Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

We danken Prof. D. Madden voor veel nuttige discussies tijdens dit project. We danken Prof. D. Bolon voor de gave van het plasmide met de geoptimaliseerde GCN4 spiraalvormige spoel. We danken Dr. B. Guo voor NEMO plasmids. We danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili en Amy E. Kennedy voor het aantonen van de procedure. We danken de kern faciliteit voor BioMT kristallografie en de afdelingen chemie en Biochemie & celbiologie bij Dartmouth voor het gebruik van de kristallografie apparatuur en het BioMT-personeel voor hun ondersteuning. Dit onderzoek gebruikte de AMX beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse afdeling van energie (DOE) Office of Science User Facility voor het DOE Office of Science door Brookhaven National Laboratory onder contract nr. DE-SC0012704. We danken het personeel van NSLS II voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door NIH grants R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 en P20GM113132, en een Munck-Pfefferkorn roman en interactieve subsidie.

1. ontwerp van de constructie voor kristallografie
<ol><li>Kloon de sequentie van NEMO-EEAA zoals in vorige publicatie12 in een vector voor expressie in E. coli met behulp van de T7 Promoter, inclusief een N-terminale Hexa-histidine tag en een protease decolleté site. Opmerking: in dit protocol gebruikten we een vector die is aangepast om een N-terminale Hexa-histidine-tag en een tabak etch-virus (TEV) decolleté op de site10op te nemen. Deze vector vergemakk...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Kristallisatie pogingen van Nemo in de ongebonden vorm waren mislukt, inclusief pogingen met behulp van het volledige eiwit en verschillende afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten. Onze biofysische karakterisering van het IKK-bindende domein van Nemo (residuen 44-111) door Circulair dichroisme, NMR-spectroscopie en fluorescentie anisotropie gaf aan dat de constructie, zij het in staat om ikkβ te binden, bestond in een toestand van conformationele Exchange, niet geschikt voor kristallisatie<sup class...

Het NF-κB-traject wordt geactiveerd als reactie op een verscheidenheid aan stimuli, waaronder cytokines, microbiële producten en stress, om de expressie van doel genen te reguleren die verantwoordelijk zijn voor inflammatoire en immuunrespons, celdood of overleving en proliferatie1. Pathologieën zoals inflammatoire en auto-immuunziekten en kanker2,3,4,5 zijn gecorreleerd aan hyperactivatie van het traject, die modulatie van NF-κb-activiteit heeft gemaakt tot een primair doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën6,7.
Met name het canonieke NF-κB-traject onderscheidt zich van het niet-canonieke traject, verantwoordelijk voor lymvengenese en B-cel activatie, door de afhankelijkheid van de voormalige steiger proteïne NEMO (NF-κB Essential modulator8) voor de assemblage van het IKK-complex met de kinases IKKα en IKKβ. Het IKK-complex is verantwoordelijk voor de fosforylering van iκbα (remmer van κb) die het voor afbraak richt, waardoor de NF-κb-Dimeren worden vrijgemaakt om te translokaliseren naar de Nucleus voor gentranscriptie1 en daarom een aantrekkelijk doelwit is voor de ontwikkeling van remmers om NF-κb-activiteit te moduleren.
Ons onderzoek richt zich op de karakterisering van de eiwit-eiwit interactie tussen NEMO en IKKβ, gericht op NEMO voor de ontwikkeling van kleine moleculen remmers van IKK complexe formatie. Het minimale bindende domein van NEMO, dat nodig is om IKKβ te binden, omvat residuen 44-111 en de structuur ervan is bepaald in complex met een peptide overeenkomend met IKKβ-sequentie 701-7459. NEMO en IKKβ vormen een vierhelix bundel waarbij de NEMO dimeer de twee helices van IKKβ (701-745) in een langwerpige open groef met een uitgebreide interactie-interface herbergt. IKKβ (734-742), ook bekend als het NEMO-bindende domein (NBD), definieert de belangrijkste hotspot voor binding, waarbij de twee essentiële tryptophans (739.741) diep begraven in de NEMO Pocket. De details van de complexe structuur kunnen helpen bij het ontwerp op basis van structuur en optimalisatie van kleine molecuul remmers gericht op NEMO. Tegelijkertijd is het moeilijk dat de binding van een kleine molecule of peptide in NEMO de volledige conformationele verandering zou herscheppen (d.w.z. uitgebreide opening van de NEMO spiraalvormige Coil dimer) veroorzaakt door binding van de lange IKKβ (701-745), zoals waargenomen in het kristal, en de structuur van ongebonden NEMO of NEMO gebonden aan een kleine molecuul remmer kan een beter doelwit voor structuur gebaseerde drug design en remmer optimalisatie vertegenwoordigen.
