Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Agradecemos ao Prof. D. Madden por muitas discussões úteis ao longo deste projeto. Agradecemos ao Prof. D. Bolon pelo dom do plasmídeo contendo a bobina enrolada GCN4 otimizada. Agradecemos ao Dr. B. Guo por plasmids NEMO. Agradecemos christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili e Amy E. Kennedy para demonstrar o procedimento. Agradecemos ao BioMT Crystallography Core Facility e aos departamentos de Química e Biologia Celular em Dartmouth pelo uso do equipamento de cristalografia e do pessoal da BioMT por seu apoio. Esta pesquisa usou a linha de luz AMX do National Synchrotron Light Source II, um Departamento de Energia dos EUA (DOE) Office of Science User Facility operado para o Escritório de Ciência do DOE pelo Laboratório Nacional de Brookhaven o Contrato Nº. DE-SC0012704. Agradecemos ao pessoal da NSLS II pelo seu apoio. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 e P20GM113132, e uma subvenção Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

1. Projeto de construção para cristalografia
<ol><li>Clonar a seqüência de NEMO-EEAA como na publicação anterior12 em um vetor de expressão em E. coli usando o promotor T7, incluindo uma tag hexa-histidina n-terminal e um local de clivagem protease. NOTA: Neste protocolo, usamos um vetor modificado para incluir uma etiqueta de hexa-histidina terminal N e um site de clivagem tobacco Etch Virus (TEV)10. Este vetor facilita a clivagem da sua marca para cri...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. 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S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

As tentativas de cristalização do NEMO na forma desvinculada não tiveram sucesso, incluindo tentativas de utilização da proteína de corpo inteiro e várias construções de truncation que abrangem o domínio de ligação ao IKK. Nossa caracterização biofísica do domínio ikk-obrigatório de NEMO (resíduos 44-111) por dicroismo circular, espectroscopia NMR e anisotropia de fluorescência indicou que a construção, embora capaz de ligar IKKβ, existia em um estado de troca conformaçãoal, não é adequado para ...

A via NF-κB é ativada em resposta a uma variedade de estímulos, incluindo citocinas, produtos microbianos e estresse, para regular a expressão de genes-alvo responsáveis pela resposta inflamatória e imune, morte celular ou sobrevivência e proliferação1. Patologias, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes e câncer2,3,4,5 foramcorrelacionadas à hiperativação da via, o que tornou a modulação da atividade NF-κB um alvo principal para o desenvolvimento de novas terapias6,7.
A via canônica NF-κB, em particular, distingue-se da via não canônica, responsável pela linfogenênese e ativação de células B, pela dependência do primeiro da proteína de andaimes NEMO (modulador essencial NF-κB8)para a montagem do complexo IKK com as quinases IKKα e IKKβ. O complexo do IKK é responsável pela fosforilação de IκBα (inibidor da κB) que o visa para degradação, liberando os dimers NF-κB para translocar para o núcleo para transcrição gênica1 e, portanto, é um alvo atraente para o desenvolvimento de inibidores para modular a atividade NF-κB.
