Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

אנו מודים לפרופסור ד. מדן, עבור דיונים רבים ומועילים במהלך פרויקט זה. אנו מודים לפרופסור ד. בולסון על מתנת הפלסמיד המכילה את הסליל הGCN4 ממוטב. אנו מודים לד ר ב. גואו. אנו מודים לכריסטינה ר. ארנולדי, תמר בסילישווילי ואיימי א. קנדי על הפגנת הנוהל. אנו מודים למכון הליבה של קריסטלוגרפיה באמצעות ביורט ולמחלקות הכימיה ולביוכימיה & ביולוגיה של התא בדרמות לשימוש בציוד הקריסטלוגרפיה ובצוות הביו-ביוטיים לתמיכתם. מחקר זה בשימוש AMX beamline של הלאומי סינכרוטרון Light מקור השני, ארה ב. משרד האנרגיה (DOE) משרד המדע המשתמש מתקן מופעל עבור המשרד DOE של המדע על ידי המעבדה הלאומית ברוקהייבן תחת חוזה לא. דה-SC0012704. אנו מודים לצוות במלון NSLS II על תמיכתם. עבודה זו ממומנת על ידי NIH מענקים R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 ו P20GM113132, ורומן מוניק-פפרקורן ומענק אינטראקטיבי.

1. עיצוב בניית הקריסטלוגרפיה
<ol><li>שיבוט את הרצף של נמו-EEAA כמו בפרסום הקודם12 בווקטור עבור ביטוי ב -E. coli באמצעות היזם T7, כולל תג N-טרמינל היסטידין ואתר מחשוף פרוטאז. הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו וקטור שונה כדי לכלול תג N-terminal-histidine תגית וירוס איכול טבק (TEV) מחשוף באתר10<...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

נסיונות התגבשות של נמו בצורה לא מאוגדת לא הצליחו, כולל ניסיונות שימוש בחלבון באורך מלא וכמה בונים חיתוך המקיף את התחום כריכת IKK. האפיון הביופיזיקלי שלנו של התחום המחייב את האיגוד של נמו (שאריות 44-111) קיווטות מעגלית, ספקטרוסקופיית nmr ואנאיזוטרופיה מצביעים על כך שבניית המבנה, אם כי מסוגל לאגד I...

