Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Nous remercions le professeur D. Madden pour les nombreuses discussions utiles qui ont eu lieu tout au long de ce projet. Nous remercions le professeur D. Bolon pour le don du plasmide contenant la bobine optimisée GCN4 enroulée. Nous remercions le Dr B. Guo pour les plasmides NEMO. Nous remercions Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili et Amy E. Kennedy d'avoir démontré la procédure. Nous remercions l'installation de base de cristallographie BioMT et les départements de chimie et de biochimie et de biologie cellulaire de Dartmouth pour l'utilisation de l'équipement de cristallographie et du personnel de BioMT pour leur soutien. Cette recherche a utilisé la ligne de faisceau AMX du National Synchrotron Light Source II, un Office of Science User Facility du département de l'Énergie des États-Unis exploité pour le DOE Office of Science par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704. Nous remercions le personnel de NSLS II pour son soutien. Ces travaux ont été financés par les subventions des NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 et P20GM113132, ainsi qu'une subvention Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

1. Conception de la construction pour la cristallographie
<ol><li>Clonez la séquence de NEMO-EEAA comme dans la publication précédente12 dans un vecteur d'expression chez E. coli en utilisant le promoteur T7, y compris une étiquette D'hexa-histidine N-terminal e et un site de clivage de protéase. REMARQUE : Dans ce protocole, nous avons utilisé un vecteur modifié pour inclure une étiquette d'hexa-histidine N-terminale et un site de clivage du virus du tabac Etch (TEV)<sup cla...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Les tentatives de cristallisation de NEMO sous la forme non liée ont échoué, y compris des tentatives utilisant la protéine pleine longueur et plusieurs constructions de truncation englobant le domaine iKK-contraignant. Notre caractérisation biophysique du domaine iKK-contraignant de NEMO (résidus 44-111) par dichroisme circulaire, spectroscopie RmN et anisotropy de fluorescence a indiqué que la construction, bien que capable de lier IKK, existait dans un état d'échange conformationnel, ne convient pas à la cri...

La voie NF-B est activée en réponse à une variété de stimuli, y compris les cytokines, les produits microbiens et le stress, pour réguler l'expression des gènes cibles responsables de la réponse inflammatoire et immunitaire, la mort cellulaire ou la survie et la prolifération1. Les pathologies, y compris les maladies inflammatoires et auto-immunes et le cancer2,3,4,5 ont été corrélées à l'hyperactivation de la voie, qui a fait de la modulation de l'activité NF-B une cible de choix pour le développement de nouvelles thérapies6,7.
La voie canonique NF-B en particulier se distingue de la voie non canonique, responsable de la lymphorganogenèse et de l'activation des cellules B, par la dépendance de l'ancien à la protéine d'échafaudage NEMO (modulateur essentiel NF-B8) pour l'assemblage du complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Le complexe IKK est responsable de la phosphorylation de l'IB (inhibiteur de l'IB) qui le cible pour la dégradation, libérant les dieux NF-B pour se translocaliser au noyau pour la transcription génique1 et est donc une cible attrayante pour le développement d'inhibiteurs pour moduler l'activité NF-B.
Notre recherche se concentre sur la caractérisation de l'interaction protéine-protéine entre NEMO et IKKMD, ciblant NEMO pour le développement de petites molécules inhibitrices de la formation complexe IKK. Le domaine de liaison minimal de NEMO, requis pour lier IKKMD, englobe les résidus 44-111, et sa structure a été déterminée en complexe avec un peptide correspondant à la séquence IKKMD 701-7459. NEMO et IKKMD forment un faisceau de quatre hélices où le dimère NEMO accueille les deux helices d'IKKMD(701-745) dans une rainure ouverte allongée avec une interface d'interaction étendue. IKK(734-742), également connu sous le nom de domaine neMO-contraignant (NBD), définit le point chaud le plus important pour la liaison, où les deux tryptophanes essentiels (739 741) enterrent profondément dans la poche NEMO. Les détails de la structure complexe peuvent aider à la conception et à l'optimisation de la structure des inhibiteurs de petites molécules ciblant NEMO. Dans le même temps, il est difficile que la liaison d'une petite molécule ou d'un peptide recrée dans NEMO le changement conformationnel complet (c.-à-d., ouverture étendue du dimère enroulé-enroulé NEMO) causé par la liaison du long IKKMD(701-745), comme on l'observe dans le cristal, et la structure de NEMO ou NEMO non lié à un inhibiteur de petite molécule peut représenter une meilleure cible pour la conception et l'inhibition de la conception et de l'inhibition des médicaments basés sur la structure.
