Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Wir danken Prof. D. Madden für viele hilfreiche Diskussionen während dieses Projekts. Wir danken Prof. D. Bolon für die Gabe des Plasmids, das die optimierte GCN4-Spule enthält. Wir danken Dr. B. Guo für NEMO-Plasmide. Wir danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili und Amy E. Kennedy für die Demonstration des Verfahrens. Wir danken der BioMT Crystallography Core Facility und den Abteilungen für Chemie und Biochemie & Zellbiologie in Dartmouth für den Einsatz der Kristallographiegeräte und des BioMT-Personals für ihre Unterstützung. Diese Forschung verwendete die AMX-Beamline des National Synchrotron Light Source II, einer VomO-Abteilung für Energie (DOE) des US-Amerikanischen Energieministeriums (DOE), die für das DOE Office of Science vom Brookhaven National Laboratory unter Vertrag Nr. DE-SC0012704. Wir danken den Mitarbeitern von NSLS II für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 und P20GM113132 sowie ein Munck-Pfefferkorn Roman- und Interaktives Stipendium finanziert.

1. Konstruktion des Konstrukts für die Kristallographie
<ol><li>Klonen Sie die Sequenz von NEMO-EEAA wie in der vorherigen Publikation12 in einem Vektor für die Expression in E. coli mit dem T7-Promotor, einschließlich eines N-terminalen Hexa-Histidin-Tags und einer Protease-Spaltungsstelle. HINWEIS: In diesem Protokoll haben wir einen Vektor verwendet, der modifiziert wurde, um ein N-Terminal-Hexa-Histidin-Tag und eine Tobacco Etch Virus (TEV) Spaltungsstelle10<...

<ol>
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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. 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Kristallisationsversuche von NEMO in ungebundener Form waren erfolglos, einschließlich Versuchen, das proteinvolle Protein in voller Länge und mehrere Abschneidekonstrukte zu verwenden, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen. Unsere biophysikalische Charakterisierung der IKK-bindungsdomäne von NEMO (Rückstände 44-111) durch kreisförmigen Dichroismus, NMR-Spektroskopie und Fluoreszenz-Anisotropie zeigte, dass das Konstrukt, wenn auch in der Lage, IKK zu binden, in einem Zustand des Konformationsaustauschs existierte, ...

Der NF-B-Signalweg wird als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen aktiviert, einschließlich Zytokine, mikrobielle Produkte und Stress, um die Expression von Zielgenen zu regulieren, die für entzündliche und Immunantwort, Zelltod oder Überleben und Proliferation verantwortlich sind1. Pathologien wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen und Krebs2,3,4,5 wurden mit der Hyperaktivierung des Signalwegs korreliert, die Modulation der NF-B-Aktivität zu einem Hauptziel für die Entwicklung neuer Therapien6,7gemacht hat.
Insbesondere der kanonische NF-B-Signalweg unterscheidet sich von dem nicht-kanonischen Weg, der für die Lymphorganogenese und Die B-Zell-Aktivierung verantwortlich ist, durch die Abhängigkeit des erstgenannten vom Gerüstprotein NEMO (NF-B essential modulator8) für die Montage des IKK-Komplexes mit den Kiinasen IKK. Der IKK-Komplex ist verantwortlich für die Phosphorylierung von I-B (Inhibitor von B), die auf den Abbau abzielt, wodurch die NF-B-Dimere in den Kern für die Gentranskription1 transloziert werden können und ist daher ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Inhibitoren zur Modulation der NF-B-Aktivität.
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen NEMO und IKK, die auf NEMO für die Entwicklung kleiner Moleküle Inhibitoren der IKK-Komplexbildung abzielt. Die minimale Bindungsdomäne von NEMO, die zur Bindung von IKK benötigt wird, umfasst die Rückstände 44-111, und ihre Struktur wurde komplex mit einem Peptid bestimmt, das der IKK-Sequenz 701-7459entspricht. NEMO und IKK bilden ein Vier-Helix-Bundle, in dem der NEMO-Dimer die beiden Helices von IKK(701-745) in einer länglichen offenen Nut mit einer erweiterten Interaktionsschnittstelle unterbringt. Der ikK(734-742), auch bekannt als NEMO-Bindungsdomäne (NBD), definiert den wichtigsten Hot-Spot für die Bindung, an dem die beiden wesentlichen Tryptophans (739,741) tief in der NEMO-Tasche vergraben sind. Die Details der komplexen Struktur können bei der strukturbasierten Gestaltung und Optimierung von kleinen Molekülinhibitoren helfen, die auf NEMO abzielen. Gleichzeitig ist es schwierig, dass die Bindung eines kleinen Moleküls oder Peptids in NEMO die vollständige Konformationsänderung (d. h. die umfangreiche Öffnung des NEMO-Spulendimers) durch Bindung des langen IKK(701-745), wie im Kristall beobachtet, wieder aufbaut und die Struktur eines ungebundenen NEMO oder NEMO, der an einen kleinen Molekülinhibitor gebunden ist, ein besseres Ziel für die strukturbasierte Entwicklung und Optimierung darstellen kann.
