Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Vi takker Prof. D. Madden, for mange nyttige diskusjoner gjennom dette prosjektet. Vi takker Prof D. Bolon for gaven av plasmider inneholder optimalisert GCN4 spiral coil. Vi takker Dr. B. Guo for NEMO plasmider. Vi takker Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili og Amy E. Kennedy for å demonstrere prosedyren. Vi takker BioMT Crystallography Core Facility og avdelingene for kjemi og biokjemi & Cell Biology på Dartmouth for bruk av Crystallography utstyr og BioMT personell for deres støtte. Denne forskningen anvendt det AMX beamline av det nasjonal Synchrotron lyset kilde II, en U.S. avdeling av energi (DOE) kontor av vitenskap bruker Letter operert for DOE kontor av vitenskap av Brookhaven nasjonal laboratorium under kontrakt nei. DE-SC0012704. Vi takker de ansatte på NSL II for deres støtte. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 og P20GM113132, og en Munck-Pfefferkorn Novel og Interactive stipend.

1. design av konstruksjon for crystallography
<ol><li>Klon sekvensen av NEMO-AEEE som i forrige publikasjon12 i en vektor for uttrykk i E. coli ved hjelp av T7 promoter, inkludert en N-Terminal Hexa-histidin Tag og en protease kløft området. Merk: i denne protokollen, brukte vi en vektor modifisert til å omfatte en N-Terminal Hexa-histidin Tag og en tobakk etch virus (TEV) kløft området10. Denne vektoren Letter kløft av hans tag for protein krystalliseri...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Krystallisering forsøk på NEMO i den ubundne formen var mislykket, inkludert forsøk med full lengde protein og flere avkorting konstruksjoner som omfattet det IKK-bindende domenet. Våre Biofysiske karakterisering av ikk-binding domenet til Nemo (rester 44-111) av sirkulære dichroism, NMR spektroskopi og fluorescens anisotropien indikerte at konstruksjonen, om enn i stand til å binde IKKβ, eksisterte i en tilstand av conformational Exchange, ikke egnet for krystallisering9,<sup cl...

NF-KB-veien aktiveres som svar på en rekke stimuli, inkludert cytokiner, mikrobielle produkter og stress, for å regulere uttrykk for mål gener som er ansvarlige for inflammatorisk og immunrespons, celle død eller overlevelse og spredning1. Patologi inkludert inflammatoriske og autoimmune sykdommer og kreft2,3,4,5 har vært korrelert til hyperactivation av veien, som har gjort modulering av NF-KB aktivitet en førsteklasses mål for utvikling av nye terapier6,7.
Den kanoniske NF-KB veien spesielt skilles fra ikke-kanoniske veien, ansvarlig for lymphorganogenesis og B-celle aktivering, av den tidligere avhengighet av stillas proteinet NEMO (NF-KB essensielle modulator8) for montering av ikk-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Den IKK komplekset er ansvarlig for fosforylering av IκBα (inhibitor av KB) som mål den for degradering, frigjør NF-KB dimers til translocate til kjernen for genet transkripsjon1 og er derfor et attraktivt mål for utvikling av hemmere å modulere NF-KB aktivitet.
Vår forskning fokuserer på karakterisering av protein-protein interaksjon mellom NEMO og IKKβ, målretting NEMO for utvikling av små molekyler hemmere av IKK kompleks formasjon. Den minimale bindende domene av NEMO, som kreves for å binde IKKβ, omfatter rester 44-111, og dens struktur har blitt bestemt i komplekse med et peptid tilsvarende IKKβ sekvens 701-7459. NEMO og IKKβ danner en fire-Helix bunt der NEMO dimer rommer de to helikser av IKKβ (701-745) i en langstrakt åpen Groove med en utvidet interaksjon grensesnitt. IKKβ (734-742), også kjent som NEMO-bindende domene (neste arbeidsdag), definerer det viktigste hot-spot for binding, hvor de to essensielle tryptophans (739 741) begraver dypt inne i NEMO-lommen. Detaljene i den komplekse strukturen kan hjelpe til med struktur BAS ert design og optimalisering av små molekyl hemmere som er rettet mot NEMO. På samme tid, er det vanskelig at bindingen av et lite molekyl eller peptid ville gjenskape i NEMO hele conformational endring (dvs. omfattende åpning av NEMO spiral-coil dimer) forårsaket av binding av den lange IKKβ (701-745), som observert i krystall, og strukturen av ubundet NEMO eller NEMO bundet til en liten molekyl inhibitor kan representere et bedre mål for struktur-basert narkotika design og hemmer optimalisering.
