Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

이 프로젝트 전반에 걸쳐 많은 유용한 토론을 해주신 D. 매든 교수님께 감사드립니다. 우리는 최적화 된 GCN4 코일 코일을 포함하는 플라스미드의 선물에 대한 교수 D. Bolon 감사합니다. NEMO 플라스미드에 대해 B. Guo 박사님께 감사드립니다. 크리스티나 R. 아놀디, 타마 바시아시빌리, 에이미 E. 케네디에게 절차를 시연해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 BioMT 결정학 핵심 시설 및 다트머스의 화학 및 생화학 및 세포 생물학 부서의 결정학 장비 및 BioMT 인력의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국립 싱크로트론 광원 II의 AMX 빔 라인을 사용, 에너지의 미국 학과 (DOE) 계약 번호에 따라 브룩 헤븐 국립 연구소에 의해 과학의 DOE 사무실을 위해 운영 과학 사용자 시설의 사무실. DE-SC0012704. NSLS II의 직원들의 지원에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R03AR066130, R01GM133844, R35GM12863 및 P20GM113132, 그리고 멍크-Pfefferkorn 소설 및 대화 형 보조금에 의해 지원되었다.

1. 결정학을 위한 구조물의 디자인
<ol><li>N-말단 헥사-히스티딘 태그 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 T7 프로모터를 사용하여 대장균에서 발현을 위한 벡터에서 이전 간행물12에서와 같이 NEMO-EEAA의 서열을 복제한다. 참고: 본 프로토콜에서는 N-말단 헥사-히스티딘 태그 및 담배 식각 바이러스(TEV) 절단부위(10)를포함하도록 수정된 벡터를 사용하였?...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

UNBOUND 형태로 NEMO의 결정화 시도는 IKK 결합 도메인을 포괄하는 전신 단백질 및 여러 잘림 구수를 사용하는 시도를 포함하여 실패했다. 우리의 생체물리학적 특성은 NEMO의 IKK 결합 도메인(잔류물 44-111)에 의한 원형 이색증, NMR 분광법 및 형광 이방성으로, IKKβ를 결합할 수 있지만,결정화에 적합하지 않은 형태교환 상태로 존재한다는 것을나타냈다. 우리?...