Nossa pesquisa se concentra na caracterização da interação proteína-proteína entre NEMO e IKKβ, visando NEMO para o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas da formação complexa do IKK. O domínio de ligação mínimo do NEMO, necessário para ligar IKKβ, abrange resíduos 44-111, e sua estrutura foi determinada em complexo com um peptídeo correspondente à seqüência IKKβ 701-7459. NEMO e IKKβ formam um pacote de quatro hélices onde o dimer NEMO acomoda os dois helices de IKKβ (701-745) em um sulco aberto alongado com uma interface de interação estendida. IKKβ (734-742), também conhecido como domínio nemo-obrigatório (NBD), define o ponto quente mais importante para a ligação, onde os dois triptofanos essenciais (739.741) enterrar profundamente dentro do bolso NEMO. Os detalhes da estrutura complexa podem auxiliar no projeto e otimização baseados na estrutura de inibidores de pequenas moléculas visando nemo. Ao mesmo tempo, é difícil que a ligação de uma pequena molécula ou peptídeo recriaria em NEMO a mudança conformal completa (ou seja, a abertura extensiva do dimer de bobina enrolada nemo) causada pela ligação do longo IKKβ (701-745), como observado no cristal, e a estrutura de NEMO ou NEMO desvinculado saqueada pode representar um alvo melhor para o projeto e inibição de drogas baseados em estrutura.
Nemo de comprimento total e construções de truncação menores que abrangem o domínio ikk-binding provaram intratável para a determinação da estrutura na forma desvinculada através de cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear (RMN) métodos10, o que nos levou a projetar uma versão melhorada do domínio ikk-binding de NEMO. De fato, nemo (44-111) na forma desvinculada é apenas parcialmente dobrado e sofre troca conformaçãol e, portanto, definido para estabilizar a sua estrutura dimérica, bobina enrolada e estabilidade, preservando a afinidade vinculativa para IKKβ. Ao anexar três heptads de sequências de bobina enroladas dimeric e11 ideais no N-and C-termini da proteína, e uma série de mutações de quatro pontos, geramos NEMO-EEAA, uma construção totalmente fraca e dobrada em uma bobina enrolada, que resgatou aafinidade de ligação iKK à faixa de namolanor, como observado para nemo12de comprimento completo . Como vantagem adicional, esperávamos que os adaptadores de bobina enroladas (com base na sequência GCN4) facilitassem a cristalização e, eventualmente, ajudassem na determinação da estrutura de raios-X através da substituição molecular. Adaptadores de bobina enrolada têm sido utilizados da mesma forma para aumentar a estabilidade, melhorar o comportamento da solução e facilitar a cristalização de bobinas enroladas e fragmentos de anticorpos13,14. Nemo-EEAA é facilmente expresso e purificado a partir de células Escherichia. coli com uma tag Histidine cleavable, é solúvel, dobrado em uma bobina enrolada dimérica e estável e é facilmente cristalizada, com difração de 1,9 Å. A presença das regiões ordenadas de bobina enrolada de GCN4 poderia, adicionalmente, ajudar na eliminação dos dados dos cristais da NEMO-EEAA por substituição molecular usando a estrutura conhecida do GCN415.
Dado os resultados obtidos com apo-NEMO-EEAA, acreditamos que os protocolos aqui descritos também podem ser aplicados à cristalização da NEMO-EEAA na presença de pequenos peptídeos (como o peptídeo NBD) ou inibidores de pequenas moléculas, com o objetivo de compreender os requisitos para a inibição nemo e otimização baseada em estrutura de inibidores de chumbo iniciais para alta afinidade. Dada a plasticidade e a natureza dinâmica de muitos domínios de bobina enrolada16,o uso dos adaptadores de bobina enrolada poderia encontrar aplicabilidade mais geral para ajudar a determinação estrutural.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

