Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Ringraziamo il professor D. Madden, per molte discussioni utili durante questo progetto. Ringraziamo il prof. Ringraziamo il Dottor B. Guo per i plasmidi NEMO. Ringraziamo Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili e Amy E. Kennedy per aver dimostrato la procedura. Ringraziamo il BioMT Crystallography Core Facility e i dipartimenti di Chimica e di Biochimica & Biologia Cellulare a Dartmouth per l'uso delle attrezzature di cristallografia e del personale BioMT per il loro supporto. Questa ricerca ha utilizzato la linea di fascio AMX del National Synchrotron Light Source II, un U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science User Facility gestito per l'Ufficio DOE della Scienza dal Brookhaven National Laboratory sotto Contratto n. DE-SC0012704. Ringraziamo il personale di NSLS II per il loro sostegno. Questo lavoro è stato finanziato da NIH sovvenzioni R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 e P20GM113132, e un Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive grant.

1. Progettazione del costrutto per la cristallografia
<ol><li>Clonare la sequenza di NEMO-EEAA come nella precedente pubblicazione12 in un vettore per l'espressione in E. coli utilizzando il promotore T7, tra cui un tag esa-issidina N-terminale e un sito di cleavazione proteasi. NOTA: In questo protocollo, abbiamo usato un vettore modificato per includere un tag esa-istidina A N-terminale e un sito di scissione Tobacco Etch Virus (TEV)10. Questo vettore facili...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. 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Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. 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S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

I tentativi di cristallizzazione di NEMO in forma non associata non hanno avuto successo, inclusi i tentativi di utilizzo della proteina a lunghezza intera e diversi costrutti di troncamento che comprendono il dominio di legame IKK. La nostra caratterizzazione biofisica del dominio iKK-binding di NEMO (residui 44-111) da dichroismo circolare, spettroscopia NMR e anisotropia fluorescenza ha indicato che il costrutto, anche se in grado di legare IKK, esisteva in uno stato di scambio conformativo, non adatto per la cristall...

La via NF-B viene attivata in risposta a una varietà di stimoli, tra cui citochine, prodotti microbici e stress, per regolare l'espressione dei geni bersaglio responsabili della risposta infiammatoria e immunitaria, della morte o della sopravvivenza cellulare e della proliferazione1. Le patologie, tra cui malattie infiammatorie e autoimmuni e cancro2,3,4,5 sono state correlate all'iperattivazione del percorso, che ha reso la modulazione dell'attività nF-B un obiettivo primario per lo sviluppo di nuove terapie6,7.
La via canonica NF-B, in particolare, si distingue dalla via non canonica, responsabile dell'antanalgenesi e dell'attivazione delle cellule B, dalla dipendenza del primo dalla proteina di scaffolding NEMO (NF-Bmodulatoreessenziale 8 ) per l'assemblaggio del complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Il complesso di IKK è responsabile della fosforilazione dell'IB, che lo prende di mira per la degradazione, liberando i dimeri NF-B da traslocare nel nucleo per la trascrizione genica1 ed è quindi un bersaglio attraente per lo sviluppo di inibitori per modulare l'attività NF-B.
La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione dell'interazione proteina-proteina tra NEMO e IK, mirando a NEMO per lo sviluppo di piccoli inibitori molecolari della formazione complessa di IKK. Il dominio di legame minimo di NEMO, necessario per legare IKK, comprende i residui 44-111, e la sua struttura è stata determinata in complesso con un peptide corrispondente alla sequenza di IKK - 701-7459. NeMO e IKK formano un fascio di quattro elica in cui il dimero NEMO ospita le due eliche di IKK (701-745) in una scanalatura aperta allungata con un'interfaccia di interazione estesa. Il dominio legante NEMO (NBD), IKKà (734-742), definisce il punto caldo più importante per l'associazione, dove i due tritofori essenziali (739,741) seppelliscono profondamente all'interno della tasca NEMO. I dettagli della struttura complessa possono aiutare nella progettazione e nell'ottimizzazione basata sulla struttura degli inibitori delle piccole molecole mirati a NEMO. Allo stesso tempo, è difficile che il legame di una piccola molecola o peptide ricrei in NEMO l'intero cambiamento conformazionale (cioè, un'ampia apertura del dimero neMO a bobina) causato dal legame del lungo IKK (701-745), come osservato nel cristallo, e la struttura di NEMO o NEMO non legato a un inibitore della piccola molecola può rappresentare un migliore obiettivo per la progettazione e l'ottimizzazione dei farmaci basati sulla struttura.