מסלול NF-κB מופעל בתגובה מגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מוצרים מיקרוביאלית ומתח, כדי לווסת את הביטוי של גנים היעד האחראי תגובה דלקתית וחיסונית, מוות תאים או הישרדות והתפשטות1. פתווגיות כולל מחלות דלקתיות ואוטואימוניות סרטן2,3,4,5 היו מתואמים היפרהפעלה של השביל, אשר עשה אפנון של הפעילות NF-κB היעד העיקרי לפיתוח טיפולים חדשים6,7.
הנתיב הקנוני-κB בפרט הוא נבדל מהשביל הלא קאנוני, האחראי על הפעלת lymphorganogenesis ו-cell, על ידי התלות של לשעבר על הפיגומים החלבון נמו (NF-κB essential מודולים8) עבור ההרכבה של הקומפלקס ikk עם IKKα ו IKKβ. מתחם ikk אחראי על זרחון של IκBα (מעכב של κB) כי מטרות זה עבור השפלה, שחרור NF-κB דימרים כדי לאתר את הגרעין עבור שעתוק גנים1 ולכן הוא יעד אטרקטיבי לפיתוח מעכבי לווסת את NF-κB פעילות.
המחקר שלנו מתמקד באפיון של האינטראקציה חלבון-חלבון בין נמו ו IKKβ, מיקוד נמו לפיתוח מעכבי מולקולות קטנות של היווצרות מורכבות IKK. תחום מחייב מינימלי של נמו, נדרש לאגד IKKβ, כולל שאריות 44-111, והמבנה שלו נקבע מורכב עם פפטיד המתאים IKKβ רצף 701-7459. נמו ו IKKβ ליצור צרור ארבעה סליל שבו נמו דיימר להכיל שני הליקס של IKKβ (701-745) בחריץ פתוח מוארך עם ממשק אינטראקציה מורחבת. IKKβ (734-742), הידוע גם בשם התחום המחייב את נמו (NBD), מגדיר את המקום החם החשוב ביותר עבור הכריכה, שם שני טריפטוהנס החיוניים (739,741) לקבור עמוק בתוך הכיס נמו. הפרטים של המבנה המורכב יכול לסייע בעיצוב מבוסס מבנה ואופטימיזציה של מעכבי מולקולות קטנות מיקוד נמו. במקביל, קשה כי הקשירה של מולקולה קטנה או פפטיד יהיה ליצור מחדש ב-נמו השינוי המלא של הקונפורמציה (כלומר, פתיחה נרחבת של נמו מתפתל-סליל dimer) נגרמת על ידי איגוד של IKKβ ארוך (701-745), כפי שנצפה בגביש, ואת המבנה של נמו לא מאוגד או נמו מאוגד מולקולה קטנה מדכא עשוי לייצג יעד טוב יותר עבור מבנה מבוסס עיצוב הסמים ואופטימיזציה מעכב.
אורך מלא נמו ומבנים לחיתוך קטן המקיף את התחום כריכת IKK הוכיחו את הנחישות לקביעת מבנה בצורה לא מאוגד באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן ו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) שיטות10, אשר מתבקש לנו לעצב גרסה משופרת של התחום המחייב IKK של נמו. אכן, נימו (44-111) בטופס הלא מאוגד הוא רק חלקית מקופל ועובר החליפין באופן חלקי, ולכן אנו מוגדר לייצב את המבנה הdimeric שלה, מתפתל סליל קיפול ויציבות, תוך שמירה על זיקה מחייבת IKKβ. על-ידי הוספת שלושה הפטנים של אידיאלי dimeric מתפתל-סליל רצפים11 ב N-ו-C-termini של החלבון, וסדרה של ארבעה מוטציות הנקודה, יצרנו את נמו-EEAA, בונה באופן מלא dimeric מקופל בסליל מפותל, אשר הצילה את הזיקה ikk-bindingלטווח nanomolar כפי שנצפתה כיתרון נוסף, קיווינו מתאמים מפותל סליל (מבוסס על רצף GCN4) יהיה להקל על התגבשות ובסופו של דבר לסייע בקביעת רנטגן מבנה באמצעות החלפת מולקולרית. מתאמים המתפתל-סליל מנוצל באופן דומה הן להגביר את היציבות, לשפר את התנהגות הפתרון ולהקל על התגבשות trimeric סלילי ושברי נוגדנים13,14. נמו-EEAA מתבטאת בקלות ומטוהרים מ es, האבנצ'ה. התאים הcoli עם תגית Histidine ביקדין, הוא מסיסים, מקופל בסליל יציבה dimeric מתפתל והוא מגובש בקלות, עם עקיפה כדי 1.9 Å. הנוכחות של אזורים מתפתל מפותל סליל של GCN4 יכול בנוסף לסייע דיממו את הנתונים מקריסטלים של נמו-eeaa על ידי החלפת מולקולרית באמצעות המבנה הידוע של GCN415.
בהינתן התוצאות שהתקבלו עם apo-נמו-EEAA, אנו מאמינים את הפרוטוקולים המתוארים כאן יכול גם להיות מיושם על התגבשות של נמו-EEAA בנוכחות של פפטידים קטנים (כמו פפטיד d המולקולה) או מעכבי מולקולה קטנה, עם המטרה של הבנת הדרישות של נמו עיכוב מבנה מבוסס אופטימיזציה של מעכבי עופרת הראשונית בהינתן הפלסטיות והאופי הדינמי של מספר רבשל מבני מתחםהסליל המתפתל, השימוש במתאמים המתפתל מתפתל יכול למצוא ישימות כללית יותר בסיוע להגדרה מבנית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