NEMO- und kleinere Schnittkonstrukte in voller Länge, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen, haben sich über Röntgenkristallographie und Kernspinresonanz (NMR)-Methoden10als unlösbar für die Strukturbestimmung in der ungebundenen Form erwiesen, was uns dazu veranlasste, eine verbesserte Version der IKK-Bindungsdomäne von NEMO zu entwerfen. Tatsächlich ist NEMO (44-111) in ungebundener Form nur teilweise gefaltet und durchläuft einen Konformationsaustausch, und deshalb haben wir uns vorgenommen, seine dimerische Struktur, die gewickelte Spulenfalte und die Stabilität zu stabilisieren und gleichzeitig die Bindungsaffinität für IKK zu erhalten. Durch das Anhängen von drei Heptads mit idealen dimeren Coil-Spulensequenzen11 an der N- und C-Termini des Proteins und einer Reihe von Vierpunktmutationen erzeugten wir NEMO-EEAA, ein Konstrukt, das vollständig dimer und in einer gewickelten Spule gefaltet wurde und die IKK-Bindungsaffinität zum Nanomolar-Bereich rettete, wie bei NEMO12in voller Länge beobachtet. Als zusätzlichen Vorteil hofften wir, dass die Coiled-Coil-Adapter (basierend auf der GCN4-Sequenz) die Kristallisation erleichtern und schließlich bei der Bestimmung der Röntgenstruktur durch molekularen Ersatz helfen würden. Coiled-Coil-Adapter wurden in ähnlicher Weise verwendet, um sowohl die Stabilität zu erhöhen, das Lösungsverhalten zu verbessern und die Kristallisation für trimergewickelte Coils und Antikörperfragmente zu erleichtern13,14. NEMO-EEAA ist leicht exprimiert und gereinigt von Escherichia. coli-Zellen mit einem setakeablen Histidin-Tag, ist löslich, in einer stabilen dimeren gewickelten Spule gefaltet und leicht kristallisiert, mit Beugung bis 1,9 °C. Das Vorhandensein der geordneten Coiled-Coil-Regionen von GCN4 könnte zusätzlich dazu führen, dass die Daten aus Kristallen von NEMO-EEAA durch molekularen Ersatz unter Verwendung der bekannten Struktur von GCN415schrittweise abgespult werden.
Angesichts der Ergebnisse, die mit apo-NEMO-EEAA erzielt wurden, glauben wir, dass die hier beschriebenen Protokolle auch auf die Kristallisation von NEMO-EEAA in Gegenwart von kleinen Peptiden (wie dem NBD-Peptid) oder kleinen Molekülinhibitoren angewendet werden könnten, mit dem Ziel, die Anforderungen an die NEMO-Hemmung und die strukturbasierte Optimierung von anfänglichen Bleiinhibitoren auf eine hohe Affinität zu verstehen. Angesichts der Plastizität und Dynamik vieler Coiled Coil-Domänen16könnte der Einsatz der Coiled-Coil-Adapter eine allgemeinere Anwendbarkeit bei der Unterstützung der Strukturbestimmung finden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO ist ein Gerüstprotein, das eine wesentliche Rolle im NF-B-Signalweg spielt, indem es den IKK-Komplex mit den Kiinasen IKK und IKK zusammenbaut. Bei aktivierung phosphoryliert der IKK-Komplex die I-B-Moleküle, die zur NF-B-Kerntranslokation und Aktivierung von Zielgenen führen. Die Hemmung der NEMO/IKK-Wechselwirkung ist ein attraktives therapeutisches Paradigma für die Modulation der NF-B-Signalwegaktivität, was NEMO zu einem Ziel für das Design und die Entdeckung von Inhibitoren macht. Um den Prozess der Entdeckung und Optimierung von NEMO-Inhibitoren zu erleichtern, haben wir ein verbessertes Konstrukt der IKK-bindungsdomäne von NEMO entwickelt, das eine Strukturbestimmung des Proteins in der Apo-Form und gleichzeitig an kleine Molekulargewichtsinhibitoren gebunden. Hier stellen wir die Strategie für die Gestaltung, den Ausdruck und die strukturelle Charakterisierung der IKK-Bindungsdomäne von NEMO vor. Das Protein wird in E. coli-Zellen exprimiert, unter denatierenden Bedingungen solubilisiert und durch drei chromatographische Schritte gereinigt. Wir diskutieren die Protokolle zur Gewinnung von Kristallen zur Strukturbestimmung und beschreiben Datenerfassungs- und Analysestrategien. Die Protokolle werden eine breite Anwendbarkeit auf die Strukturbestimmung von Komplexen von NEMO und kleinen Molekülinhibitoren finden.