I costrutti di troncamento a lunghezza intera NEMO e di troncamento più piccoli che comprendono il dominio di associazione IKK si sono dimostrati intrattabili per la determinazione della struttura in forma non integrata tramite la cristallografia a raggi X e i metodi di risonanza magnetica nucleare (NMR)10, il che ci ha spinto a progettare una versione migliorata del dominio di legame IKK di NEMO. Infatti, NEMO (44-111) nella forma non associata è solo parzialmente piegato e subisce uno scambio conformazionale e quindi abbiamo deciso di stabilizzare la sua struttura dimeica, piega e stabilità della bobina, pur conservando l'affinità vincolante per IKK. Aggiungendo tre eptadi di sequenze ideali dimericed coil11 al n-e C-termini della proteina, e una serie di quattro mutazioni punti, abbiamo generato NEMO-EEAA, un costrutto completamente dimerico e piegato in una bobina a bobina, che ha salvato l'affinità IKK-legante alla gamma nanomolare come osservato per la lunghezza completa NEMO12. Come ulteriore vantaggio, speravamo che gli adattatori a bobina (basati sulla sequenza GCN4) avrebbero facilitato la cristallizzazione e infine aiutato nella determinazione della struttura a raggi X attraverso la sostituzione molecolare. Adattatori a bobina sono stati utilizzati in modo simile sia per aumentare la stabilità, migliorare il comportamento della soluzione e facilitare la cristallizzazione per bobine a bobina trimeree e frammenti di anticorpi13,14. NeMO-EEAA è facilmente esprimente e purificato dalle cellule di Escherichia. coli con un'etichetta histidina sfilsiabile, è solubile, piegato in una bobina a bobina dimeric stabile ed è facilmente cristallizzato, con diffrazione a 1,9 . La presenza delle regioni ordinate a bobina di GCN4 potrebbe inoltre aiutare a far rientrare i dati provenienti dai cristalli di NEMO-EEAA mediante sostituzione molecolare utilizzando la struttura nota di GCN415.
Dati i risultati ottenuti con apo-NEMO-EEAA, crediamo che i protocolli qui descritti potrebbero essere applicati anche alla cristallizzazione del NEMO-EEAA in presenza di piccoli peptidi (come il peptide NBD) o di inibitori di piccole molecole, con l'obiettivo di comprendere i requisiti per l'inibizione NEMO e l'ottimizzazione basata sulla struttura degli inibitori iniziali del piombo ad alta affinità. Data la plasticità e la natura dinamica di molti domini a bobina16, l'uso degli adattatori a bobina-coil potrebbe trovare un'applicabilità più generale nell'aiutare la determinazione strutturale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NeMO è una proteina di impalcatura che svolge un ruolo essenziale nel percorso NF-B assemblando il complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Al momento dell'attivazione, il complesso ifosofolaIKK le molecole IB che portano alla traslocazione nucleare NF-B e all'attivazione dei geni bersaglio. L'inibizione dell'interazione NEMO/IKK è un paradigma terapeutico interessante per la modulazione dell'attività del percorso NF-B, rendendo NEMO un bersaglio per la progettazione e la scoperta degli inibitori. Per facilitare il processo di scoperta e ottimizzazione degli inibitori NEMO, abbiamo progettato un costrutto migliorato del dominio di NEMO che lega IKK di NEMO che consentirebbe la determinazione della struttura della proteina nella forma apoe e mentre è legato a piccoli inibitori del peso molecolare. Qui, presentiamo la strategia utilizzata per la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione strutturale del dominio iKK-binding di NEMO. La proteina è espressa in cellule di E. coli, solubilificate in condizioni di detonazione e purificate attraverso tre passaggi cromatografici. Discutiamo i protocolli per ottenere cristalli per la determinazione della struttura e descriviamo le strategie di acquisizione e analisi dei dati. I protocolli troveranno ampia applicabilità alla determinazione della struttura di complessi di NEMO e piccoli inibitori di molecole.