נמו היא חלבון פיגומים אשר ממלא תפקיד חיוני במסלול NF-κB על ידי הרכבת IKK-מתחם עם IKKα ו IKKβ. עם ההפעלה, מתחם IKK זרחתים מולקולות IκB המובילות הטרנסלוקציה הגרעינית NF-κB והפעלה של גנים היעד. עיכוב של האינטראקציה של נמו/IKK היא פרדיגמה טיפולית אטרקטיבי עבור אפנון של פעילות מסלול NF-κB, מה שהופך את נמו יעד מעכבי עיצוב וגילוי. כדי להקל על תהליך של גילוי ואופטימיזציה של מעכבי נמו, אנו מהונדסים בניין משופר של התחום איגוד IKK של נמו אשר יאפשר קביעת מבנה של החלבון בצורה של apo ובעוד כרוך מעכבי מולקולרית משקל קטן. כאן, אנו מציגים את האסטרטגיה המשמשת לעיצוב, ביטוי ואפיון מבניים של התחום המחייב של ה-IKK של נמו. החלבון מתבטא ב -E. coli תאים, מסיסות תחת תנאים denaturing רפתקאות ומטוהרים דרך שלושה שלבים כרומטוגרפי. אנו דנים בפרוטוקולים להשגת קריסטלים לקביעת מבנה ולתיאור אסטרטגיות לרכישת נתונים וניתוח. הפרוטוקולים ימצאו ישימות רחבה לקביעת מבנה של מתחמי מעכבי של נמו ומולקולה קטנה.

שיבוט, ביטוי וטיהור של התחום המחייב של ה-IKK של נמו. הפרוטוקול שלאחר מחקר זה כדי להשיג את הרצף הסופי של נמו-EEAA (איור 1א), אשר הפיק גבישים באיכות עקיפה, היה מעורב בביטוי ואפיון של כל המבנים ביניים, כולל תוספת של מתאמי סליל מפותל ב N-ו-C-טרמינוס, המוטציות C76A, C95S וא...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