La pleine longueur NEMO et les constructions de truncation plus petites englobant le domaine IKK-contraignant se sont avérées insolubles pour la détermination de structure dans la forme non liée par l'intermédiaire de la cristallographie de rayon X et des méthodes de résonance magnétique nucléaire (NMR)10,qui nous a incités à concevoir une version améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO. En effet, NEMO (44-111) sous la forme non liée n'est que partiellement plié et subit un échange conformationnel et nous nous sommes donc mis à stabiliser sa structure dimérique, pli de bobine enroulée et la stabilité, tout en préservant l'affinité de liaison pour IKK. En émettant trois heptades de séquences idéales de bobines sombres11 au n et C-termini de la protéine, et une série de mutations à quatre points, nous avons généré NEMO-EEAA, une construction entièrement dimérique et pliée dans une bobine enroulée, qui a sauvé l'affinité IKK-liaison à la gamme nanomolar comme observé pour la pleine longueur NEMO12. Comme avantage supplémentaire, nous espérions que les adaptateurs enroulés (basés sur la séquence GCN4) faciliteraient la cristallisation et, éventuellement, faciliteraient la détermination de la structure des rayons X par le remplacement moléculaire. Les adaptateurs enroulés ont été utilisés de la même façon pour augmenter la stabilité, améliorer le comportement de la solution et faciliter la cristallisation des bobines et des fragments d'anticorps trimmériques13,14. NEMO-EEAA est facilement exprimé et purifié à partir des cellules Escherichia. coli avec une étiquette cléavable Histidine, est soluble, plié dans une bobine faible stable enroulée et est facilement cristallisé, avec une diffraction à 1,9 . La présence des régions à bobines commandées de GCN4 pourrait en outre aider à l'apaisement des données des cristaux de NEMO-EEAA par remplacement moléculaire en utilisant la structure connue de GCN415.
Compte tenu des résultats obtenus avec apo-NEMO-EEAA, nous croyons que les protocoles décrits ici pourraient également être appliqués à la cristallisation de NEMO-EEAA en présence de petits peptides (comme le peptide NBD) ou d'inhibiteurs de petites molécules, dans le but de comprendre les exigences pour l'inhibition de NEMO et l'optimisation basée sur la structure des inhibiteurs initiaux de plomb à une affinité élevée. Étant donné la plasticité et la nature dynamique de nombreux domaines enroulés16, l'utilisation des adaptateurs enroulés pourrait trouver une applicabilité plus générale pour faciliter la détermination structurelle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO est une protéine d'échafaudage qui joue un rôle essentiel dans la voie NF-B en assemblant le complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Lors de l'activation, le complexe IKK phosphorylate les molécules i-B conduisant à la translocation nucléaire NF-B et à l'activation des gènes cibles. L'inhibition de l'interaction NEMO/IKK est un paradigme thérapeutique attrayant pour la modulation de l'activité de la voie NF-B, faisant de NEMO une cible pour la conception et la découverte d'inhibiteurs. Pour faciliter le processus de découverte et d'optimisation des inhibiteurs NEMO, nous avons conçu une construction améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO qui permettrait la détermination de la structure de la protéine sous forme d'apo et tout en se liant à de petits inhibiteurs du poids moléculaire. Ici, nous présentons la stratégie utilisée pour la conception, l'expression et la caractérisation structurelle du domaine IKK-contraignant de NEMO. La protéine est exprimée dans les cellules E. coli, solubilisée dans des conditions dénaturantes et purifiée par trois étapes chromatographiques. Nous discutons des protocoles pour l'obtention de cristaux pour la détermination de la structure et décrions les stratégies d'acquisition et d'analyse des données. Les protocoles trouveront une large applicabilité à la détermination de la structure des complexes de NEMO et des inhibiteurs de petites molécules.