NF-θB 통로는 사이토카인, 미생물 생성물 및 스트레스를 포함하는 다양한 자극에 반응하여 활성화되어, 염증 및 면역 반응, 세포 사멸 또는 생존 및 증식을 담당하는 표적 유전자의 발현을 조절한다1. 염증성 및 자가면역질환 및암을포함하는 병리학2,3,4,5는 NF-θB 활성의 변조를 새로운 치료법의 개발을 위한 주요 표적으로 삼고 있는 경로의 과활성화와 상관되어 있다6,7.
정식 NF-θB 통로는 특히 비정형 경로로부터 구별되며, 림프형성 및 B 세포 활성화를 담당하며, 비계 단백질 NEMO(NF-θB 필수 변조기8)에대한 전의 의존성으로 인해 IKK 복합체의 키나세 IKK및 IKKk와 의 조립된다. IKK 복합체는 분해를 대상으로 하는 IθBα(θB의 억제제)의 인산화를 담당하며, NF-θB 이dim제가 유전자 전사1을 위해 핵으로 전이되도록 해방시키고, 따라서 NF-θB 활성을 조절하는 억제제의 개발을 위한 매력적인 표적이된다.
우리의 연구는 NEMO와 IKKβ 사이의 단백질-단백질 상호 작용의 특성화에 초점을 맞추고, IKK 복합체 형성의 소분자 억제제개발을 위해 NEMO를 표적으로 합니다. IKKβ를 결합하는 데 필요한 NEMO의 최소 결합 도메인은 잔기 44-111을 포함하며, 그 구조는 IKKβ 서열 701-7459에대응하는 펩티드와 함께 복합적으로 결정되었다. NEMO 및 IKKβ는 NEMO 디머가 연장된 상호 작용 인터페이스를 가진 길쭉한 열린 홈에서 IKKβ(701-745)의 두 가지 나선을 수용하는 4-나선 번들을 형성합니다. IKKβ (734-742), 또한 NEMO 바인딩 도메인으로 알려진 (NBD), 바인딩에 대 한 가장 중요 한 핫스팟을 정의, 어디 두 개의 필수 트립토판스 (739,741) NEMO 주머니 내에서 깊이 묻혀. 복잡한 구조의 세부 사항은 NEMO를 표적으로 하는 작은 분자 억제제의 구조 기지를 둔 디자인 그리고 최적화에서 원조할 수 있습니다. 동시에, 결정에서 관찰된 바와 같이, 결정에서 관찰된 바와 같이, 소분자 또는 펩티드의 결합이 NEMO에서 완전한 형태 변화(즉, NEMO 코일 코일-코일 디머의 광범위한 개구부)를 재구성하는 것은 어렵다, 및 작은 분자 억제제에 결합된 UNBOUND NEMO 또는 NEMO의 구조는 더 나은 표적 을 위한 표적 을 나타낼 수 있다.
IKK 결합 도메인을 포괄하는 전체 길이 NEMO 및 더 작은 잘림 구조는 X선 결정학 및 핵 자기 공명(NMR) 방법10을통해 언바운드 형태로 구조 측정을 위해 난치성으로 입증되었으며, 이는 NEMO의 IKK 결합 도메인의 개선된 버전을 설계하도록 유도했습니다. 실제로, 언바운드 형태의 NEMO (44-111)는 부분적으로 접혀 있고 형태 교환을 거치므로 IKKβ에 대한 결합 친화도를 유지하면서 그 다이머지 구조, 코일 코일 접기 및 안정성을 안정화하도록 설정합니다. 단백질의 N-및 C-termini에서 이상적인 디메릭 코일 코일 코일 서열11의 3개의 heptads를, 그리고 4점 돌연변이의 시리즈를 결합하여, 우리는 NEMO-EEAA, 완전 증분 및 코일 코일에 접힌 구성을 생성하여, 전체 길이 NEMO1에대해 관찰된 바와 같이 나노몰 범위에 IKK 결합 친화도를 구출하였다. 