פרוטוקול זה מאפשר קביעת מבנה מוצלחת של תחום איגוד IKK של NEMO, בצורתו הלא מאוגדת. ופרטים על הייצור וההתגבשות שלה. הפרוטוקול, מנצל את הייצוב הזה של האישור המקורי של קטע התחום מחייב IKK של NEMO, באמצעות מתאמי סליל סלילים, המאפשרים התגבשות וקביעת מבנה.הביולוגיה המבנית של NEMO, כיעד, מספקת יתרון חשוב בהתפתחות מעכבי NEMO לטיפול במחלות דלקתיות ואוטואימוניות וסרטן. פרוטוקול זה עשוי להיות מורחב לקביעת המבנה של קומפלקסים NEMO, עם פפטיד או מעכבי מולקולה קטנה לגילוי תרופות או אופטימיזציה. החלבון refolding וריכוז, במהלך שלב ייצור החלבון, הם היסוד להשגת עמום NEMO טהור.הגבלת צבירה והבטחת מיסות בתנאי התגבשות. להדגים את הנהלים יהיו תמר ואיימי, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלנו. התחל על ידי הוספת 20 מיליליטר של פתרון מרק נהדר.ו-20 מיקרוליטרים של 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין. לבקבוק ארלנפייר 125 מיליליטר. ואחריו כמה microliters של מלאי גליצרול התא, מ 80 מעלות צלזיוס אחסון, של תאים מוסמכים BL21DE3.השתנה עם וקטור. לאחר טלטול תרבות המתנע בן לילה, ב 37 מעלות צלזיוס ו 220 סיבובים לדקה, לדלל את התאים כדי OD600 של 0.1 ו 250 מיליליטר של מרק נהדר. ומוסיפים אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר.כאשר OD600 של התרבות מגיע 0.8 כדי 1, להוסיף IPTG לתרבות, לריכוז 500 micromolar. ולגדל את התאים במשך ארבע שעות, ב 37 מעלות צלזיוס, עד OD600 מגיע שש עד 10. בסוף הדגירה, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה.ולהשעות מחדש את גלולה ב40 מיליליטר של חיץ תזה. פצל את התאים המושעים מחדש לשני אליקוטים של 20 עד 25 מיליליטר. ולהשתמש בעיתונות צרפתית כדי להחיל כ 25, 000 ק"ג לאינץ 'מרובע של לחץ על התאים, פעמיים עד שלוש פעמים לכל aliquot, בחדר קר.לאחר מכן, מוסיפים אוריאה לתא lysates, לריכוז סופי של שמונה טוחנות. ולהדרור את פתרון התא על פלטפורמת נדנדה במשך שעתיים עד 16 שעות, בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, להעביר את lysates לצינורות אולטרה צנטריפוגה, לפחות שלושה רבעים מלאים, לכל צינור.ואולרטה צנטריפוגה lysates, במשך 45 דקות. תדקיר את העל-טבעיים לצינור חרוט של 50 מיליליטר. ותטען את האוריאה דגירה על טור IMAC, בשלושה מיליליטר לדקה.כאשר כל העל-טבעי רץ בעמודה, שטף את העמודה עבור 10 כרכים של עמודות, עם מאגר איגוד, בשלושה מיליליטר לדקה. ולבצע אלוט הדרגתי של חלבון NEMO-EEAA מ 10 עד 500 imidazole מילימול, מעל 12 עמודים נפח הדרגתי. איסוף אליקוטים מיליליטר אחד של eluate, לתוך צלחת איסוף שבר.לאחר ניתוח דף SDS, למשוך את השברים המכילים את חלבון היעד הטהור ולמדוד את ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay, על פי פרוטוקול סטנדרטי. בחר את השברים חמק, המכיל חלבון. כדי לחשוף את תג HIS6 ולהסיר imidazole עודף מהדגימה, להוסיף פרוטאז TEV, ביחס משקל של 1 עד 10, של חלבון מחשוף TEV, לדגימה חלבון היעד.ולהאריך את הדגימה בן לילה בארבעה ליטרים של טריס 20 מילימולאר. 150 מילימולר נתרן כלורי ושני מילימולרים פתרון DTT. למחרת בבוקר, לטעון את מדגם NEMO-EEAA מחשוף TEV, על עמוד IMAC השני, במיליליטר אחד לדקה.איסוף הזרימה דרך שברים מיליליטר אחד, בצלחת אוסף שבר קערה 96. לשטוף את הטור עם חמישה כרכים של 20 מילימולר טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי ו 10 מילימולר imidazole פתרון, במיליליטר אחד לדקה. לאחר הכביסה האחרונה, לרחף את TEV ו uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, עם שלושה כרכים טור של 20 מילימולר טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי, 500 מילימולרים imidazole ושני פתרון DTT מילימולרי, לתוך בקבוק 50 מיליליטר.משוך את הזרימה דרך שברים, המכיל מבנה NEMO-EEAA מחשוף ולרכז את המדגם עם רכז תאים עורר, לחמישה מיליליטר. לאחר דיאליזה לילה כפי שהודגם, לטעון חמישה מיליליטר של המדגם על 16 מילימטר על ידי 60 ס"מ גודל הדרה עמודות כרומטוגרפיה. חוזר לפי הצורך, בהתאם לאמצעי האחסון לדוגמה.