Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

D.マッデン教授は、このプロジェクトを通して多くの有益な議論をしてくれたことに感謝します。最適化されたGCN4コイルコイルを含むプラスミドの贈り物に対してD.ボロン教授に感謝します。私たちは、NEMOプラスミドのためにB.グオ博士に感謝します。クリスティーナ・R・アーノルディ、タマル・バシアシヴィリ、エイミー・E・ケネディのデモンストレーションに感謝します。我々は、BioMT結晶学コア施設とダートマスの化学・生化学・細胞生物学部門に感謝し、結晶学機器とBioMT担当者の支援に感謝します。本研究では、米国エネルギー省(DOE)科学省のユーザー施設である全米シンクロトロン光源IIのAMXビームラインを、契約番号に基づきブルックヘブン国立研究所がDOE科学局に勤務する。DE-SC0012704.NSLS IIのスタッフの皆様のご支援に感謝申し上げます。この作品は、NIH助成金R03AR066130、R01GM133844、R35GM128663およびP20GM113132、およびムンク・プフェファーコーン小説とインタラクティブ補助金によって資金提供されました。

1. 結晶学のためのコンストラクトの設計
<ol><li>N末端ヘキサヒスチジンタグおよびプロテアーゼ切断部位を含むT7プロモーターを用いて大腸菌中で発現するためのベクターにおいて、前の出版物12のようにNEMO-EEAAの配列をクローン化する。 注:このプロトコルでは、N末端ヘキサヒスチジンタグとタバコエッチングウイルス(TEV)切断部位10を含むよう?...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. 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J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

非結合形態でのNEMOの結晶化の試みは、IKK結合ドメインを包含する全長タンパク質およびいくつかの切り捨て構築物を使用する試みを含め、失敗した。循環二色性によるNEMOのIKK結合ドメイン(残基44-111)の生物物理学的特徴は、NMR分光法および蛍光異方性が、IKKβと結合できるが、結晶化9、10に適さない立体構造の状態で存在することを示した。当社?...