Clonage, expression et purification du domaine iKK-contraignant de NEMO. Le protocole a suivi dans cette étude pour obtenir la séquence finale de NEMO-EEAA (Figure 1A), qui a produit des cristaux de qualité de diffraction, a impliqué l'expression et la caractérisation de toutes les constructions intermédiaires, y compris l'ajout des adaptateurs enroulés-enroulés à N- et ou C-terminus, les mutations C76A, C95S et les mutations E56A, E57A. <strong ...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Nous décrivons des protocoles pour la détermination de structure du domaine IKK-contraignant de NEMO par la cristallographie de rayon X. Les méthodes incluent l'expression, la purification et la caractérisation des protéines ainsi que des stratégies pour une optimisation réussie des cristaux et la détermination de la structure de la protéine sous sa forme non liée.

Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Ce protocole facilite la détermination réussie de la structure du domaine de liaison IKK de NEMO, dans sa forme non lécée. Et les détails de sa production et de sa cristallisation. Le protocole, tire parti de cette stabilisation de la confirmation native du fragment de domaine de liaison IKK de NEMO, à travers des adaptateurs bobines en bobines, qui facilitent la cristallisation et la détermination de la structure.La biologie structurale de NEMO, en tant que cible, fournit un avantage important dans le développement des inhibiteurs de NEMO pour le traitement des maladies inflammatoires et auto-immunes et du cancer. Ce protocole peut être étendu à la détermination de la structure des complexes NEMO, avec des inhibiteurs du peptide ou de petites molécules pour la découverte ou l’optimisation de médicaments. Le refolding et la concentration de protéine, pendant le stade de production de protéine, sont fondamentaux pour obtenir un dimère pur de NEMO.Limiter l’agrégation et assurer la solubilité dans des conditions de cristallisation. Tamar et Amy, étudiants diplômés de notre laboratoire, démontreront les procédures. Commencez par ajouter 20 millilitres de solution de bouillon formidable.Et 20 microlitres d’une solution de stock de 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline. À un flacon Erlenmeyer de 125 millilitres. Suivi de quelques microlitres de stock de glycérol cellulaire, à partir de stockage de 80 degrés Celsius, de cellules compétentes BL21DE3.Transformé avec vecteur. Après avoir secoué la culture de démarrage pendant la nuit, à 37 degrés Celsius et 220 rotations par minute, diluer les cellules à un OD600 de 0,1 et 250 millilitres de bouillon formidable. Et ajouter de l’ampicilline à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre.Lorsque l’OD600 de la culture atteint 0,8 à 1, ajouter iPTG à la culture, à une concentration de 500 micromolaires. Et faire pousser les cellules pendant quatre heures, à 37 degrés Celsius, jusqu’à ce que l’OD600 atteigne six à dix. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules par centrifugation.Et re-suspendre la pastille en 40 millilitres de tampon de lyse. Divisez les cellules re-suspendues en deux aliquots de 20 à 25 millilitres. Et utilise une presse Français pour appliquer environ 25 000 livres par pouce carré de pression sur les cellules, deux à trois fois par aliquot, dans une pièce froide.Ensuite, ajouter de l’urée aux lysates cellulaires, à une concentration finale de huit molaire. Et incuber la solution cellulaire sur une plate-forme de basculement pendant deux à 16 heures, à température ambiante. Le lendemain matin, transférer les lysates dans des tubes d’ultra-centrifugeuse, à au moins les trois quarts pleins, par tube.Et ulrta centrifugeuse