Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Vi takker Prof. D. Madden, for mange nyttige diskussioner i hele dette projekt. Vi takker Prof. D. bolt for den gave af plasmid, der indeholder den optimerede GCN4 oprullet Coil. Vi takker Dr. B. Guo for NEMO Plasmids. Vi takker Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili og Amy E. Kennedy for at demonstrere proceduren. Vi takker biomt krystallografi Core Facility og afdelingerne for kemi og biokemi & Cell Biology på Dartmouth for brugen af krystallografi udstyr og biomt personale for deres støtte. Denne forskning anvendes AMX strålinger af national Synchrotron Light source II, en U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science bruger facilitet drives til Doe Office of Science af Brookhaven National Laboratory under kontrakt nr. DE-SC0012704. Vi takker personalet på NSLS II for deres støtte. Dette arbejde blev finansieret af NIH Grants R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 og P20GM113132 og en roman og interaktiv støtte fra Munck-Pfefferkorn.

1. konstruktion af konstruktion til krystallografi
<ol><li>Klon sekvensen af NEMO-EEAA som i tidligere publikation12 i en vektor for ekspression i E. coli ved hjælp af T7 promotoren, herunder et N-terminal Hexa-histidintag og et proteasespaltings sted. Bemærk: i denne protokol, vi brugte en vektor modificeret til at omfatte en N-terminal Hexa-histidine tag og en tobak etch virus (TEV) kavaler plads10. Denne vektor letter spaltning af hans tag for protein kry...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Krystalliserings forsøg fra NEMO i ubundet form mislykkedes, herunder forsøg med at bruge fuld længde protein og flere trunkering konstruktioner, der omfatter IKK-binding domæne. Vores biofysiske karakterisering af ikk-bindende domæne af Nemo (rester 44-111) af cirkulær dichroism, NMR spektroskopi og fluorescens anisotropi indikerede, at konstruktionen, omend i stand til at binde ikkβ, eksisterede i en tilstand af konformationel udveksling, ikke egnet til krystallisering9,<sup cl...

NF-κB-vejen aktiveres som reaktion på en række stimuli, herunder cytokiner, mikrobielle produkter og stress, for at regulere ekspression af målgener, der er ansvarlige for inflammatorisk og immunrespons, celledød eller overlevelse og spredning1. Patologier, herunder inflammatoriske og autoimmune sygdomme og kræft2,3,4,5 er blevet korreleret til hyperaktivering af stien, som har gjort graduering af NF-κb aktivitet et første mål for udviklingen af nye terapier6,7.
Især den kanoniske NF-κB-vej adskiller sig fra den ikke-kanoniske vej, der er ansvarlig for lymfadorganogenesen og B-celle aktivering, af den tidligere afhængighed af stilladset protein NEMO (NF-κB Essential modulator8) til samlingen af ikk-komplekset med kinaser ikkα og ikkβ. IKK-komplekset er ansvarligt for fosforyleringen af IκBα (hæmmer af κB), der er målrettet mod nedbrydning, hvilket frigør NF-κB-dimere til at omplacere til kernen for gentransskription1 og er derfor et attraktivt mål for udviklingen af inhibitorer til at moduere NF-κb aktivitet.