Full lengde NEMO og mindre avkorting konstruksjoner som omfatter IKK-binding domenet har bevist intractable for struktur bestemmelse i ubundet form via røntgen crystallography og kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) metoder10, som fikk oss til å designe en forbedret versjon av ikk-binding domene av Nemo. Faktisk er NEMO (44-111) i ubundet form bare delvis foldet og gjennomgår conformational utveksling og vi derfor satt til å stabilisere sin dimeric struktur, spiral-coil fold og stabilitet, og samtidig bevare bindende affinitet for IKKβ. Ved å føye tre heptads av ideelle dimeric spiral-coil sekvenser11 på N-og C-Termini av proteinet, og en serie på fire punkt mutasjoner, genererte vi Nemo-aeee, en konstruere fullt dimeric og foldet i en spiral spiral, som reddet ikk-binding affinitet til nanomolar området som observert for full lengde Nemo12. Som en ekstra fordel, håpet vi at spiral-coil adaptere (basert på GCN4 sekvensen) ville lette krystallisering og til slutt bistand i X-ray struktur besluttsomhet via molekylær erstatning. Spiral-spole adaptere har blitt brukt på samme måte både for å øke stabiliteten, forbedre løsnings atferden og tilrettelegge for krystallisering for trimeric spiral spoler og antistoff fragmenter13,14. NEMO-AEEE er lett uttrykt og renset fra Escherichia. coli celler med en spaltbare histidin tag, er løselig, foldet i en stabil dimeric spiral coil og er lett krystallisert, med diffraksjon til 1,9 å. Tilstedeværelsen av de bestilte spiral-coil regionene i GCN4 kan i tillegg bistand i å fase dataene fra krystaller av NEMO-AEEE av molekylær erstatning ved hjelp av den kjente strukturen i GCN415.
Gitt resultatene oppnådd med Apo-NEMO-AEEE, tror vi protokollene beskrevet her kan også brukes til krystallisering av NEMO-AEEE i nærvær av små peptider (som neste arbeidsdag peptid) eller små molekyl hemmere, med mål om å forstå kravene til NEMO hemming og struktur-basert optimalisering av innledende føre hemmere til høy affinitet. Gitt plastisitet og dynamiske natur mange spiral-coil domener16, kan bruken av spiral adaptere finne mer generell anvendelse i å hjelpe strukturelle besluttsomhet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO er et stillas protein som spiller en viktig rolle i NF-KB veien ved å montere IKK-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Ved aktivering IKK komplekse fosforylerer IκB molekyler som fører til NF-KB kjernefysiske translokasjon og aktivering av mål gener. Hemming av NEMO/IKK interaksjon er et attraktivt terapeutisk paradigme for modulering av NF-KB Pathway aktivitet, noe som gjør NEMO et mål for hemmere design og oppdagelse. For å lette prosessen med oppdagelse og optimalisering av NEMO-hemmere, utviklet vi en forbedret konstruksjon av det IKK-bindende domenet til NEMO som ville muliggjøre struktur bestemmelse av proteinet i Apo form og mens bundet til små molekylvekt hemmere. Her presenterer vi strategien benyttet for design, uttrykk og strukturelle karakterisering av IKK-bindende domenet til NEMO. Proteinet uttrykkes i E. coli celler, solubilized under denaturering forhold og renset gjennom tre kromatografiske trinn. Vi diskuterer protokollene for å skaffe krystaller for struktur besluttsomhet og beskriver datainnsamling og analyse strategier. Protokollene vil finne bred anvendelse til strukturen bestemmelse av komplekser av NEMO og små molekyl hemmere.

Kloning, uttrykk og rensing av IKK-binding domenet til NEMO. Protokollen fulgte i denne studien for å få den endelige sekvensen av NEMO-AEEE (figur 1A), som produserte Diffraksjon kvalitet krystaller, involverte uttrykk og karakterisering av alle mellomliggende konstruksjoner, inkludert tillegg av spiral-coil adaptere på N-og eller C-Terminus, mutasjoner C76A, C95S og mutasjoner E56A, E57A. Figur 1B viser ...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Vi beskriver protokoller for strukturen bestemmelse av IKK-bindende domene av NEMO av X-ray crystallography. Metodene omfatter protein uttrykk, rensing og karakterisering, samt strategier for vellykket krystall optimalisering og struktur bestemmelse av proteinet i sin ubundet form.

Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Denne protokollen forenkler vellykket strukturbestemmelse av IKK-bindingsdomenet NEMO, i sin ubundet form. Og detaljer om produksjon og krystallisering. Protokollen, drar nytte av denne stabiliseringen av den opprinnelige bekreftelsen av IKK bindende domenefragment av NEMO, gjennom kveilet-coil adaptere, som letter krystallisering og struktur bestemmelse.Den strukturelle biologien til NEMO, som mål, gir en viktig fordel i utviklingen av NEMO-hemmere for behandling av inflammatoriske og autoimmune sykdommer og kreft. Denne protokollen kan utvides til strukturen bestemmelse av NEMO komplekser, med peptid eller små molekylhemmere for narkotika oppdagelse eller optimalisering. Proteinet som er omgang og konsentrasjon, under proteinproduksjonsstadiet, er grunnleggende for å oppnå en ren NEMO-dimer.Begrense aggregering og sikre løselighet under krystalliseringsforhold. Demonstrere prosedyrene vil være Tamar og Amy, graduate studenter i vårt laboratorium. Begynn med å legge til 20 milliliter med fantastisk kjøttkraftløsning.Og 20 mikroliter av en 100 mg per milliliter lagerløsning av ampicillin. Til en 125 milliliter Erlenmeyer kolbe. Etterfulgt av noen mikroliter av celleglyserol lager, fra 80 grader Celsius lagring, av BL21DE3 kompetente celler.Forvandlet med vektor. Etter å ha ristet startkulturen over natten, ved 37 grader Celsius og 220 rotasjoner per minutt, fortynne cellene til en OD600 på 0,1 og 250 milliliter med fantastisk kjøttkraft. Og tilsett ampicillin til en endelig konsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter.Når OD600 av kulturen når 0,8 til 1, legg IPTG til kulturen, til en 500 mikromolarkonsentrasjon. Og vokse cellene i fire timer, ved 37 grader Celsius, til OD600 når seks til 10. På slutten av inkubasjonen sedimenter cellene ved sentrifugering.Og re-suspendere pellet i 40 milliliter lysis buffer. Del de re-suspenderte cellene i to 20 til 25 milliliter aliquots. Og bruk en fransk presse til å bruke ca 25,000 pounds per kvadrattomme trykk til cellene, to til tre ganger per aliquot, i et kaldt rom.Deretter legger urea til cellelylatene, til en endelig konsentrasjon på åtte molar. Og inkuber celleløsningen på en gyngeplattform i to til 16 timer, ved romtemperatur. Neste morgen, overføre lysates til ultra-sentrifuge rør, til minst tre fjerdedeler full, per rør.Og ulrta sentrifuge lysates, i 45 minutter. Dekanter supernativa i et 50 milliliter konisk rør. Og last urea inkubert supernatant på en IMAC-kolonne, med tre milliliter per minutt.Når alle de supernatante har kjørt gjennom kolonnen, vask kolonnen for 10 kolonnevolumer, med bindingsbuffer, med tre milliliter per minutt. Og utfør gradient elution av NEMO-EEAA protein fra 10 til 500 millimolar imidazol, over en 12 kolonne volum gradient. Samle en milliliter aliquots av eluate, i en brøkdel samling plate.Etter analyse av SDS-siden trekker du fraksjonene som inneholder det rene målproteinet og måler proteinkonsentrasjonen ved Bradford-analysen, i henhold til standardprotokollen. Velg de unnslappe brøkene som inneholder protein. For å holde HIS6-taggen og fjerne overflødig imidazol fra prøven, tilsett TEV protease, med ett til 10 vektforhold, av TEV spaltet protein, til målproteinprøven.Og utvide prøven over natten i fire liter 20 millimolar Tris. 150 millimolar natriumklorid og to millimolar DTT oppløsning. Neste morgen laster du TEV-spaltet NEMO-EEAA-prøven, på en annen IMAC-kolonne, med en milliliter per minutt.Samle flyten gjennom i en milliliter brøkdeler, i en 96 bolle brøk oppsamling plate. Vask kolonnen med fem volumer av 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumklorid og 10 millimolar imidazol løsning, på en milliliter per minutt. Etter siste vask, elute TEV og uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, med tre kolonnevolumer på 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumklorid, 500 millimolar imidazol og to millimolar DTT løsning, i en 50 milliliter kolbe.Trekk strømmen gjennom fraksjoner, som inneholder spaltede NEMO-EEAA konstruere og konsentrere prøven med en rørt cellekonsentrator, til fem milliliter. Etter natten dialyse som demonstrert, laste fem milliliter av prøven på 16 millimeter med 60 centimeter størrelse utelukkelse kromatografi kolonner. Gjentar etter behov, i henhold til prøvevolumet.På en milliliter per minutt, og på to millimolar Tris, 100 millimolar natriumklorid og to millimolar DDT løsning. Etter å ha trukket fraksjonene, tilsvarende den dimeriske NEMO-EEAA, konsentrere prøven i den omrørte cellekonsentratoren, med en molekylvekt avskåret membran på tre kilodalton, til en endelig konsentrasjon på 113 mikromos. Deretter, aliquot