추가적인 이점으로, 우리는 코일 코일 어댑터(GCN4 서열에 기반)가 결정화를 용이하게 하고 결국 분자 교체를 통한 X선 구조 결정에 도움이 되기를 희망했습니다. 코일 코일 어댑터는 유사하게 안정성을 높이고, 용액 거동을 개선하며, 트리머 코일 코일 및 항체단편(13,14)에대한 결정화를 용이하게 하기 위해 유사하게 이용되고 있다. NEMO-EEAA는 대장균 세포에서 쉽게 발현되고 정제되며, 용해성이며, 안정된 디메릭 코일 코일 코일에 접혀 1.9 Å로 회절하여 쉽게 결정화됩니다. GCN4의 주문된 코일 코일 영역의 존재는 GCN415의공지된 구조를 사용하여 분자 대체에 의해 NEMO-EEAA의 결정으로부터 데이터를 스테이징하는 데 추가로 도움이 될 수 있다.
apo-NEMO-EEAA로 얻은 결과를 감안할 때, 우리는 여기에 기술된 프로토콜이 NEMO 억제제(NBD 펩티드 와 같은) 또는 소분자 억제제의 존재 시 NEMO-EEAA의 결정화에도 적용될 수 있다고 믿으며, 이는 초기 억제제의 NEMO 억제 및 구조 기반 최적화에 대한 요구 사항을 이해하는 것을 목표로 합니다. 많은 코일 코일 도메인(16)의가소성과 동적 특성을 감안할 때, 코일 코일 어댑터의 사용은 구조적 결정에 도움이 더 일반적인 적용성을 찾을 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO는 키나아제 IKKα 및 IKKβ와 함께 IKK 복합체를 조립함으로써 NF-θB 통로에서 필수적인 역할을 하는 스캐폴딩 단백질이다. 활성화시, IKK 복합체는 NF-θB 핵 전좌 및 표적 유전자의 활성화로 이어지는 IθB 분자를 인산화한다. NEMO/IKK 상호 작용의 억제는 NF-θB 통로 활동의 변조를 위한 매력적인 치료 패러다임, 억제제 설계 및 발견을 위한 NEMO를 표적으로 만들기. NEMO 억제제의 발견 및 최적화 과정을 용이하게 하기 위해, 우리는 작은 분자량 억제제에 결합하는 동안 아포 형태로 단백질의 구조 측정을 허용하는 NEMO의 IKK 결합 도메인의 개선된 구성을 설계했습니다. 여기서는 NEMO의 IKK 바인딩 도메인의 설계, 표현 및 구조적 특성화에 활용되는 전략을 제시합니다. 단백질은 대장균 세포에서 발현되고, 변성 조건 하에서 용해되고 3개의 크로마토그래피 단계를 통해 정제된다. 구조 측정을 위한 결정 얻기 위한 프로토콜에 대해 논의하고 데이터 수집 및 분석 전략을 설명합니다. 프로토콜은 NEMO 및 소분자 억제제의 복합체의 구조 결정에 넓은 적용성을 찾을 수 있습니다.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 복제, 발현 및 정제. 이 연구에서 이어진 프로토콜은 회절 품질 결정을 생성하는 NEMO-EEAA(그림1A)의최종 서열을 얻기 위해, N-및 C-종점, 돌연변이 C76A, C95S 및 돌연변이 E56A, E56A에서 코일 코일 어댑터의 추가를 포함하여 모든 중간 구조자의 발현 및 특성화를 수반하였다. 도 1B는 <strong class="xf...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