les lysates, pendant 45 minutes. Décanter les supernatants dans un tube conique de 50 millilitres. Et chargez le supernatant incubé à l’urée sur une colonne IMAC, à trois millilitres par minute.Lorsque tout le supernatant a traversé la colonne, lavez la colonne pour 10 volumes de colonnes, avec tampon de liaison, à trois millilitres par minute. Et effectuer l’élitution de gradient de la protéine NEMO-EEAA de 10 à 500 millimolar imidazole, sur un gradient de volume de 12 colonnes. Collecte d’un millilitre aliquots de l’éliuate, dans une plaque de collecte fractionnée.Après l’analyse de la page SDS, tirez les fractions contenant la protéine cible pure et mesurez la concentration de protéines par essai de Bradford, selon le protocole standard. Sélectionnez les fractions échappées, contenant des protéines. Pour couper l’étiquette HIS6 et éliminer l’excès d’imidazole de l’échantillon, ajoutez la protéase TEV, à un rapport de poids de un à 10, de protéine fendée TEV, à l’échantillon de protéines cible.Et dilater l’échantillon pendant la nuit en quatre litres de Tris de 20 millimlaires. Chlorure de sodium de 150 millimlaires et solution de TNT de deux millimolaires. Le lendemain matin, chargez l’échantillon NEMO-EEAA fendue TEV sur une deuxième colonne IMAC, à un millilitre par minute.Collecte du flux à travers en une fraction millilitre, dans une plaque de collecte fraction bol 96. Lavez la colonne avec cinq volumes de Tris de 20 millimolaires, de chlorure de sodium de 150 millimlaires et de solution d’imidazole de 10 millimlaires, à un millilitre par minute. Après le dernier lavage, elute le TEV et oncleaved HIS6 NEMO-EEAA, avec trois volumes de colonne de Tris millimolar, chlorure de sodium de 150 millimlaires, imidazole millimolaire et deux millimolar DTT solution, dans un flacon de 50 millilitres.Tirez le flux à travers les fractions, contenant cleaved NEMO-EEAA construire et concentrer l’échantillon avec un concentrateur de cellules agitées, à cinq millilitres. Après la dialyse de nuit comme démontré, chargez cinq millilitres de l’échantillon sur des colonnes de chromatographie d’exclusion de taille de 16 millimètres par 60 centimètres. Répéter au besoin, selon le volume de l’échantillon.À un millilitre par minute, et à deux millimolaires Tris, chlorure de sodium de 100 millimlaires et solution DDT de deux millimolaires. Après avoir tiré les fractions, correspondant à la nemo-EEAA dimérique, concentrer l’échantillon dans le concentrateur de cellules agitées, avec un poids moléculaire coupé membrane de trois kilodalton, à une concentration finale de 113 micromolaires. Ensuite, aliquot la protéine pour le stockage à quatre degrés Celsius, pour un mois.Pour le criblage matriciel clairsemé, ajoutez 60 microlitres de solution matricielle clairsemée dans chacun des 96 puits d’une plaque de cristallisation de chambre à deux gouttes. Pour s’asseoir et laisser tomber la diffusion de vapeur. Et ajoutez la solution protéique à un drop setter robotique.Ensuite, utilisez un setter de chute robotique, pour distribuer 100 nanolitres de solution protéique à 1,65 milligramme par millilitre, dans un rapport un à un avec solution de réservoir dans la première goutte, à un volume final de 200 nanolitres. Et ajouter 66 nanolitres de solution protéique avec 134 nanolitres de solution de réservoir, à un volume final de 200 nanolitres dans la deuxième goutte. Ensuite, scellez immédiatement la plaque avec du ruban adhésif de trois pouces de large.Ensuite, rangez les plateaux dans un stockage d’imageur de cristallisation, à 20 degrés Celsius. Vérification automatique des images collectées, pour la présence de cristaux, à partir de deux jours après le stockage