Clonazione, espressione e purificazione del dominio iKK-binding di NEMO. Il protocollo è seguito in questo studio per ottenere la sequenza finale di NEMO-EEAA(Figura 1A), che produceva cristalli di qualità di diffrazione, che prevedeva l'espressione e la caratterizzazione di tutti i costrutti intermedi, inclusa l'aggiunta degli adattatori a bobina a N- e o C-terminus, le mutazioni C76A, C95S e le mutazioni E56A, E57A. Figura 1</stro...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Descriviamo protocolli per la determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO dalla cristallografia a raggi X. I metodi includono l'espressione proteica, la purificazione e la caratterizzazione, nonché strategie per il successo dell'ottimizzazione dei cristalli e la determinazione della struttura della proteina nella sua forma non associata.

Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Questo protocollo facilita la corretta determinazione della struttura del dominio vincolante IKK di NEMO, nella sua forma non vincolata. E dettagli della sua produzione e cristallizzazione. Il protocollo, sfrutta questa stabilizzazione della conferma nativa del frammento di dominio di legame IKK di NEMO, attraverso adattatori a bobina arrotolato, che facilitano la cristallizzazione e la determinazione della struttura.La biologia strutturale di NEMO, come obiettivo, fornisce un importante vantaggio nello sviluppo di inibitori NEMO per il trattamento di malattie infiammatorie e autoimmuni e cancro. Questo protocollo può essere esteso alla determinazione della struttura dei complessi NEMO, con inibitori peptidici o di piccole molecole per la scoperta o l'ottimizzazione di farmaci. Il ripiecuoteggio e la concentrazione proteica, durante la fase di produzione delle proteine, sono fondamentali per ottenere un dimero NEMO puro.Limitare l'aggregazione e garantire la solubilità in condizioni di cristallizzazione. A dimostrare le procedure saranno Tamar e Amy, studenti laureati nel nostro laboratorio. Inizia aggiungendo 20 millilitri di fantastica soluzione di brodo.E 20 microlitri di una soluzione stock di ampicillina da 100 milligrammi per millilitro. A un pallone Erlenmeyer da 125 millilitri. Seguito da alcuni microlitri di stock di glicerolo cellulare, dallo stoccaggio di 80 gradi Celsius, di cellule competenti BL21DE3.Trasformato con vettore. Dopo aver scosso la coltura iniziale durante la notte, a 37 gradi Celsius e 220 rotazioni al minuto, diluire le cellule a un OD600 di 0,1 e 250 millilitri di brodo terrificante. E aggiungere ampicillina a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro.Quando l'OD600 della coltura raggiunge 0,8 a 1, aggiungere IPTG alla coltura, a una concentrazione di 500 micromolari. E far crescere le cellule per quattro ore, a 37 gradi Celsius, fino a quando l'OD600 raggiunge i sei-10. Alla fine dell'incubazione, sedimentare le cellule per centrifugazione.E sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di tampone di lysis. Dividere le celle ri-sospese in due aliquote da 20 a 25 millilitri. E usa una pressa francese per applicare circa 25.000 libbre per pollice quadrato di pressione alle cellule, da due a tre volte per aliquota, in una stanza fredda.Quindi, aggiungere l'urea ai lire cellulari, ad una concentrazione finale di otto molari. E incubare la soluzione cellulare su una piattaforma a dondolo per due o 16 ore, a temperatura ambiente. La mattina dopo, trasferire i lire in tubi ultra-centrifuga, ad almeno tre quarti pieni, per tubo.E la centrifuga di Ulrta, per 45 minuti. Decantare i supernatanti in un tubo conico da 50 millilitri. E