Volledige lengte Nemo en kleinere afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten, hebben bewezen hardnekkige structuurbepaling in de ongebonden vorm via Röntgen kristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) methoden10, die ons ertoe aangezet om een verbeterde versie van het IKK-bindende domein van Nemo te ontwerpen. Inderdaad, NEMO (44-111) in de ongebonden vorm is slechts gedeeltelijk gevouwen en ondergaat conformationale uitwisseling en daarom zetten we ons in om zijn dimere structuur, spiraalvormige spiraal en stabiliteit te stabiliseren, terwijl de binding affiniteit voor IKKβ behouden blijft. Door het toevoegen van drie heptads van ideale dimeer spiraalvormige-Coil sequenties11 op de N-en C-Termini van het eiwit, en een reeks van vier puntmutaties, we genereerden Nemo-eeaa, een construct volledig dimeer en gevouwen in een spiraalvormige spoel, die IKK-bindende affiniteit voor de nanomolair bereik gered zoals waargenomen voor de volledige lengte Nemo12. Als bijkomend voordeel hoopten we dat de spiraalvormige spoel adapters (gebaseerd op de GCN4 sequentie) kristallisatie zouden vergemakkelijken en uiteindelijk hulp zouden kunnen verlenen bij de bepaling van de X-Ray structuur via moleculaire vervanging. Spiraalvormige spoel adapters zijn op dezelfde manier gebruikt om zowel de stabiliteit te verhogen, het gedrag van de oplossing te verbeteren en kristallisatie te vergemakkelijken voor trimere spiraalvormige spoelen en antilichaam fragmenten13,14. Nemo-eeaa wordt gemakkelijk uitgedrukt en gezuiverd uit Escherichia. coli cellen met een splijtbaar histidine tag, is oplosbaar, gevouwen in een stabiele dimeer spiraalvormige spoel en is gemakkelijk gekristalliseerd, met diffractie tot 1,9 Å. De aanwezigheid van de bestelde spiraalvormige spoel gebieden van GCN4 kan bovendien helpen bij het faseren van de gegevens van kristallen van NEMO-EEAA door moleculaire vervanging met behulp van de bekende structuur van GCN415.