NF-κB経路は、サイトカイン、微生物産物およびストレスを含む様々な刺激に応答して活性化され、炎症および免疫応答を担う標的遺伝子の発現を調節し、細胞死または生存および増殖1を担う。炎症性および自己免疫疾患および癌2、3、4、5を含む病理は、経路の過活性化と相関しており、これはNF−κB活性の変調を新しい治療法の開発のための主要な標的としている6、7である。
特に正規のNF-κB経路は、非正規経路と区別され、リンパ有機生起とB細胞活性化を担い、前者の足場タンパク質NEMO(NF-κB必須変調器8)への依存によって、キナーゼIKKαおよびIKKβを有するIKK複合体の集合体に対する。IKK複合体は、分解を標的とするIκBα(κBの阻害剤)のリン酸化を担い、遺伝子転写1の核に転移するNF-κBダイマーを解放し、したがってNF-κB活性を調節する阻害剤の開発のための魅力的な標的である。
本研究では、NeMOとIKKβの間のタンパク質間相互作用の特性評価に焦点を当て、IKK複合体形成の低分子阻害剤の開発に向けたNEMOを標的としています。NEMOの最小結合ドメインは、IKKβを結合するために必要とされ、残基44〜111を包含し、その構造は、IKKβ配列701〜7459に対応するペプチドと複合体で決定されている。NEMOとIKKβは、NEMOダイマーが拡張相互作用インタフェースを備えた細長い開いた溝にIKKβ(701-745)の2つのヘリックスを収容する4ヘリックスバンドルを形成します。IKKβ(734-742)はNEMO結合ドメイン(NBD)とも呼ばれ、2つの必須トリプトファン(739,741)がNEMOポケット内に深く埋め込まれる結合のための最も重要なホットスポットを定義します。複雑な構造の詳細は、NEMOを標的とする低分子阻害剤の構造ベースの設計と最適化に役立ちます。同時に、小分子またはペプチドの結合が、結晶中に観察されるように、長いIKKβ(701-745)の結合によって引き起こされる完全な立体構造変化(すなわち、NEMOコイルコイルダイマーの広範な開口部)をNEMOで再現することは困難であり、そして、低分子阻害剤に結合した非結合NEMOまたはNEMOの構造は、より良い標的を表し得る。
IKK結合ドメインを包含する全長NEMOおよび小型切り捨てコンストラクトは、X線結晶学および核磁気共鳴(NMR)法10を介した非結合形態の構造決定に対して難解であることが証明されており、NEMOのIKK結合ドメインの改良版を設計するよう促した。実際、非結合形態のNEMO(44-111)は部分的に折り畳まれ、立体構造交換を受けるので、IKKβの結合親和性を保ちながら、その二量体構造、コイルコイルの折り畳み、安定性を安定させる設定を行っています。タンパク質のN-およびC末端に理想的な二量体コイルコイルシーケンス11の3つのヘプタドを加え、一連の4点突然変異を加えることで、完全に二量体化された構造であるNEMO-EEAAを生成し、コイル状のコイルに折り畳まれ、全長NEMO12で観察されたナノモル範囲に対するIKK結合親和性を検出した。さらなる利点として、コイルコイルアダプタ(GCN4シーケンスに基づく)が結晶化を促進し、最終的には分子置換によるX線構造決定に役立つことを期待しました。コイルコイルアダプタは、安定性を高め、溶液挙動を改善し、三量体コイルおよび抗体断片13、14に対する結晶化を促進するために同様に利用されている。NEMO-EEAAは、クリーバ可能なヒスチジンタグを有する大腸菌細胞から容易に発現および精製され、可溶性であり、安定した二量体コイルコイルに折り畳まれ、1.9Åへの回折で容易に結晶化される。GCN4の順序付けられたコイルコイル領域の存在は、GCN415の既知の構造を用いた分子置換によるNEMO-EEAAの結晶からのデータのフェージングをさらに助けることができる。
アポ-NEMO-EEAAで得られた結果を考えると、ここで説明するプロトコルは、NEMO阻害の要件を理解し、初期リード阻害剤の構造ベースの最適化を高い親和性に理解することを目的として、小型ペプチド(NBDペプチドなど)または低分子阻害剤の存在下でNEMO-EEAAの結晶化にも適用できると考えています。多くのコイルコイルドメイン16の可塑性および動的性質を考えると、コイルコイルアダプタの使用は、構造決定を支援する上でより一般的な適用性を見つけることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMOは、キナーゼIKKαおよびIKKβとIKK複合体を組み立てすることにより、NF-κB経路において重要な役割を果たす足場タンパク質である。活性化時に、IKK複合体は、NF-κB核転移および標的遺伝子の活性化につながるIκB分子をリン酸化する。NEMO/IKK相互作用の阻害は、NF-κB経路活性の変調のための魅力的な治療パラダイムであり、NEMOを阻害剤の設計および発見の標的としている。NEMO阻害剤の発見と最適化のプロセスを容易にするために、我々は、アポ形態および小分子量阻害剤に結合しながら、アポ形態のタンパク質の構造決定を可能にするNEMOのIKK結合ドメインの改良された構築物を設計した。ここでは、NEMOのIKK結合ドメインの設計、表現、構造特性評価に利用する戦略を紹介する。タンパク質は大腸菌細胞で発現し、変性条件下で可溶化し、3つのクロマトグラフィー工程を経て精製される。構造決定用結晶を得るためのプロトコルについて議論し、データ取得・分析戦略について説明する。プロトコルは、NEMOと低分子阻害剤の複合体の構造決定に広い適用性を見出す。

NEMOのIKK結合ドメインのクローニング、発現および精製。 この研究では、回折品質の結晶を製造したNEMO-EEAA(図1A)の最終配列を得るために、N-およびC末端におけるコイルコイルアダプタの添加、変異C76A、C95Sおよび変異E56A、E57Aを含むすべての中間構造の発現および特性評価に関与した。図1Bは、<strong class="xfig...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