Vores forskning fokuserer på karakterisering af protein-protein interaktion mellem NEMO og IKKβ, målretning NEMO for udvikling af små molekyler hæmmere af IKK komplekse dannelse. Den minimale binding domæne NEMO, der kræves for at binde IKKβ, omfatter rester 44-111, og dens struktur er blevet fastlagt i kompleks med et peptid svarende til IKKβ sekvens 701-7459. Nemo og ikkβ danner en fire-Helix bundle, hvor Nemo dimer rummer de to skruelinjer af ikkβ (701-745) i en aflang åben rille med en udvidet interaktions grænseflade. IKKβ (734-742), også kendt som NEMO-binding domæne (NBD), definerer den vigtigste hot-spot for binding, hvor de to essentielle tryptophans (739.741) begrave dybt i NEMO lomme. Detaljerne i den komplekse struktur kan støtte i struktur-baserede design og optimering af små molekyle hæmmere rettet mod NEMO. Samtidig er det vanskeligt, at binding af et lille molekyle eller peptid ville genskabe i NEMO den fulde konformationsmæssige ændring (dvs. omfattende åbning af NEMO coiled-Coil dimer) forårsaget af binding af den lange IKKβ (701-745), som observeret i krystal, og strukturen af ubundet NEMO eller NEMO bundet til en lille molekyle hæmmer kan repræsentere et bedre mål for struktur-baserede stof design og inhibitor optimering.
Fuld længde NEMO og mindre trunkering konstruktioner, der omfatter IKK-bindende domæne har vist sig ufuldstændigt for struktur beslutsomhed i ubundet form via røntgenkrystallografi og nuklear magnetisk resonans (NMR) metoder10, som fik os til at designe en forbedret version af ikk-bindende domæne Nemo. Faktisk, NEMO (44-111) i ubundet form er kun delvist foldet og gennemgår konformationel udveksling og vi derfor indstillet til at stabilisere sin dikemeje struktur, coiled-Coil fold og stabilitet, samtidig bevare binding affinitet for IKKβ. Ved at tilføje tre heptads af ideelle dikemeje oprullet-Coil sekvenser11 på N-og C-Termini af proteinet, og en serie af fire punktmutationer, vi genererede Nemo-eeaa, en konstruktion fuldt dikemeje og foldet i en oprullet spole, som reddede ikk-bindende affinitet til nanomolær rækkevidde som observeret for fuld længde Nemo12. Som en yderligere fordel, vi håbede de coiled-Coil adaptere (baseret på GCN4 sekvens) ville lette krystallisering og i sidste ende støtte i røntgen struktur bestemmelse via molekylære udskiftning. Oprullet-Coil adaptere har været på samme måde udnyttes til både øge stabiliteten, forbedre opløsningen adfærd og lette krystallisering for trikemeje oprullet Coils og antistof fragmenter13,14. NEMO-EEAA er let udtrykkes og renses fra Escherichia. coli -celler med et Klødet histidin-tag, er opløseligt, foldet i en stabil, dikemeje, rullet spole og er let krystalliseret, med diffraktion til 1,9 Å. Tilstedeværelsen af de bestilte coiled-Coil regioner i GCN4 kunne desuden støtte i udfasning af data fra krystaller af NEMO-EEAA ved molekyl udskiftning ved hjælp af den kendte struktur af GCN415.
I betragtning af de opnåede resultater med APO-NEMO-EEAA, mener vi de protokoller, der er beskrevet her, kunne også anvendes til krystalliseringen af NEMO-EEAA i nærværelse af små peptider (som NBD peptid) eller små molekyle hæmmere, med det mål at forstå kravene til NEMO hæmning og struktur-baseret optimering af indledende bly hæmmere til høj affinitet I betragtning af den plasticitet og dynamiske karakter af mange coiled-Coil domæner16, kan brugen af de coiled-Coil adaptere finde mere generel anvendelighed i medvirken strukturel beslutsomhed.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO er et stilladser protein, der spiller en vigtig rolle i NF-κB-vejen ved at samle IKK-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Ved aktivering er ikk Complex fosforylerer iκb molekyler, som fører til NF-κb nuklear translokation og aktivering af Target gener. Hæmning af NEMO/IKK interaktion er en attraktiv terapeutisk paradigme for graduering af NF-κB pathway aktivitet, gør NEMO et mål for hæmmere design og opdagelse. For at lette processen med opdagelse og optimering af NEMO-hæmmere, vi konstrueret en forbedret konstruktion af IKK-bindende domæne NEMO, der ville give mulighed for struktur bestemmelse af proteinet i APO form og mens bundet til små molekylvægt hæmmere. Her præsenterer vi den strategi, som anvendes til design, udtryk og strukturel karakterisering af IKK-bindende domæne NEMO. Proteinet udtrykkes i E. coli -celler, opløseliseret under Denaturerings betingelser og renses gennem tre kromatografiske trin. Vi diskuterer protokoller for at få krystaller til struktur bestemmelse og beskrive data erhvervelse og analyse strategier. Protokollerne vil finde bred anvendelighed til strukturen bestemmelse af komplekser af NEMO og små molekyle hæmmere.