이 프로토콜은 UNbound 형태로 NEMO의 IKK 바인딩 도메인의 성공적인 구조 측정을 용이하게 합니다. 그리고 생산 및 결정화의 세부 사항. 이 프로토콜은 결정화 및 구조 측정을 용이하게 하는 코일 코일 어댑터를 통해 NEMO의 IKK 바인딩 도메인 단편의 네이티브 확인을 이 안정화를 활용합니다.NEMO의 구조 생물학은, 표적으로, 선동적이고 자가면역 질병 및 암의 처리를 위한 NEMO 억제제의 발달에 있는 중요한 이점을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 약물 발견 또는 최적화를 위한 펩타이드 또는 소분자 억제제와 함께 NEMO 복합체의 구조 적 결정으로 확장될 수 있다. 단백질 재접및 농도는 단백질 생산 단계에서 순수 NEMO 이량체를 얻는 데 기본적입니다.결정화 조건에서 집계를 제한하고 용해도를 보장합니다. 절차를 시연하는 것은 타마와 에이미, 우리의 실험실에서 대학원생이 될 것입니다. 훌륭한 국물 용액의 20 밀리리터를 추가하여 시작합니다.그리고 암피실린의 밀리리터 스톡 솔루션당 100 밀리그램의 20 마이크로리터. 125 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에. 다음 셀 글리세롤 주식의 몇 마이크로 리터, 에서 80 섭씨 저장, BL21DE3 유능한 세포의.벡터로 변환됩니다. 하룻밤 동안 스타터 문화를 흔들어 37섭고 분당 220회전에서 세포를 0.1 밀리리터의 OD600과 250 밀리리터로 희석시. 그리고 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 최종 농도에 암피실린을 추가합니다.배양의 OD600이 0.8 대 1에 도달하면, 500 마이크로몰라 농도에 IPTG를 배양에 추가한다. OD600이 6~10도에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 성장시다. 배양의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 퇴적.그리고 리시스 버퍼의 40 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 다시 중단된 세포를 20~25밀리리터 알리쿼트로 분할합니다. 그리고 프랑스 언론을 사용하여 차가운 방에서 알리쿼트 당 2 ~3 회, 세포에 압력의 평방 인치 당 약 25, 000 파운드를 적용합니다.다음으로, 8개의 어금니의 최종 농도에 세포 용액에 우레아를 추가한다. 그리고 실온에서 2~16시간 동안 흔들 플랫폼에서 셀 용액을 배양합니다. 다음 날 아침, 용양을 초원심분리기 튜브로 옮기고, 튜브당 적어도 3쿼터로 옮습니다.그리고 45 분 동안 lysates를 ulrta 원심 분리합니다. 슈퍼네이트를 50밀리리터 원뿔 튜브로 데칭합니다. 그리고 요소 인큐베이션 된 상체를 IMAC 열에 분당 3 밀리리터로 로드합니다.모든 상체가 컬럼을 통과하면 10개의 열 볼륨에 대한 열을 분당 3밀리리터로 바인딩 버퍼로 세척합니다. 그리고 12컬럼 부피 그라데이션을 통해 10에서 500 밀리머 이미다졸에서 NEMO-EEAA 단백질의 그라데이션 용출을 수행합니다. 용액의 밀리리터 알리쿼트 1개를 분수 컬렉션 플레이트로 수집합니다.SDS 페이지 분석 후, 표준 프로토콜에 따라, 순수한 표적 단백질을 포함하는 분획을 당기고 브래드포드 분석에 의한 단백질 농도를 측정한다. 단백질을 함유한 피각을 선택합니다. HIS6 태그를 크리브하고 샘플에서 과도한 imidazole를 제거하기 위해 TEV 프로테아제를 TEV 크리브 단백질의 1 대 10 중량 비율로 표적 단백질 샘플에 추가합니다.그리고 20 밀리머 트리의 네 리터에 하룻밤 샘플을 팽창. 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨과 2 개의 밀리머 DTT 용액. 다음 아침, TEV cleaved NEMO-EEAA 샘플을 분당 1 밀리리터로 두 번째 IMAC 열에 로드합니다.96 그릇 분수 수집 플레이트에서 1 밀리리터 분획으로 흐름을 수집합니다. 20 밀리머 트리, 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨 및 10 밀리머 이미다졸 용액의 5 권으로 컬럼을 분당 1 밀리리터로 세척하십시오. 마지막 세척 후, TEV를 엘테우고 삼촌 HIS6 NEMO-EEAA, 3 개의 컬럼 볼륨20 밀리머 트리스, 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨, 500 밀리머 imidazole와 2 밀리머 DTT 솔루션, 50 밀리 리터 플라스크에.갈라진 NEMO-EEAA 구조를 포함하는 분획을 통해 흐름을 당기고 교반된 세포 농축기로 샘플을 5밀리리터로 농축합니다. 야간 투석 후, 샘플의 5 밀리리터를 16밀리미터에 60센티미터 크기의 배제 크로마토그래피 컬럼으로 적재합니다. 필요에 따라 반복, 샘플 볼륨에 따라.분당 1 밀리리터, 2밀리머 트리, 100 밀리머 염화 나트륨 및 2 밀리머 DDT 용액. 디메라 NEMO-EEAA에 대응하는 분획을 당긴 후, 3킬로달톤의 멤브레인을 차단하는 분자량으로 교반된 세포 농축기에서 샘플을 113 마이크로몰라의 최종 농도로 농축한다. 그런 다음 최대 1개월 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있는 단백질을 알리쿼트합니다.