Klonen, Ausdruck und Reinigung der IKK-bindungsdomäne von NEMO. Das Protokoll, das in dieser Studie folgte, um die endgültige Sequenz von NEMO-EEAA (Abbildung 1A) zu erhalten, die Beugungsqualitätskristalle erzeugte, beinhaltete die Expression und Charakterisierung aller Zwischenkonstrukte, einschließlich der Zugabe der Spulenadapter bei N- und C-Terminus, der Mutationen C76A, C95S und der Mutationen E56A, E57A. Abbildung 1</stron...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Dieses Protokoll erleichtert die erfolgreiche Strukturbestimmung der IKK-Bindungsdomäne von NEMO in ihrer ungebundenen Form. Und Details seiner Produktion und Kristallisation. Das Protokoll nutzt diese Stabilisierung der nativen Bestätigung des IKK-Bindungsdomänenfragments von NEMO durch Coiled-Coil-Adapter, die kristallisations- und Strukturbestimmung erleichtern.Die Strukturbiologie von NEMO als Ziel bietet einen wichtigen Vorteil bei der Entwicklung von NEMO-Hemmern zur Behandlung von entzündlichen und Autoimmunerkrankungen und Krebs. Dieses Protokoll kann auf die Strukturbestimmung von NEMO-Komplexen mit Peptid- oder kleinen Molekülinhibitoren zur Wirkstoffentdeckung oder -optimierung ausgedehnt werden. Die Proteinumfaltung und Konzentration während der Proteinproduktion sind von grundlegender Bedeutung, um einen reinen NEMO-Dimer zu erhalten.Begrenzung der Aggregation und Gewährleistung der Löslichkeit unter Kristallisationsbedingungen. Demonstriert werden die Verfahren tamar und Amy, Absolventen in unserem Labor. Beginnen Sie mit 20 Milliliter n.F. tolle Brühe Lösung.Und 20 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter Lagerlösung von Ampicillin. Zu einem 125 Milliliter ErlenmeyerKolben. Gefolgt von ein paar Mikroliter Zellglycerin-Bestand, aus 80 Grad Celsius Lagerung, von BL21DE3 kompetenten Zellen.Transformiert mit Vektor. Nachdem die Starterkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt wurde, verdünnen Sie die Zellen auf eine OD600 von 0,1 und 250 Milliliter nader Brühe. Und fügen Sie Ampicillin zu einer endlichen Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.Wenn die OD600 der Kultur 0,8 bis 1 erreicht, fügen Sie IPTG zur Kultur hinzu, zu einer Konzentration von 500 Mikromolaren. Und wachsen die Zellen für vier Stunden, bei 37 Grad Celsius, bis die OD600 sechs bis zehn erreicht. Am Ende der Inkubation, Sediment die Zellen durch Zentrifugation.Und das Pellet in 40 Milliliter Lysepuffer wieder aufhängen. Teilen Sie die wieder suspendierten Zellen in zwei 20 bis 25 Milliliter Aliquots auf. Und verwenden Sie eine französische Presse, um etwa 25.000 Pfund pro Quadratzoll Druck auf die Zellen aufzutragen, zwei- bis dreimal pro Aliquot, in einem kalten Raum.Als nächstes fügen Sie Harnstoff zu den Zelllysaten hinzu, zu einer endletzten Konzentration von acht Mol. Und die Zelllösung auf einer Schaukelplattform für zwei bis 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Am nächsten Morgen die Lysate auf Ultrazentrifugenrohre übertragen, auf mindestens drei Viertel voll, pro Rohr.Und ulrta zentrifugieren die Lysate, für 45 Minuten. Dekantieren Sie die Überräube in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Und laden Sie den Harnstoff inkubierten Überstand auf eine IMAC-Säule, mit drei Milliliter pro Minute.Wenn der gesamte Überstand durch die Spalte gelaufen ist, waschen Sie die Spalte für 10 Spaltenvolumen mit Bindungspuffer bei drei Milliliterpro Minute. Und führen Gradientenelution