caricare il supernatante incubato dall'urea su una colonna IMAC, a tre millilitri al minuto.Quando tutti i supernatanti hanno attraversato la colonna, lavare la colonna per 10 volumi di colonna, con buffer di associazione, a tre millilitri al minuto. Ed eseguire l'eluizione gradiente della proteina NEMO-EEAA da 10 a 500 millimolare imidazolo, su un gradiente di volume di 12 colonne. Raccolta di un millilitro aliquote dell'eluato, in una piastra di raccolta delle frazioni.Dopo l'analisi della pagina SDS, estrarre le frazioni contenenti la proteina bersaglio pura e misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford, secondo il protocollo standard. Selezionare le frazioni eluse contenenti proteine. Per scindere il tag HIS6 e rimuovere l'imidazolo in eccesso dal campione, aggiungere la proteasi TEV, con un rapporto di peso da uno a 10, di proteina tev sciccata, al campione proteico bersaglio.E dilatare il campione durante la notte in quattro litri di Tris da 20 millimolare. Cloruro di sodio millimolare da 150 millimolare e due soluzioni di DTT millimolare. La mattina seguente, caricare il campione NEMO-EEAA scisso TEV su una seconda colonna IMAC, a un millilitro al minuto.Raccolta del flusso attraverso in una frazione millilitro, in una piastra di raccolta della frazione di 96 ciotole. Lavare la colonna con cinque volumi di Tris da 20 millimolare, cloruro di sodio 150 millimolare e soluzione di imidazolo millimolare, a un millilitro al minuto. Dopo l'ultimo lavaggio, elutare il TEV e zio ha uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, con tre volumi di colonna di Tris da 20 millimolare, cloruro di sodio millimolare 150 millimolare, imidazolo millimolare e due soluzioni di DTT millimolare, in un pallone da 50 millilitri.Estrarre il flusso attraverso le frazioni, contenente costrutto NEMO-EEAA sciccoso e concentrare il campione con un concentratore di cellule mescolate, a cinque millilitri. Dopo la dialisi notturna come dimostrato, caricare cinque millilitri del campione su colonne cromatografiche di esclusione di dimensioni di 16 millimetri per 60 centimetri. Ripetendo se necessario, in base al volume del campione.A un millilitro al minuto, e a due Tris millimolare, cloruro di sodio 100 millimolare e due soluzioni di DDT millimolare. Dopo aver tirato le frazioni, corrispondenti al dimerico NEMO-EEAA, concentrare il campione nel concentratore di cellule mescolate, con una membrana di taglio del peso molecolare di tre kilodalton, ad una concentrazione finale di 113 micromolare. Quindi, aliquota la proteina per la conservazione a quattro gradi Celsius, per un massimo di un mese.Per lo screening a matrice sparsa, aggiungere 60 microlitri di soluzione a matrice sparsa in ciascuno dei 96 pozzi di una piastra di cristallizzazione a due camere a goccia. Per la diffusione del vapore di seduta e goccia. E aggiungere la soluzione proteica a un drop setter robotico.Successivamente, utilizzare un drop setter robotico, per erogare 100 nanolitri di soluzione proteica a 1,65 milligrammi per millilitro, in un rapporto uno a uno con soluzione di serbatoio in goccia uno, a un volume finale di 200 nanolitri. E aggiungete 66 nanolitri di soluzione proteica con 134 nanolitri di soluzione di serbatoio, ad un volume finale di 200 nanolitri in goccia due. Quindi, sigillare immediatamente la piastra con nastro di tenuta largo tre pollici.Quindi, conservare i vassoi in una memoria di imager di cristallizzazione, a 20 gradi Celsius. Controllo automatico delle immagini raccolte, per la presenza di cristalli, a partire da due giorni dopo la conservazione delle lastre. Per