Gezien de resultaten die zijn verkregen met APO-NEMO-EEAA, zijn wij van mening dat de hier beschreven protocollen ook kunnen worden toegepast op de kristallisatie van NEMO-EEAA in de aanwezigheid van kleine peptiden (zoals het NBD-peptide) of kleine molecuul remmers, met als doel de vereisten voor NEMO-remming en op structuur gebaseerde optimalisatie van initiële lood remmers te begrijpen. Gezien de plasticiteit en dynamische aard van veel spiraalvormige spoel domeinen16, het gebruik van de spiraalvormige-Coil adapters kan vinden meer algemene toepasselijkheid in medeplichtigheid van structurele bepaling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO is een steiger eiwit dat een essentiële rol speelt in het NF-κB-traject door het IKK-complex samen te stellen met de kinases IKKα en IKKβ. Na activering fosforyleert het IKK-complex de IκB-moleculen die leiden tot de nucleaire translocatie van NF-κB en de activering van doel genen. Remming van de NEMO/IKK-interactie is een aantrekkelijk therapeutisch paradigma voor de modulatie van de NF-κB-pathway activiteit, waardoor NEMO een doelwit is voorontwerp en ontdekking van remmers. Om het proces van ontdekking en optimalisatie van NEMO-remmers te faciliteren, hebben we een verbeterde constructie van het IKK-bindende domein van NEMO ontworpen dat de structuurbepaling van het eiwit in de APO-vorm mogelijk maakt en terwijl het gebonden is aan kleine moleculair gewichts remmers. Hier presenteren we de strategie die wordt gebruikt voor het ontwerp, de expressie en de structurele karakterisering van het IKK-bindende domein van NEMO. Het eiwit wordt uitgedrukt in E. coli cellen, ontbindend onder denatureringcondities en gezuiverd door middel van drie chromatografische stappen. We bespreken de protocollen voor het verkrijgen van kristallen voor de bepaling van de structuur en beschrijven gegevens acquisitie en analyse strategieën. De protocollen zullen brede toepasbaarheid vinden voor de structuurbepaling van complexen van NEMO en kleine molecuul remmers.

Klonen, expressie en zuivering van het IKK-bindende domein van NEMO. Het protocol gevolgd in deze studie om de definitieve sequentie van NEMO-EEAA (Figuur 1A), die produceerde diffractie kwaliteit kristallen, betrokken de uitdrukking en de karakterisering van alle tussenliggende constructies, met inbegrip van de toevoeging van de spiraalvormige Coil adapters op N-en of C-Terminus, de mutaties C76A, C95S en de mutaties E56A, E57A. Figu...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Dit protocol vergemakkelijkt de succesvolle structuurbepaling van het IKK bindingsdomein van NEMO, in zijn ongebonden vorm. En details van de productie en kristallisatie. Het protocol maakt gebruik van deze stabilisatie van de native bevestiging van het IKK bindingsdomeinfragment van NEMO, door middel van coiled-coil adapters, die kristallisatie en structuurbepaling vergemakkelijken.De structurele biologie van NEMO, als doelwit, biedt een belangrijk voordeel bij de ontwikkeling van NEMO-remmers voor de behandeling van ontstekings- en auto-immuunziekten en kanker. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de structuur bepaling van NEMO complexen, met peptide of kleine molecuul remmers voor drug ontdekking of optimalisatie. De eiwitreplooiing en concentratie, tijdens de eiwitproductiefase, zijn van fundamenteel belang voor het verkrijgen van een zuiver NEMO dimer.Aggregatie beperken en oplosbaarheid garanderen onder kristallisatieomstandigheden. Het aantonen van de procedures zal Tamar en Amy, afgestudeerde studenten in ons laboratorium. Begin met het toevoegen van 20 milliliter geweldige bouillon oplossing.En 20 microliter van een 100 milligram per milliliter voorraadoplossing van ampicilline. Op een Erlenmeyer-kolf van 125 milliliter. Gevolgd door een paar microliter van cel glycerol voorraad, van 80 graden Celsius opslag, van BL21DE3 bevoegde cellen.Getransformeerd met vector. Na het schudden van de starter cultuur 's nachts, op 37 graden Celsius en 220 rotaties per minuut, verdunnen de