des NEMO-EEAA-Proteins von 10 bis 500 Millimolar Imidazol über einen Volumengradienten von 12 Säulen durch. Sammeln von einem Milliliter Aliquots des Eluats, in eine Fraktion Sammelplatte.Ziehen Sie nach der SDS-Seitenanalyse die Fraktionen, die das reine Zielprotein enthalten, und messen Sie die Proteinkonzentration durch Bradford-Assay gemäß standardprotokoll. Wählen Sie die ausgedunsteten Fraktionen aus, die Protein enthalten. Um das HIS6-Tag zu spalten und überschüssiges Imidazol aus der Probe zu entfernen, fügen Sie teV-Protease mit einem Gewichtsverhältnis von 1 bis 10 von TEV-Spaltenprotein in die Zielproteinprobe ein.Und erweitern Sie die Probe über Nacht in vier Liter von 20 Millimolar Tris. 150 Millimolar Natriumchlorid und zwei Millimolar DTT-Lösung. Am nächsten Morgen die TEV-Gespaltete NEMO-EEAA-Probe mit einem Milliliter pro Minute auf eine zweite IMAC-Säule laden.Sammeln des Durchflusses in einem Milliliter-Fraktionen, in einer 96-Schalenfraktions-Sammelplatte. Waschen Sie die Säule mit fünf Volumen von 20 Millimolaren Tris, 150 Millimolar Natriumchlorid und 10 Millimolar Imidazol-Lösung, mit einem Milliliter pro Minute. Nach der letzten Wäsche, elute die TEV und uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, mit drei Säulenvolumen von 20 Millimolar Tris, 150 Millimolar Natriumchlorid, 500 Millimolar Imidazol und zwei Millimolar DTT-Lösung, in einem 50 Milliliter Kolben.Ziehen Sie den Fluss durch Fraktionen, die gespaltetes NEMO-EEAA-Konstrukt enthalten, und konzentrieren Sie die Probe mit einem gerührten Zellkonzentrator auf fünf Milliliter. Nach der nächtlichen Dialyse, wie gezeigt, laden Sie fünf Milliliter der Probe auf 16 Millimeter mal 60 Zentimeter große Ausschlusschromatographiesäulen. Wiederholen, je nach Probenvolumen.Bei einem Milliliter pro Minute und bei zwei Millimolaren Tris, 100 Millimolaren Natriumchlorid und zwei Millimolar-DDT-Lösung. Nach dem Ziehen der Fraktionen, entsprechend dem dimerischen NEMO-EEAA, konzentrieren Sie die Probe im Rührzellkonzentrator mit einem Molekulargewicht abgeschnittene Membran von drei Kilodalton auf eine Endkonzentration von 113 Mikromolaren. Dann aliquot das Protein für die Lagerung bei vier Grad Celsius, für bis zu einem Monat.Für das spärliche Matrix-Screening 60 Mikroliter dünnmatrixlösung in jede der 96 Brunnen einer Zwei-Tropfen-Kammerkristallisationsplatte geben. Zum Sitzen und Tropfen Dampfdiffusion. Und fügen Sie die Proteinlösung zu einem Roboter-Tropfensetter hinzu.Als nächstes verwenden Sie einen Roboter-Tropfen-Setter, um 100 Nanoliter Proteinlösung bei 1,65 Milligramm pro Milliliter, in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis mit Reservoir-Lösung in Tropfen eins, auf ein Endvolumen von 200 Nanolitern zu geben. Und fügen Sie 66 Nanoliter Proteinlösung mit 134 Nanoliter Reservoir-Lösung, zu einem Endvolumen von 200 Nanoliter in Tropfen zwei. Dann versiegeln Sie die Platte sofort mit drei Zoll breitem Dichtband.Dann lagern Sie die Schalen in einem Kristallisations-Imager-Speicher, bei 20 Grad Celsius. Überprüfung der automatisch gesammelten Bilder, auf das Vorhandensein von Kristallen, beginnend zwei Tage nach der Lagerung der Platten. Übertragen Sie bei der Samenstammerzeugung den gesamten Tropfen, der den Kristall des Interesses enthält, in 50 Mikroliter Kristallisationsbedingungslösung, in der mitgelieferten Durchstechflasche, aus einem Saatguterzeugungskit.Und wirbeln Sie den Samenstock, mit 20 