proteinet for lagring på fire grader Celsius, i opptil en måned.For sparsom matrisescreening, tilsett 60 mikroliter sparsom matriseløsning i hver av de 96 brønnene i en krystalliseringsplate med to dråper kammer. For sitte og slippe dampdiffusjon. Og legg til proteinløsningen til en robotsekistsetter.Deretter bruker du en robotsekr dråpesetter, til å dispensere 100 nanoliter proteinoppløsning ved 1,65 milligram per milliliter, i et forhold med reservoarløsning i dråpe én, til et endelig volum på 200 nanoliter. Og tilsett 66 nanoliter proteinoppløsning med 134 nanoliter reservoaroppløsning, til et endelig volum på 200 nanoliter i dråpe to. Deretter forsegler du umiddelbart platen med tre tommers bred tetningstape.Deretter lagrer du skuffene i en krystalliseringsbilderlagring, ved 20 grader Celsius. Sjekke bildene samlet automatisk, for tilstedeværelse av krystaller, starter to dager etter lagring av platene. For frølagergenerering, overfør hele dråpen som inneholder krystallen av interesse, til 50 mikroliter krystalliseringstilstandsløsning, i det medfølgende hetteglasset, fra et frøgenereringssett.Og vortex frø lager, med 20 sekunder pulserende og 10 sekunder hvile, i tre minutter. Deretter fortynner du frøbeholdningen, i en til 10 trinn, ned til en til 10 000. Og lagre fortynningene ved fire grader Celsius, til videre bruk.En til to dager før forsendelse til synchrotron, kutt båndet fra toppen av brønnen, med krystall av interesse. Og tilsett 0,5 mikroliter krystalliseringsløsning som inneholder 12%en, to propan DiO kryobeskyttende, direkte til brønnen. Løsne krystallen forsiktig med en kryosløyfe.Loop krystallen fra brønnen, og lagre krystallen som inneholder kryosløyfe i en puck nedsenket i flytende nitrogen, til forsendelse for røntgendiffraksjon. Etter å ha mottatt røntgendiffraksjonsdataene, behandler du de skalerte intensitetene i STAR- og ISO-serveren. Ved hjelp av en røntgenkrystallografi indeksering avskåret gjennomsnitt, av 1,2 for diffraksjon grensen overflaten for dataene.Og last på Phoenix. For å bestemme strukturen, bruk røntgenstrukturen til GCN4 som en søkemodell for molekylær erstatning, ved hjelp av MRage i Phoenix. 4DMD-strukturen, vil bli definert som et ensemble.Og MRage-løsningen vil med hell bygge til strukturdelen, tilsvarende endeterminalen coiled-coil adapter av NEMO-EEAA. søkemodellen, for begge kjedene i dimeren. Det over uttrykte proteinet vises på et bånd, med ca. 14 kilodaltonmolekylærvektmarkør, før den første IMAC-kolonnerensingen.Og viser et monomerbånd og et dimerband, henholdsvis 14 og 28 kilodaltonn, etter den første elutionen. TEV cleavage er praktisk talt komplett, etter elution, gjennom den andre IMAC-kolonnen. Nesten helt som en dimer, ved forventet molekylær vekt.Størrelse eksklusjon kromatografi, viser en enkelt topp, unnviker mellom 60 til 65 milliliter, som reagerer på dimer. Fin screening produserer krystaller som kan brukes til å produsere en frø lager for produksjon av NEMO-EEAA krystaller, for datainnsamling. Her vises representative NEMO-EEAA krystaller diffraksjonsprofiler.Strukturell analyse av NEMO-EEAA-proteinet, avslører en homodimerisk uregelmessig parallell kveilet spole, ca. 175 angstroms i lengde. Den vanlige kveilet-coil regionen, omfatter den ideelle kveilet-coil adapter sekvens, på slutten terminus. Og de to første heptads av NEMO riktig sekvens.En vanlig kveilet spole, er også til stede på C terminus. Starter ved NEMO rester 97 og omfatter C-terminalen ideell kveilet-coil adapter. IKK beta bundet struktur, viser en mer åpen kveilet-coil bekreftelse, for å imøtekomme ligand.Med en større interhelical avstand med en til 2,2 angstroms i denne regionen. Strukturen til en ligand i NEMO, tilbyr et nytt mål for utforming av inhibitorer gjennom beregningsmetoder. Og for visuell screening av bindende lommer med små molekylbiblioteker.Vi har nå en bane for krystallisering av den konstruerte NEMO-konstruksjonen i kompleks med små molekylligander. For å hjelpe til med å utvikle og optimalisere en ny klasse inhibitorer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produksjon, krystallisering og struktur Bestemmelse av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding og sink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide til produksjon, krystallisering og proteinstrukturer av menneskelig IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering Alpakka (Lama Britis) med Protein antigener og produksjon av Antigen-spesifikke enkelt domene antistoffer

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturell bestemmelse av et enzym:Substrat kompleks av seriell krystallografi i en allsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...