cellen tot een OD600 van 0,1 en 250 milliliter van geweldige bouillon. En voeg ampicilline toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 microgram per milliliter.Wanneer de OD600 van de cultuur 0,8 tot 1 bereikt, voeg IPTG toe aan de cultuur, aan een 500 micromolarconcentratie. En laat de cellen vier uur groeien, bij 37 graden Celsius, tot de OD600 6 tot 10 bereikt. Aan het einde van de incubatie, sediment de cellen door centrifugatie.En de pellet opnieuw op te schorten in 40 milliliter lyse buffer. Splits de opnieuw opgehangen cellen in twee 20 tot 25 milliliter aliquots. En gebruik een Franse pers om ongeveer 25.000 pond per vierkante centimeter druk toe te passen op de cellen, twee tot drie keer per aliquot, in een koude kamer.Voeg vervolgens ureum toe aan de cellysates, tot een laatste concentratie van acht kies. En de celoplossing twee tot zestien uur uitbroeden op een schommelplatform, bij kamertemperatuur. De volgende ochtend, breng de lysates naar ultra-centrifuge buizen, tot ten minste driekwart vol, per buis.En ulrta centrifuge de lysates, gedurende 45 minuten. Decanteer de supernatants in een 50 milliliter conische buis. En laad de ureum geïncubeerd supernatant op een IMAC kolom, op drie milliliter per minuut.Wanneer alle supernatant door de kolom is gelopen, wast u de kolom voor 10 kolomvolumes, met bindingsbuffer, met drie milliliter per minuut. En voer gradiënt elutie van de NEMO-EEAA eiwit van 10 tot 500 millimolar imidazole, over een 12 kolom volume gradiënt. Het verzamelen van een milliliter aliquots van het eluaat, in een fractie collectie plaat.Na SDS pagina analyse, trek de fracties met de pure doeleiwit en meet de eiwitconcentratie door Bradford test, volgens standaard protocol. Selecteer de ontweken fracties, die eiwitten bevatten. Om de HIS6-tag te klemmen en overtollige imidazool uit het monster te verwijderen, voegt u TEV protease, met een gewichtsverhouding van één tot 10, van TEV-gespleten eiwit toe aan het doeleiwitmonster.En verwijd het monster 's nachts in vier liter van 20 millimolar Tris. 150 millimolar natriumchloride en twee millimolar DTT-oplossing. Laad de volgende ochtend het NEMO-EEAA-monster van TEV op een tweede IMAC-kolom met één milliliter per minuut.Het verzamelen van de stroom door in een milliliter fracties, in een 96 kom fractie collectie plaat. Was de kolom met vijf volumes van 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumchloride en 10 millimolar imidazool oplossing, op één milliliter per minuut. Na de laatste wasbeurt, elute de TEV en oomaved HIS6 NEMO-EEAA, met drie kolomvolumes van 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumchloride, 500 millimolar imidazole en twee millimolar DTT oplossing, in een 50 milliliter kolf.Trek de stroom door fracties, met cleaved NEMO-EEAA constructie en concentraat het monster met een geroerde cel concentrator, tot vijf milliliter. Na 's nachts dialyse zoals aangetoond, belasting vijf milliliter van het monster op 16 millimeter bij 60 centimeter grootte uitsluiting chromatografie kolommen. Indien nodig herhalen, afhankelijk van het monstervolume.Op een milliliter per minuut, en op twee millimolar Tris, 100 millimolar natriumchloride en twee millimolar DDT oplossing. Na het trekken van de breuken, die overeenkomen met de dimeric NEMO-EEAA, concentreer het monster in de geroerde celconcentraator, met een moleculair gewicht afgesneden membraan van drie kilodalton, tot een uiteindelijke concentratie van 113 micromolar. Dan, aliquot het eiwit voor opslag op vier graden Celsius, voor maximaal een maand.Voor schaarse matrix screening, voeg 60 microliter van schaarse matrix oplossing in elk van de 96 putten van een twee druppelkamer kristallisatie plaat. Voor zitten en laten vallen damp diffusie. En voeg de eiwitoplossing toe aan een robotdruppelsetter.Gebruik vervolgens een robotdruppelsetter, om 100 nanoliter eiwitoplossing af te geven met 1,65 milligram per milliliter, in een één-op-één verhouding met reservoiroplossing in druppel één, tot een eindvolume van 200 nanoliter. En