Kloning, udtryk og oprensning af IKK-bindende domæne NEMO. Protokollen fulgte i denne undersøgelse for at opnå den endelige sekvens af NEMO-EEAA (figur 1A), som producerede diffraktion kvalitet krystaller, involveret udtryk og karakterisering af alle de mellemliggende konstruktioner, herunder tilsætning af de coiled-Coil adaptere på N-og eller C-TERMINUS, MUTATIONER C76A, C95S og MUTATIONER E56A, E57A. Figur 1B</...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Vi beskriver protokoller for strukturen bestemmelse af IKK-bindende domæne NEMO af X-ray crystallography. Metoderne omfatter protein ekspression, rensning og karakterisering samt strategier for vellykket krystal optimering og struktur bestemmelse af proteinet i sin ubundne form.

Produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af IKK-bindings domænet NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Denne protokol letter en vellykket strukturbestemmelse af NEMO's bindende område i IKK i ubundet form. Og detaljer om dens produktion og krystallisering. Protokollen, udnytter denne stabilisering af den oprindelige bekræftelse af IKK bindende domæne fragment af NEMO, gennem oprullede-coil adaptere, som letter krystallisering og struktur bestemmelse.NEMO's strukturelle biologi som mål giver en vigtig fordel i udviklingen af NEMO-hæmmere til behandling af inflammatoriske og autoimmune sygdomme og kræft. Denne protokol kan udvides til struktur bestemmelse af NEMO komplekser, med peptid eller små molekyle hæmmere for narkotika opdagelse eller optimering. Proteinets omfoldning og koncentration i proteinproduktionsstadiet er afgørende for at opnå en ren NEMO-dimer.Begrænsning af sammenlægning og sikring af opløselighed under krystalliseringsforhold. Demonstration af procedurerne vil være Tamar og Amy, kandidatstuderende i vores laboratorium. Begynd med at tilføje 20 milliliter fantastisk bouillon løsning.Og 20 mikroliter af en 100 milligram pr. milliliter lageropløsning af ampicillin. Til en 125 milliliter Erlenmeyer kolbe. Efterfulgt af et par mikroliter af celleglycerol lager, fra 80 grader Celsius opbevaring, af BL21DE3 kompetente celler.Transformeret med vektor. Efter at have rystet starterkulturen natten over, ved 37 grader Celsius og 220 rotationer i minuttet, fortyndes cellerne til en OD600 på 0,1 og 250 milliliter fantastisk bouillon. Og tilsæt ampicillin til en endelig koncentration på 100 mikrogram pr. milliliter.Når kulturens OD600 når 0,8 til 1, skal du tilføje IPTG til kulturen til en 500 mikromolarkoncentration. Og vokse cellerne i fire timer, ved 37 grader Celsius, indtil OD600 når seks til 10. Ved inkubationens afslutning sedimenteres cellerne ved centrifugering.Og re-suspendere pellet i 40 milliliter lysis buffer. Opdel de re-suspenderede celler i to 20 til 25 milliliter aliquots. Og bruge en fransk presse til at anvende ca 25,000 pounds per kvadrattomme af pres på cellerne, to til tre gange pr aliquot, i et koldt rum.Dernæst tilsættes urinstof til cellen lysates, til en endelig koncentration af otte kindtand. Og inkuber celleløsningen på en gyngeplatform i to til 16 timer ved stuetemperatur. Næste morgen overføres lysaterne til ultracentrifugerør, til mindst tre fjerdedele fulde, pr. rør.Og ulrta centrifuge lysates, i 45 minutter. Supernatanterne dekanteres i et konisk rør på 50 milliliter. Og læg urinstof inkuberet supernatant på en IMAC kolonne, på tre milliliter i