희소 매트릭스 스크리닝의 경우, 2개의 드롭 챔버 결정화 플레이트의 96개의 우물 각각에 스파스 매트릭스 용액 60마이크로리터를 추가합니다. 앉아서 증기 확산을 드롭합니다. 그리고 로봇 낙하 세터에 단백질 용액을 추가합니다.다음으로, 로봇 낙하 세터를 사용하여 밀리리터당 1.65 밀리그램의 단백질 용액 100나노리터를 1대 1비율로 1대 1비율로 1,000나노리터의 최종 부피에 분배합니다. 또한 134나노리터의 저수지 용액을 가진 66나노리터의 단백질 용액을 200나노리터의 최종 부피에 2개의 나노리터를 추가합니다. 그런 다음 3 인치 너비의 밀봉 테이프로 즉시 접시를 밀봉하십시오.그런 다음 트레이를 결정화 이미저 저장소에 섭씨 20도에 저장합니다. 플레이트를 저장한 후 2일부터 크리스탈의 존재를 위해 자동으로 수집된 이미지를 확인합니다. 종자 스톡 생성의 경우, 관심의 결정을 포함하는 전체 낙하를 종자 생성 키트로부터 제공된 바이알에서 결정화 조건 용액 50 마이크로리터로 전송한다.그리고 3 분 동안 맥동 20 초 와 10 초의 휴식으로 종자 스톡을 소용돌이. 그런 다음 종자 주식을 1-10 단위로 1개에서 10, 000까지 희석합니다. 그리고 추가 사용까지, 섭씨 4도에 희석을 저장합니다.1~2일 전에 싱크로트론으로 발송하기 전에, 관심의 결정과 함께 우물 꼭대기에서 테이프를 잘라냅니다. 그리고 12%1, 2개의 프로판 디오 냉동보호제를 함유한 결정화 용액0.5 마이크로리터를 웰에 직접 추가합니다. 저온 루프로 크리스탈을 부드럽게 빼냅니다.잘에서 결정을 반복하고, 액체 질소에 침지 퍽에 냉동 루프를 포함하는 크리스탈을 저장, X 선 회절에 대한 선적까지. X선 회절 데이터를 받은 후 STAR 및 ISO 서버에서 확장된 강도를 처리합니다. 데이터에 대한 회절 제한 표면에 대해 1.2의 X 선 결정 학인 차단을 사용하는 평균을 차단합니다.그리고 피닉스에 로드합니다. 구조를 결정하려면, 분자 대체를 위한 검색 모델로 GCN4의 X선 구조를 사용하여, 피닉스에서 MRage를 사용하여. 4DMD 구조는 앙상블로 정의됩니다.그리고 MRage 솔루션은 NEMO-EEAA의 말단 코일 코일 어댑터에 대응하는 구조 부로 성공적으로 구축할 것입니다. 디머의 두 체인에 대해 검색 모델에. 오버 발현 단백질은 밴드에서, 약 14킬로달톤의 분자량 마커에서, 첫번째 IMAC 컬럼 정화의 앞에 나타납니다.그리고 첫 번째 용출 후 각각 14 킬로톤과 28 킬로달톤에서 단조로운 밴드와 이머 밴드를 표시합니다. TEV 분열은 두 번째 IMAC 열을 통해 용출에 따라 실질적으로 완료됩니다. 거의 전적으로 이량으로, 예상 된 분자량에서.크기 제외 크로마토그래피는 60~65밀리리터를 제외한 단일 피크를 표시하며, 이량에 반응합니다. 미세 한 스크리닝은 데이터 수집을 위해 NEMO-EEAA 결정의 생산을 위해 종자 재고를 생산하는 데 활용할 수있는 결정을 생성합니다. 여기서, 대표적인 NEMO-EEAA 결정 회절 프로파일이 표시됩니다.NEMO-EEAA 단백질의 구조적 분석은, 동종 불규칙한 병렬 코일, 길이약 175개의 협질등을 나타낸다. 일반 코일 코일 영역은 종단말의 이상적인 코일 어댑터 시퀀스를 포괄합니다. 그리고 NEMO 적절한 시퀀스의 처음 두 heptads.C 종결에는 정기적인 코일 코일도 존재합니다. NEMO 잔류물 97에서 시작하여 C 단자 이상적인 코일 어댑터를 포괄합니다. IKK 베타 바운드 구조는 리간드를 수용하기 위해 보다 개방적인 코일 코일 확인을 표시합니다.이 지역에서 1~2.2앙스트롬의 간격이 더 커진 다. NEMO의 리간드 구조는 계산 방법을 통해 억제제 설계에 대한 새로운 표적을 제공합니다. 그리고 작은 분자 라이브러리와 결합 포켓의 시각적 스크리닝을 위해.우리는 지금 작은 분자 리간드가 있는 복합체에서 엔지니어링된 NEMO 구조물의 결정화를 위한 통로가 있습니다. 새로운 종류의 억제제개발 및 최적화를 돕습니다.

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Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

연구

생화학

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

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생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

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Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

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A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

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생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

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The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

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