このプロトコルは、NEMO の IKK バインディング ドメインの構造の決定を、その非バインド形式で容易にします。そして、その生産と結晶化の詳細。このプロトコルは、このNEMOのIKK結合ドメイン断片の安定化を利用して、コイルコイルアダプタを介して、結晶化および構造決定を容易にする。NEMOの構造生物学は、標的として、炎症性および自己免疫疾患および癌の治療のためのNEMO阻害剤の開発において重要な利点を提供する。このプロトコルは、創薬または最適化のためのペプチドまたは低分子阻害剤を用いて、NEMO複合体の構造決定に拡張されてもよい。タンパク質リフォールディングおよび濃度は、タンパク質産生段階の間に、純粋なNEMOダイマーを得るための基本である。凝集を制限し、結晶化条件下での溶解性を確保する。手順を実証するタマルとエイミー、私たちの研究室の大学院生になります。素晴らしいスープ溶液の20ミリリットルを追加することで始めます.そして20マイクロリットル100ミリグラムアンピシリンのミリリットルのストック溶液。125ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに。BL21DE3有能な細胞の80°C貯蔵から、セルグリセロールストックの数マイクロリットルが続く。ベクトルを使用して変換されます。一晩スターター培養を振った後、摂氏37度と毎分220回転で、細胞を0.1と250ミリリットルの素晴らしいスープのOD600に希釈します。そして、ミリリットル当たり100マイクログラムの最終濃度にアンピシリンを加える。培養のOD600が0.8〜1に達すると、培養物にIPTGを加え、500マイクロモル濃度にする。そして、OD600が6〜10に達するまで、摂氏37度で4時間細胞を成長させます。インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞を沈下する。そして、40ミリリットルのリシスバッファーにペレットを再懸濁させる。再懸濁細胞を20〜25ミリリットルのアリコートに分割する。そして、フランスのプレスを使用して、冷たい部屋で細胞に圧力の平方インチあたり約25,000ポンド、アリコートあたり2〜3回を適用します。次に、尿素を細胞ライセートに加える、8モルの最終濃度にする。そして、室温で、2〜16時間、ロッキングプラットフォーム上で細胞溶液をインキュベートします。翌朝、ライセートを超遠心チューブに移し、チューブあたり少なくとも4分の3に完全に移します。そして、ユルタは、45分間、ライセートを遠心分離します。上清を50ミリリットルの円錐状チューブにデカントします。そして、尿素インキュベート上清をIMACカラムに1分間に3ミリリットルでロードする。すべての上清が柱を通り抜けるときは、1分間に3ミリリットルで、結合バッファーで10カラムの体積のためにカラムを洗います。そして、12カラムの体積勾配にわたって、10〜500ミリモルイミダゾールのNEMO-EEAAタンパク質の勾配溶出を行う。溶出物の1ミリリットルのアリコートを集め、分画収集プレートに入れる。SDSページ分析の後、純粋な標的タンパク質を含む分数を引き出し、標準プロトコルに従ってブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定する。タンパク質を含む排除された分画を選択します。HIS6タグを切断し、サンプルから余分なイミダゾールを除去するには、TEVプロテアーゼを1~10重量比で、TEV切断タンパク質の、標的タンパク質サンプルに添加する。そして、20ミリモルトリスの4リットルで一晩サンプルを拡張します。150 ミリモル塩化ナトリウムと 2 ミリモル DTT 溶液.翌朝、TEV切断NEMO-EEAAサンプルを2番目のIMACカラムに1分あたり1ミリリットルでロードします。96ボウル分数コレクションプレートに1ミリリットル分の分量で流れを集める。5つのボリュームの20ミリモルトリス、150ミリモル塩化ナトリウム、10ミリモルイミダゾール溶液を1分あたり1ミリリットルで洗います。最後の洗浄後、TEVを溶出し、20ミリモルトリス、150ミリモル塩化ナトリウム、500ミリモルイミダゾール、2ミリモルDTT溶液の3カラムボリュームを50ミリリットルフラスコにして、HIS6 NEMO-EEAAを解約した。分画を通して流れを引き出し、切断されたNEMO-EEAAを含み、攪拌された細胞濃縮器でサンプルを5ミリリットルに濃縮する。一晩透析を行った後、サンプルの5ミリリットルを16ミリメートル、60センチメートルサイズの除外クロマトグラフィーカラムに積み込みます。サンプル量に応じて、必要に応じて繰り返す。