC الثاني، في ملليلتر واحد في الدقيقة.جمع تدفق من خلال في كسور ملليلتر واحد، في وعاء 96 لوحة جمع الكسور. غسل العمود مع خمسة مجلدات من 20 ملليمولار تريس، 150 ميليمولار كلوريد الصوديوم و10 ميل imidazole ميليمولار، في ملليلتر واحد في الدقيقة. بعد الغسيل الأخير، elute TEV ورقم HIS6 NEMO-EEAA، مع ثلاثة مجلدات العمود من 20 ملليمولار تريس، 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم، 500 ملليمولار إيميدازول واثنين من محلول DTT ملليمولار، في قارورة 50 ملليلتر.سحب تدفق من خلال الكسور، التي تحتوي على مشقوق NEMO-EEAA بناء وتركيز العينة مع تركيز خلية أثار، إلى خمسة ملليلتر. بعد غسيل الكلى بين عشية وضحاها كما هو موضح، تحميل خمسة ملليلتر من العينة على 16 ملليمتر من قبل 60 أعمدة الكروماتوغرافيا حجم 60 سنتيمترا. تكرار حسب الضرورة، وفقا لحجم العينة.في ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة، وفي اثنين من تريس ملليمولار، 100 ملليمولار كلوريد الصوديوم واثنين من ملولار DDT الحل. بعد سحب الكسور، المقابلة لdimeric NEMO-EEAA، تركز العينة في مركز الخلية أثار، مع قطع الوزن الجزيئي غشاء من ثلاثة كيلودالون، إلى تركيز النهائي من 113 ميكرومولار. ثم، aliquot البروتين للتخزين في أربع درجات مئوية، لمدة تصل إلى شهر واحد.بالنسبة لفحص المصفوفة المتفرقة، أضف 60 ميكرولترات من محلول المصفوفة المتفرقة في كل بئر من الآبار الـ 96 للوحة تبلور غرفة قطرة. للجلوس وإسقاط انتشار بخار. وإضافة محلول البروتين إلى واضع إسقاط الروبوتية.المقبل، واستخدام واضع إسقاط الروبوتية، للاستغناء عن 100 نانولتر من محلول البروتين في 1.65 ملليغرام لكل ملليلتر، في نسبة واحد إلى واحد مع محلول الخزان في انخفاض واحد، إلى حجم النهائي من 200 نانولتر. وإضافة 66 نانولترات من محلول البروتين مع 134 نانويلتر من محلول الخزان، إلى حجم نهائي من 200 نانولتر في انخفاض اثنين. ثم، ختم على الفور لوحة مع شريط ختم واسعة ثلاثة بوصة.ثم، تخزين الصواني في تخزين صور التبلور، في 20 درجة مئوية. التحقق من الصور التي تم جمعها تلقائيا، لوجود بلورات، بدءا من يومين بعد تخزين لوحات. لتوليد البذور الأسهم، نقل قطرة كاملة تحتوي على الكريستال من الفائدة، إلى 50 ميكرولترات من حل حالة التبلور، في القارورة المقدمة، من مجموعة جيل البذور.ودوامة مخزون البذور، مع 20 ثانية من النبض و 10 ثوان من الراحة، لمدة ثلاث دقائق. ثم، بشكل متسلسل تمييع مخزون البذور، في واحد إلى 10 زيادات، وصولا الى واحد إلى 10،000. وتخزين التخفيفات عند أربع درجات مئوية، حتى مزيد من الاستخدام.قبل يوم إلى يومين من الشحن إلى السنكروترون، وقطع الشريط من أعلى البئر، مع الكريستال من الفائدة. وإضافة 0.5 ميكرولترات من محلول التبلور التي تحتوي على 12٪ واحد، واثنين من البروبان ديو cryoprotectant، مباشرة إلى البئر. طرد بلطف الكريستال مع حلقة التبريد.حلقة الكريستال من البئر، وتخزين الكريستال التي تحتوي على حلقة التبريد في عفريت مغمورة في النيتروجين السائل، حتى شحنة لالأشعة السينية حيود. بعد تلقي بيانات الحيود بالأشعة السينية، معالجة شدة تحجيم في STAR و ISO الملقم. وباستخدام فهرسة بلوروغرافية بالأشعة السينية، قطع متوسط، من 1.2 لسطح الحد من الحيود للبيانات.و تحميل على فينيكس. لتحديد الهيكل، استخدم هيكل الأشعة السينية GCN4 كنموذج بحث للاستبدال الجزيئي، وذلك باستخدام MRage في فينيكس. سيتم تعريف هيكل 4DMD ، على أنه مجموعة.وسوف حل MRage بناء بنجاح إلى جزء هيكل، المقابلة للمحطة النهائية ملف ملف محول من نيمو-ظا. إلى نموذج البحث، لكلا السلاسل في الخافت. يظهر البروتين عبر التعبير عنها في نطاق, في ما يقرب من 14 كيلودالتون علامة الوزن الجزيئي, قبل تنقية العمود IMAC الأولى.ويعرض الفرقة مونومر والفرقة يمبر، في 14 و 28 كيلودالتون، على التوالي، بعد أول elution. تم الانتهاء من شق TEV عمليا، بعد elution، من خلال العمود IMAC الثاني. تقريبا تماما كما اكر، في الوزن الجزيئي المتوقع.حجم استبعاد الكروماتوغرافيا، ويعرض ذروة واحدة، والتمادي بين 60 إلى 65 ملليلتر، الذين يستجيبون لتمين. ينتج الفحص الدقيق بلورات يمكن استخدامها لإنتاج مخزون من البذور لإنتاج بلورات NEMO-EEAA، لجمع البيانات. هنا، ممثل NEMO-EEAA بلورات ملامح حيود، وتظهر.التحليل الهيكلي للبروتين NEMO-EEAA، يكشف عن homodimeric غير منتظمة موازية ملفوف الملف، ما يقرب من 175 انجستروم في الطول. منطقة الملفوف العادية ، تشمل تسلسل محول الملفوف المثالي ، في نهاية المطاف. وأول هبتادين من التسلسل الصحيح NEMO.ملف ملفي عادي، موجود أيضًا في الـ C. بدءا من مخلفات NEMO 97 وتشمل محطة C محول الملفوف الملفوف. هيكل IKK بيتا ملزمة، ويعرض تأكيدا أكثر انفتاحا ملف ملفي، لاستيعاب يغاند.مع تباعد أكبر بين تينلكال بمقدار واحد إلى 2.2 انجستروم في هذه المنطقة. هيكل ليغاند في نيمو، ويقدم هدفا جديدا لتصميم مثبطات من خلال أساليب الحساب. وللفحص البصري لجيوف الربط مع مكتبات الجزيئات الصغيرة.لدينا الآن مسار لبلورة بناء NEMO المهندسة في مجمع مع يغاندس جزيء صغير. للمساعدة في تطوير وتحسين فئة جديدة من مثبطات.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em&gt; C. صعب</em&gt; PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

تحصين الألبكة (باكوس لاما) مع المستضدات البروتين وإنتاج محددة مستضد "واحد المجال الأجسام المضادة"

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

التركيب البلوري للمجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من إكسيلوستيلا بلوتيلا

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...