voeg 66 nanoliter eiwitoplossing met 134 nanopleer van reservoiroplossing toe, aan een eindvolume van 200 nanoliters in druppel twee. Sluit vervolgens onmiddellijk de plaat af met drie inch brede afdichtingstape.Bewaar vervolgens de trays in een kristallisatie imager opslag, op 20 graden Celsius. Het controleren van de beelden automatisch verzameld, op de aanwezigheid van kristallen, te beginnen twee dagen na het opslaan van de platen. Voor het genereren van zaadvoorraden, breng de hele druppel met het kristal van belang, in 50 microliter van kristallisatie voorwaarde oplossing, in de meegeleverde flacon, van een zaad generatie kit.En vortex de zaadvoorraad, met 20 seconden pulseren en 10 seconden rust, gedurende drie minuten. Verdun vervolgens de zaadvoorraad in één tot tien stappen in serie, tot één tot 10.000. En bewaar de verdunningen op vier graden Celsius, tot verder gebruik.Een tot twee dagen voor verzending naar synchrotron, snijd de tape van de bovenkant van de put, met het kristal van belang. En voeg 0,5 microliter kristallisatieoplossing toe met 12%één, twee propaan DiO cryoprotectant, direct aan de put. Verjagen het kristal voorzichtig met een cryo-lus.Loop het kristal uit de put en bewaar het kristal met cryo-lus in een puck ondergedompeld in vloeibare stikstof, tot verzending voor röntgendiffractie. Na ontvangst van de röntgendiffractiegegevens verwerkt u de geschaalde intensiteiten in de STAR- en ISO-server. Met behulp van een x-ray kristallografie indexering afgesneden gemiddelde, van 1,2 voor de diffractie limiet oppervlak voor de gegevens.En laad op Phoenix. Om de structuur te bepalen, gebruik de röntgenstructuur van GCN4 als zoekmodel voor moleculaire vervanging, met behulp van MRage in Phoenix. De 4DMD structuur, zal worden gedefinieerd als een ensemble.En de MRage-oplossing zal met succes bouwen aan het structuurgedeelte, wat overeenkomt met de eindterminal coiled-coil adapter van NEMO-EEAA. aan het zoekmodel, voor beide kettingen in het dimer. Het over uitgedrukte eiwit verschijnt bij een band, bij ongeveer 14 kilodalton moleculaire gewichtsteller, vóór de eerste kolomzuivering IMAC.En toont een monomeer band en een dimer band, op 14 en 28 kilodaltons, respectievelijk, na de eerste elutie. TEV decolleté is na de elutie na de elutie vrijwel compleet via de tweede IMAC-kolom. Bijna volledig als een dimer, op het verwachte molecuulgewicht.Grootte uitsluiting chromatografie, toont een enkele piek, ontgaan tussen 60 tot 65 milliliter, die reageren op de dimer. Fijne screening produceert kristallen die kunnen worden gebruikt om een zaadvoorraad te produceren voor de productie van NEMO-EEAA-kristallen, voor het verzamelen van gegevens. Hier worden representatieve NEMO-EEAA kristallen diffractieprofielen getoond.Structurele analyse van het NEMO-EEAA eiwit, onthult een homodimerische onregelmatige parallelle coiled-coil, ongeveer 175 angstroms in lengte. De reguliere coiled-coil regio, omvat de ideale coiled-coil adapter sequentie, aan het einde eindeinde. En de eerste twee heptads van de NEMO juiste sequentie.Een regelmatige opgerolde spoel, is ook aanwezig op de C eindpunt. Te beginnen bij NEMO residu 97 en omvat de C terminal ideale coiled-coil adapter. De IKK beta gebonden structuur, toont een meer open coiled-coil bevestiging, om de ligand tegemoet te komen.Met een grotere interhelical afstand door één tot 2.2 angstroms in dit gebied. De structuur van een ligand in NEMO, biedt een nieuw doel voor het ontwerp van remmers door middel van computationele methoden. En voor de visuele screening van bindingszakken met kleine moleculebibliotheken.We hebben nu een pad voor kristallisatie van de engineered NEMO constructie in complex met kleine molecuul liganden. Om te helpen bij het ontwikkelen en optimaliseren van een nieuwe klasse van remmers.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisatie van alpaca's (Lama pacos) met eiwit antigenen en productie van antigeen-specifieke enkel domein antilichamen

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...