minuttet.Når alle supernatanten er løbet gennem kolonnen, vaskes kolonnen for 10 kolonnevolumener med bindingsbuffer ved tre milliliter pr. minut. Og udføre gradient elution af NEMO-EEAA protein fra 10 til 500 millimolar imidazol, over en 12 kolonne volumen gradient. Indsamling af en milliliter aliquots af eluatet, i en fraktion samling plade.Efter SDS side analyse, trække fraktioner, der indeholder det rene mål protein og måle proteinkoncentrationen ved Bradford assay, i henhold til standardprotokol. Vælg de undslede fraktioner, der indeholder protein. For at kløve HIS6-mærket og fjerne overskydende imidazol fra prøven tilsættes TEV-protease ved et 1-10-vægtforhold af TEV-kløvet protein til målproteinprøven.Og spil prøven natten over i fire liter 20 millimolar Tris. 150 millimolarnatroridchlorid og to millimolar DTT-opløsning. Næste morgen indlæses TEV-den kløvet NEMO-EEAA-prøve på en anden IMAC-kolonne med en milliliter pr. minut.Opsamling af strømmen i en milliliter fraktioner, i en 96 skål fraktion indsamling plade. Kolonnen vaskes med fem bind på 20 millimolar tris, 150 millimolar natriumchlorid og 10 millimolar imidazolopløsning ved en milliliter pr. minut. Efter den sidste vask blev TEV og uncleaved HIS6 NEMO-EEAA med tre kolonnevolumener på 20 millimolar tris, 150 millimolar natriumchlorid, 500 millimolar imidazol og to millimolar DTT-opløsning i en 50 milliliterkolbe.Gennem fraktioner, der indeholder kløvet NEMO-EEAA-konstruktion, trækkes den ud i en konstruktion, og prøven koncentreres med en omrørt cellekoncentrator til fem milliliter. Efter dag-til-dag dialyse som påvist, belastning fem milliliter af prøven på 16 millimeter med 60 centimeter størrelse udelukkelse kromatografi kolonner. Gentages efter behov i henhold til prøvevolumenet.Ved en milliliter pr. minut og ved to millimolar tris, 100 millimolarnatriumchlorid og to millimolar DDT-opløsning. Efter at have trukket fraktionerne, svarende til den dimeriske NEMO-EEAA, koncentreres prøven i den omrørte cellekoncentrator med en molekylvægt, der afskar membranen på tre kilodalton, til en endelig koncentration på 113 mikromolar. Derefter, aliquot proteinet til opbevaring ved fire grader Celsius, i op til en måned.For sparsom matrix screening, tilsæt 60 mikroliter af sparsom matrix opløsning i hver af de 96 brønde i en to dråbe kammer krystallisering plade. For sidde og slip damp diffusion. Og tilsæt proteinopløsningen til en robotdråbesætter.Dernæst skal du bruge en robot dråbe setter, at dispensere 100 nanoliters af proteinopløsning på 1,65 mg pr. milliliter, i et en-til-en forhold med reservoiropløsning i dråbe et, til et endeligt volumen på 200 nanoliter. Og tilsæt 66 nanoliters proteinopløsning med 134 nanoliters reservoiropløsning til et endeligt volumen på 200 nanoliter i dråbe to. Derefter straks forsegle pladen med tre tommer bred forsegling tape.Derefter opbevares bakkerne i et krystalliseringsopbevaringslager ved 20 grader Celsius. Kontrol af de indsamlede billeder automatisk, for tilstedeværelsen af krystaller, starter to dage efter opbevaring af pladerne. For frø bestand generation, overføre hele dråben indeholder krystal af interesse, i 50 mikroliter krystallisering tilstand løsning, i det medfølgende hætteglas, fra en frø generation kit.Og vortex frøet bestanden, med 20 sekunder af pulserende og 10 sekunders hvile, i tre minutter. Derefter serielt fortynde frøbestanden, i en til 10 