1分あたり1ミリリットル、2ミリモルトリス、100ミリモル塩化ナトリウムおよび2ミリモルDDT溶液で。分画を引っ張った後、二量体NEMO-EEAAに対応して、攪拌された細胞濃縮器にサンプルを濃縮し、分子量が3キロダルトンの膜を遮断し、最終的な濃度113マイクロモルにする。その後、摂氏4度で保存するためにタンパク質を最大1ヶ月間アリコートする。まばらなマトリックススクリーニングのために、2つの滴室の結晶化板の96の井戸のそれぞれに60マイクロリットルのまばらなマトリックス溶液を加える。座って蒸気拡散を落とすため。そして、ロボットドロップセッターにタンパク質溶液を追加します。次に、ロボットドロップセッターを使用して、1ミリリットル当たり1.65ミリグラムで100ナノリットルのタンパク質溶液を分配し、1滴のリザーバー溶液と1対1の比率で、200ナノリットルの最終体積に分配する。そして、134ナノリットルのリザーバー溶液を含む66ナノリットルのタンパク質溶液を、2個のドロップ中の200ナノリットルの最終体積に加える。その後、3インチ幅のシールテープでプレートを直ちに密封します。次に、トレイを結晶化イメージャーストレージに20°Cで保存します。プレートを保管してから2日後から、結晶の存在のために、自動的に収集された画像を確認する。種子ストック生成のために、目的の結晶を含む滴全体を、50マイクロリットルの結晶化条件溶液に移し、その中にバイアルを設け、種子生成キットから。そして、3分間、20秒間の脈動と10秒間の休息で、種子ストックを渦に入れます。次に、シードストックを1~10ずつ連続して希釈し、1~10,000まで下げます。そして、さらに使用するまで、摂氏4度で希釈液を保管してください。シンクロトロンに出荷する1〜2日前に、目的の結晶で、井戸の上からテープをカットします。そして、12%1、2プロパンDiO凍結保護剤を含む結晶化溶液の0.5マイクロリットルを直接ウェルに加える。クライオループでクリスタルをそっと取り外します。ウェルから結晶をループし、X線回折のために出荷するまで、液体窒素に浸したパックにクライオループを含む結晶を保管します。X線回折データを受信した後、STARおよびISOサーバでスケーリングされた強度を処理します。X線結晶学のインデックスを使用して、データの回折限界面に1.2の平均をカットしました。そしてフェニックスにロードします。構造を決定するには、GCN4のX線構造を、フェニックスのMRageを用いて分子置換の探索モデルとして使用します。4DMD構造は、アンサンブルとして定義されます。そしてMRageの解決はNEMO-EEAAの末端のコイルドコイル・アダプターに対応する構造部分に正常に造る。を検索モデルに対して、ダイマーの両方のチェーンに対して行います。オーバー発現タンパク質は、最初のIMACカラム精製の前に、約14キロダルトンの分子量マーカーでバンドに現れる。そして、最初の溶出後、それぞれ14キロダルトンと28キロダルトンで、モノマーバンドとダイマーバンドを表示する。TEV切断は、溶出に続いて、第2のIMACカラムを通じて、実質的に完了する。ほぼ完全に二量体として、予想される分子量で。サイズ排除クロマトグラフィーは、単一のピークを表示し、60〜65ミリリットルの間で、ダイマーに応答している。ファインスクリーニングは、NEMO-EEAA結晶の製造用の種子ストックを生成するために利用できる結晶を生成し、データ収集を行います。ここで、代表的なNEMO-EEAA結晶回折プロファイルが示されている。NEMO-EEAAタンパク質の構造解析は、均質な不規則な平行コイルコイル、長さ約175オングストロームを明らかにする。通常のコイルコイル領域は、末端で理想的なコイルコイルアダプターシーケンスを包含する。そして、NEMOの適切なシーケンスの最初の2つのヘプタッド。通常のコイルコイルは、C末に存在する。NEMO残基97から始まり、C端子理想的なコイルコイルアダプターを包含する。IKKベータ結合構造は、リガンドに対応するために、より開放されたコイルコイル確認を表示する。この領域で 1 から 2.2 オングストロームより大きな間間間隔を使用します。NEMOにおけるリガンドの構造は、計算法を通じて阻害剤の設計のための新しいターゲットを提供する。そして、小分子ライブラリーとの結合ポケットの目視スクリーニングのため。我々は現在、低分子リガンドとの複合体で、操作されたNEMO構築物の結晶化のための経路を持っています。新しいクラスの阻害剤の開発と最適化を支援する。

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