במיליליטר אחד לדקה, וב-2 מילימולרים טריס, 100 מילימולר נתרן כלורי ושני מילימולרים תווי DDT. לאחר משיכת השברים, המתאימים NEMO-EEAA dimeric, לרכז את המדגם במרכז התא עורר, עם משקל מולקולרי לחתוך קרום של שלושה קילודלטון, לריכוז סופי של 113 micromolar. לאחר מכן, aliquot החלבון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס, עד חודש.להקרנת מטריצה דלילה, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של פתרון מטריצה דליל לכל אחת מ-96 בארות של צלחת התגבשות תא שתי טיפות. לשבת ולשחרר דיפוזיה אדים. ומוסיפים את תוסף החלבון למתקן טיפות רובוטי.לאחר מכן, השתמשו במגדיר טיפה רובוטי, כדי לוותר על 100 ננוליטר של תות תותר חלבון ב 1.65 מיליגרם למיליליטר, ביחס של אחד לאחד עם פתרון המאגר בירידה אחת, לנפח סופי של 200 ננוליטר. ולהוסיף 66 nanoliters של פתרון חלבון עם 134 nanoliters של פתרון המאגר, לנפח הסופי של 200 nanoliters בירידה 2. לאחר מכן, לאטום מיד את הצלחת עם סרט איטום ברוחב 3 אינץ'.לאחר מכן, לאחסן את המגשים באחסון תמונה התגבשות, ב 20 מעלות צלזיוס. בדיקת התמונות שנאספו באופן אוטומטי, לנוכחות גבישים, החל יומיים לאחר אחסון הצלחות. עבור ייצור מלאי זרעים, להעביר את הירידה כולה המכילה את הגביש של עניין, לתוך 50 microliters של פתרון מצב התגבשות, בבקבוקון שסופק, מערכת דור הזרעים.ומערבולת מלאי הזרעים, עם 20 שניות של פעימות ו -10 שניות של מנוחה, במשך שלוש דקות. לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי את מלאי הזרעים, במרווח אחד עד 10, עד אחד עד 10, 000. ולאחסן את הדילולים בארבע מעלות צלזיוס, עד לשימוש נוסף.יום עד יומיים לפני המשלוח לסנכרון, חותכים את הקלטת מהחלק העליון של הבאר, עם גביש העניין. ולהוסיף 0.5 microliters של פתרון התגבשות המכיל 12%1, שני פרופאן DiO cryoprotectant, ישירות לבא. לנתק בעדינות את הקריסטל עם לולאת קריו.לולאה הגביש מן הבאר, ולאחסן את הגביש המכיל לולאת קריו דיסקוס שקוע חנקן נוזלי, עד משלוח עבור דיפוזיה רנטגן. לאחר קבלת נתוני ההתרחבות של קרני הרנטגן, עבד את התעצמויות קנה המידה בשרת STAR ו- ISO. באמצעות אינדקס קריסטלוגרפיה רנטגן לחתוך ממוצע, של 1.2 עבור משטח מגבלת דיפרציה עבור הנתונים.ולהעמיס על פיניקס. כדי לקבוע את המבנה, השתמש במבנה קרני הרנטגן של GCN4 כמודל חיפוש להחלפה מולקולרית, באמצעות MRage בפיניקס. מבנה 4DMD, יוגדר כאנסמבל.ופתרון MRage ייבנה בהצלחה לחלק המבנה, המתאים למתאם סליל סליל מסוף הקצה של NEMO-EEAA. למודל החיפוש, עבור שתי השרשראות במעומעם. החלבון המובע יתר על המידה מופיע בלהקה, בערך 14 קילודלטון סמן משקל מולקולרי, לפני טיהור עמוד IMAC הראשון.ומציג להקת מונומר ולהקה עמומה יותר, ב 14 ו 28 קילודלטון, בהתאמה, לאחר האלוטיון הראשון. מחשוף TEV הושלם כמעט, בעקבות האלוטיון, דרך עמודת IMAC השנייה. כמעט כולו כמו עמום, במשקל המולקולרי הצפוי.כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, מציגה שיא אחד, המתחמק בין 60 ל-65 מיליליטר, המגיבים לעמעום. הקרנה עדינה מייצרת גבישים שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מלאי זרעים לייצור גבישי NEMO-EEAA, לאיסוף נתונים. כאן מוצגים פרופילי דיפוזיה של גבישי NEMO-EEAA.ניתוח מבני של חלבון NEMO-EEAA, מגלה סליל סליל מקביל הומודימרי לא סדיר, כ 175 אנגסטרום אורך. אזור סליל סליל רגיל, מקיף את רצף מתאם סליל סליל אידיאלי, בסוף הסיום. ושני ההפטאדים הראשונים של הרצף הנכון של NEMO.סליל סליל רגיל, קיים גם בתחנת C. החל משאריות NEMO 97 ומקיף את מתאם סליל סליל אידיאלי מסוף C. המבנה מאוגד בטא IKK, מציג אישור סליל סליל פתוח יותר, כדי להתאים את ligand.עם מרווח בין-דהלי גדול יותר ב-1 עד 2.2 אנגסטרום באזור זה. המבנה של ליגנד ב NEMO, מציע יעד חדש עבור העיצוב של מעכבים באמצעות שיטות חישוביות. ולהקרנה החזותית של כיסים מחייבים עם ספריות מולקולות קטנות.עכשיו יש לנו נתיב להתגבשות של מבנה NEMO מהונדס מורכב עם ליגנדים מולקולה קטנה. כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של סוג חדש של מעכבים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

חיסונים של האלפקות (לאמה pacos) עם חלבונים אנטיגניים וייצור נוגדנים תחום יחיד אנטיגן ספציפי

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...