Sekunden Pulsieren und 10 Sekunden Ruhe, für drei Minuten. Anschließend den Saatgutbestand in einem bis zehn Schritten seriell auf ein bis 10 000 verdünnen. Und die Verdünnungen bei vier Grad Celsius lagern, bis zur weiteren Verwendung.Ein bis zwei Tage vor dem Versand zu Synchrotron, schneiden Sie das Band von der Oberseite des Brunnens, mit dem Kristall von Interesse. Und fügen Sie 0,5 Mikroliter Kristallisationslösung mit 12%ein, zwei Propan DiO Kryoschutzmittel, direkt in den Brunnen. Lösen Sie den Kristall vorsichtig mit einer Kryoschlaufe.Schleifen Sie den Kristall aus dem Brunnen, und speichern Sie den Kristall enthalten Kryoschleife in einem Puck in flüssigen Stickstoff getaucht, bis versandt für Röntgenbeugung. Nach dem Empfang der Röntgenbeugungsdaten werden die skalierten Intensitäten im STAR- und ISO-Server verarbeitet. Mit Hilfe eines Röntgenkristallographie-Indexierungsmittels von 1,2 für die Beugungsgrenzoberfläche für die Daten.Und laden Sie auf Phoenix. Um die Struktur zu bestimmen, verwenden Sie die Röntgenstruktur von GCN4 als Suchmodell für molekularen Ersatz, mit MRage in Phoenix. Die 4DMD-Struktur wird als Ensemble definiert.Und die MRage-Lösung wird erfolgreich auf den Strukturteil aufbauen, entsprechend dem Endklemmen-Coiled-Coil-Adapter von NEMO-EEAA. zum Suchmodell, für beide Ketten im Dimer. Das überexprimierte Protein erscheint in einem Band, bei etwa 14 Kilodalton Molekulargewichtsmarker, vor der ersten IMAC-Säulenreinigung.Und zeigt ein Monomer-Band und ein Dimer-Band, bei 14 bzw. 28 Kilodaltons, nach der ersten Elution. Die TEV-Spaltung ist nach der Elution durch die zweite IMAC-Säule praktisch vollständig. Fast ausschließlich als Dimer, beim erwarteten Molekulargewicht.Größenausschlusschromatographie, zeigt eine einzelne Spitze, die zwischen 60 und 65 Milliliter, die auf den Dimer reagieren. Feinsieb produziert Kristalle, die zur Herstellung eines Saatgutbestands für die Herstellung von NEMO-EEAA-Kristallen für die Datenerfassung verwendet werden können. Hier werden repräsentative NEMO-EEAA Kristallbeugungsprofile gezeigt.Die Strukturanalyse des NEMO-EEAA-Proteins zeigt eine homodimerische unregelmäßige parallele Coiled-Spule mit einer Länge von ca. 175. Der reguläre Coiled-Coil-Bereich umfasst die ideale Coiled-Coil-Adaptersequenz am Endterminus. Und die ersten beiden Heptads der NEMO richtigen Sequenz.Eine regelmäßige Coiled-Spule ist auch an der Endstation C vorhanden. Ab NEMO-Rückstand 97 und umfasst die C-Klemme idealen Coiled-Coil-Adapter. Die IKK Beta-gebundene Struktur zeigt eine offenere Coiled-Coil-Bestätigung, um den Liganden unterzubringen.Mit einem größeren interhelischen Abstand um eins bis 2,2 Angstroms in dieser Region. Die Struktur eines Liganden in NEMO, bietet ein neues Ziel für die Entwicklung von Inhibitoren durch Rechenmethoden. Und für das visuelle Screening von Bindungstaschen mit kleinen Molekülbibliotheken.Wir haben jetzt einen Weg zur Kristallisation des konstruierten NEMO-Konstrukts in Komplex mit kleinen Molekülliganden. Unterstützung bei der Entwicklung und Optimierung einer neuen Klasse von Inhibitoren.

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Biochemistry

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Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisierung von Alpakas (Lama Pacos) mit Protein-Antigene und Antigen-spezifische einzelne Domain Antikörperproduktion

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...