la generazione di scorte di semi, trasferire l'intera goccia contenente il cristallo di interesse, in 50 microlitri di soluzione di condizione di cristallizzazione, nella fiala fornita, da un kit di generazione di semi.E vortice il calcio del seme, con 20 secondi di pulsante e 10 secondi di riposo, per tre minuti. Quindi, diluire in serie il seme, con uno o 10 incrementi, fino a uno a 10.000. E conservare le diluizioni a quattro gradi Celsius, fino a un ulteriore utilizzo.Da uno a due giorni prima della spedizione al sincrotrone, tagliare il nastro dalla parte superiore del pozzo, con il cristallo di interesse. E aggiungere 0,5 microlitri di soluzione di cristallizzazione contenenti 12%uno, due crioprotettivi DiO propano, direttamente al pozzo. Rimuovere delicatamente il cristallo con un anello criogenico.Far scorrere il cristallo dal pozzo e conservare il cristallo contenente loop crio in un disco immerso nell'azoto liquido, fino alla spedizione per la diffrazione a raggi X. Dopo aver ricevuto i dati di diffrazione a raggi X, elaborare le intensità ridimensionate nel server STAR e ISO. Utilizzando una media di indicizzazione della cristallografia a raggi X, di 1,2 per la superficie limite di diffrazione per i dati.E carica su Phoenix. Per determinare la struttura, usa la struttura a raggi X di GCN4 come modello di ricerca per la sostituzione molecolare, usando MRage a Phoenix. La struttura 4DMD, sarà definita come un insieme.E la soluzione MRage si costruirà con successo nella porzione di struttura, corrispondente all'adattatore a bobina arrotolato terminale finale di NEMO-EEAA. al modello di ricerca, per entrambe le catene nel dimero. La proteina sopra espressa appare in una banda, a circa 14 kilodalton marcatore di peso molecolare, prima della prima purificazione della colonna IMAC.E mostra una banda monomero e una banda di dimeri, rispettivamente a 14 e 28 kilodalton, dopo la prima eluizione. La scissione TEV è praticamente completa, dopo l'eluizione, attraverso la seconda colonna IMAC. Quasi interamente come un dimero, al peso molecolare previsto.Cromatografia ad esclusione di dimensioni, mostra un singolo picco, eludendo tra 60 e 65 millilitri, che stanno rispondendo al dimero. Lo screening fine produce cristalli che possono essere utilizzati per produrre uno stock di semi per la produzione di cristalli NEMO-EEAA, per la raccolta dei dati. Qui vengono mostrati i profili rappresentativi di diffrazione dei cristalli NEMO-EEAA.L'analisi strutturale della proteina NEMO-EEAA rivela una bobina arrotolato parallela irregolare omodimerica, lunga circa 175 angstrom. La regione regolare della bobina arrotolato, comprende la sequenza ideale di adattatori a bobina arrotolato, al capolinea finale. E i primi due eptadi della sequenza propria del NEMO.Una bobina arrotolato regolare, è presente anche al capolinea C. A partire dal residuo NEMO 97 e comprendendo l'adattatore a bobina arrotolato ideale del terminale C. La struttura beta bound IKK, mostra una conferma della bobina arrotolato più aperta, per ospitare il ligando.Con una spaziatura interelico più ampia da uno a 2,2 angstrom in questa regione. La struttura di un ligando in NEMO, offre un nuovo obiettivo per la progettazione di inibitori attraverso metodi computazionali. E per lo screening visivo di tasche di legame con librerie di piccole molecole.Ora abbiamo un percorso per la cristallizzazione del costrutto NEMO ingegnerizzato in complesso con ligandi di piccole molecole. Aiutare nello sviluppo e nell'ottimizzazione di una nuova classe di inibitori.

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