des plaques. Pour la production de stock de semences, transférer la goutte entière contenant le cristal d’intérêt, dans 50 microlitres de solution d’état de cristallisation, dans le flacon fourni, à partir d’un kit de génération de semences.Et vortex le stock de graines, avec 20 secondes de pulsation et 10 secondes de repos, pendant trois minutes. Ensuite, diluer périodiquement le stock de graines, en un à 10 incréments, jusqu’à un à 10 000. Et stocker les dilutions à quatre degrés Celsius, jusqu’à nouvel usage.Un à deux jours avant l’expédition au synchrotron, couper la bande du haut du puits, avec le cristal d’intérêt. Et ajouter 0,5 microlitres de solution de cristallisation contenant 12%un, deux cryoprotecteur dio propane, directement au puits. Déloger doucement le cristal avec une boucle cryo.Bouclez le cristal du puits et rangez le cristal contenant de la boucle cryo dans une rondelle immergée dans de l’azote liquide, jusqu’à l’expédition pour la diffraction des rayons X. Après avoir reçu les données de diffraction des rayons X, traiter les intensités à l’échelle dans le serveur STAR et ISO. Utilisation d’une moyenne d’indexation de cristallographie aux rayons X, de 1,2 pour la surface limite de diffraction pour les données.Et chargez sur Phoenix. Pour déterminer la structure, utilisez la structure des rayons X de GCN4 comme modèle de recherche pour le remplacement moléculaire, en utilisant MRage à Phoenix. La structure 4DMD, sera définie comme un ensemble.Et la solution MRage s’adaptera avec succès à la partie structure, correspondant à l’adaptateur de bobines en bobines terminales fin de NEMO-EEAA. au modèle de recherche, pour les deux chaînes dans le dimère. La protéine sur-exprimée apparaît à une bande, à environ 14 marqueurs de poids moléculaire kilodalton, avant la première purification de la colonne IMAC.Et affiche une bande de monomères et une bande de dimères, à 14 et 28 kilodaltons, respectivement, après la première élitution. Le clivage TEV est pratiquement complet, après l’élitution, à travers la deuxième colonne IMAC. Presque entièrement comme un dimère, au poids moléculaire attendu.Chromatographie d’exclusion de taille, affiche un pic unique, échappant entre 60 à 65 millilitres, qui répondent au dimère. Le criblage fin produit des cristaux qui peuvent être utilisés pour produire un stock de semences pour la production de cristaux NEMO-EEAA, pour la collecte de données. Ici, les profils de diffraction des cristaux NEMO-EEAA représentatifs sont affichés.L’analyse structurale de la protéine NEMO-EEAA, révèle une bobine en bobine parallèle irrégulière homodimeric, approximativement 175 angstroms dans la longueur. La région régulière en bobines en bobines englobe la séquence idéale de l’adaptateur à bobines bobines, à la fin du terminus. Et les deux premiers heptades de la séquence appropriée NEMO.Une bobine en bobine régulière, est également présente au terminus C. À partir de nemo résidus 97 et englobant le terminal C idéal adaptateur bobine bobine. La structure liée bêta IKK, affiche une confirmation plus ouverte bobine bobine, pour accueillir le ligand.Avec un espacement interhelical plus grand de un à 2,2 angstroms dans cette région. La structure d’un ligand dans NEMO, offre une nouvelle cible pour la conception des inhibiteurs par des méthodes de calcul. Et pour le criblage visuel des poches de liaison avec les bibliothèques de petites molécules.Nous avons maintenant un chemin pour la cristallisation de la construction nemo conçu dans complexe avec de petites molécules ligands. Aider au développement et à l’optimisation d’une nouvelle classe d’inhibiteurs.

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