intervaller, ned til en til 10,000. Og gemme fortyndinger på fire grader Celsius, indtil videre brug.En til to dage før afsendelse til synkrotron, skære båndet fra toppen af brønden, med krystal af interesse. Og tilsæt 0,5 mikroliter krystalliseringsopløsning, der indeholder 12%en, to propan DiO kryobeskyttelsesmiddel, direkte til brønden. Forsigtigt løsne krystal med en kryo løkke.Loop krystal fra brønden, og gemme krystal indeholder kryo loop i en puck nedsænket i flydende nitrogen, indtil forsendelse for X-ray diffraktion. Når du har modtaget røntgendiffraktionsdataene, skal du behandle de skalerede intensiteter i STAR- og ISO-serveren. Ved hjælp af en røntgenkrystallografiindeksering afskæringsværdi på 1,2 for diffraktionsgrænsen for dataene.Og læg dig til Phoenix. For at bestemme strukturen, skal du bruge X-ray struktur GCN4 som en søgemodel for molekylær udskiftning, ved hjælp af MRage i Phoenix. 4DMD struktur, vil blive defineret som et ensemble.Og MRage-løsningen vil med held blive bygget til strukturdelen, svarende til slutterminalens oprullede spoleadapter af NEMO-EEAA. søgemodellen, for begge kæder i dimeren. Det over udtrykte protein vises på et bånd, på ca 14 kilodalton molekylvægt markør, før den første IMAC kolonne rensning.Og viser et monomer band og et dimer band, på henholdsvis 14 og 28 kilodaltons, efter den første elution. TEV spaltning er næsten færdig, efter elution, gennem den anden IMAC kolonne. Næsten helt som en dimer, ved den forventede molekylvægt.Størrelse udelukkelse kromatografi, viser en enkelt top, undvige mellem 60 til 65 milliliter, der reagerer på dimer. Fin screening producerer krystaller, der kan anvendes til at producere en frøbestand til fremstilling af NEMO-EEAA krystaller, til dataindsamling. Her vises repræsentative NEMO-EEAA krystaller diffraktionsprofiler.Strukturel analyse af NEMO-EEAA protein, afslører en homodimerisk uregelmæssig parallel oprullet spole, ca 175 angstroms i længden. Den regelmæssige coiled-coil region, omfatter den ideelle oprullet-coil adapter sekvens, i slutningen endestation. Og de første to heptads af NEMO korrekt sekvens.En regelmæssig oprullet-coil, er også til stede på C-afstation. Starter ved NEMO rest 97 og omfatter C terminal ideelle oprullet-coil adapter. Den IKK beta bundet struktur, viser en mere åben oprullet-coil bekræftelse, for at imødekomme ligand.Med en større interhelical afstand med en til 2,2 angstroms i denne region. Strukturen af en ligand i NEMO, tilbyder et nyt mål for design af hæmmere gennem beregningsmetoder. Og til visuel screening af bindende lommer med små molekylebiblioteker.Vi har nu en vej til krystallisering af den konstruerede NEMO konstruktion i kompleks med små molekyleligaander. At hjælpe med at udvikle og optimere en ny klasse af inhibitorer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, krystallisation og struktur Bestemmelse af<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via mikropodning og Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide til produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af menneskelige IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering af Alpaka (Lama pacos) med Protein antigener og produktion af Antigen-specifikke enkelt domæne antistoffer

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur af den N-terminale domæne af ryanodinreceptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...