Nemo é uma proteína de andaimes que desempenha um papel essencial na via NF-κB através da montagem do complexo IKK com as kinases IKKα e IKKβ. Após a ativação, o complexo ikk fosforiatos as moléculas IκB levando a NF-κB translocação nuclear e ativação de genes-alvo. A inibição da interação NEMO/IKK é um paradigma terapêutico atraente para a modulação da atividade da via NF-κB, tornando a NEMO um alvo para o design e descoberta de inibidores. Para facilitar o processo de descoberta e otimização de inibidores nemo, projetamos uma construção melhorada do domínio ikk-binding da NEMO que permitiria a determinação da estrutura da proteína na forma de apo e, embora vinculado a pequenos inibidores de peso molecular. Aqui, apresentamos a estratégia utilizada para a concepção, expressão e caracterização estrutural do domínio ikk-binding da NEMO. A proteína é expressa em células De. coli, solubilizada em condições de desnajantes e purificada através de três etapas cromatográficas. Discutimos os protocolos de obtenção de cristais para determinação da estrutura e descrevemos estratégias de aquisição e análise de dados. Os protocolos encontrarão ampla aplicabilidade à determinação da estrutura de complexos de NEMO e inibidores de pequenas moléculas.

Clonagem, expressão e purificação do domínio ikk-obrigatório da NEMO. O protocolo seguiu neste estudo para obter a seqüência final de NEMO-EEAA (Figura 1A), que produziu cristais de qualidade de difração, envolveu a expressão e caracterização de todas as construções intermediárias, incluindo a adição dos adaptadores de bobina enrolada em N- e ou C-terminus, as mutações C76A, C95S e as mutações E56A, E57A. A Figura...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Este protocolo facilita a determinação bem-sucedida da estrutura do domínio vinculante IKK do NEMO, em sua forma desvinculada. E detalhes de sua produção e cristalização. O protocolo, aproveita esta estabilização da confirmação nativa do fragmento de domínio de vinculação IKK do NEMO, através de adaptadores de bobinas enroladas, que facilitam a cristalização e a determinação da estrutura.A biologia estrutural do NEMO, como alvo, proporciona uma importante vantagem no desenvolvimento de inibidores de NEMO para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes e câncer. Este protocolo pode ser estendido à determinação estrutural de complexos NEMO, com inibidores de peptídeos ou pequenas moléculas para descoberta ou otimização de drogas. O remapeamento e concentração de proteínas, durante a fase de produção de proteínas, são fundamentais para a obtenção de um dimer NEMO puro.Limitar a agregação e garantir a solubilidade em condições de cristalização. Demonstrando os procedimentos estarão Tamar e Amy, estudantes de pós-graduação em nosso laboratório. Comece adicionando 20 mililitros de solução de caldo fantástico.E 20 microlitres de uma solução de estoque de 100 mililínitos por mililitro de ampicillina. Para um frasco de 125 mililitros Erlenmeyer. Seguido por alguns microliters de estoque de glicerol celular, a partir de 80 graus Celsius de armazenamento, de células competentes BL21DE3.Transformado com vetor. Depois de agitar a cultura inicial durante a noite, a 37 graus Celsius e 220 rotações por minuto, diluir as células para um OD600 de 0,1 e 250 mililitros de caldo fantástico. E adicione ampicilina a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro.Quando o OD600 da cultura atingir 0,8 a 1, adicione iPTG à cultura, a uma concentração de 500 micromolares. E crescer as células por quatro horas, a 37 graus Celsius, até que o OD600 atinja de 6 a 10. No final da incubação, sedimente as células por centrifugação.E suspenda a pelota em 40 mililitros de tampão de lise. Divida as células re-suspensas em duas alíquotas de 20 a 25 mililitros. E use uma prensa francesa para aplicar aproximadamente 25.000 libras por polegada quadrada de pressão nas células, duas a três vezes por alíquota, em uma sala fria.Em seguida, adicione ureia aos lises celulares, a uma concentração final de oito molares. E incubar a solução celular em uma plataforma de balanço por duas a 16 horas, em temperatura ambiente. Na manhã seguinte, transfira os lises para tubos ultra-centrífugas, para pelo menos três quartos cheios, por tubo.E ulrta centrifugar os lises, por 45 minutos. Decante os supernantes em um tubo cônico de 50 mililitros. E carregue a supernasa incubada em uma coluna IMAC, a três mililitros por minuto.Quando todo o supernaspetivo tiver passado pela coluna, lave a coluna por volumes de 10 colunas, com tampão de ligação, a três mililitros por minuto. E realizar a elução gradiente da proteína NEMO-EEEA de 10 a 500 milimidazol, sobre um gradiente de volume de 12 colunas. Coletando uma alíquota mililitro do eluado, em uma placa de coleta de fração.Após a análise da página da SDS, puxe as frações contendo a proteína alvo pura e meça a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford, de acordo com o protocolo padrão. Selecione as frações iludidas, contendo proteína. Para cortar a etiqueta HIS6 e remover o excesso de imidazol da amostra, adicione protease TEV, em uma razão de peso de um a 10, de proteína tev cortada, à amostra de proteína alvo.E dilatar a amostra durante a noite em quatro litros de tris mililitros. 150 mililitros de sódio e duas soluçãos de DTT mililitro. Na manhã seguinte, carregue a amostra TEV-EEEA, em uma segunda coluna IMAC, a um mililitro por minuto.Coletando o fluxo através de uma fração de mililitro, em uma placa de coleta de fração de tigela 96. Lave a coluna com cinco volumes de Tris de 20 mililitros, 150 mililitros de sódio e 10 milimidazol, a um mililitro por minuto. Após a última lavagem, elute o TEV e tios HIS6 NEMO-EEAA, com três volumes de coluna de 20 mililitros Tris, 150 mililitros de sódio, 500 milimilas imidazol e duas soluçãos de DTT mililitro, em um frasco de 50 mililitros.Puxe o fluxo através de frações, contendo construção NEMO-EEEA rachada e concentre a amostra com um concentrador de células mexidas, para cinco mililitros. Após a diálise durante a noite, como demonstrado, carregue cinco mililitros da amostra em 16 milímetros por colunas de cromatografia de exclusão de tamanho de 60 centímetros. Repetindo conforme necessário, de acordo com o volume da amostra.A um mililitro por minuto, e a dois Tris mililitros, 100 mililitros de sódio e duas soluçãos de DDT mililitros. Após puxar as frações, correspondentes ao DIMERIC NEMO-EEEA, concentre a amostra no concentrador celular agitado, com um peso molecular cortado membrana de três kilodalton, para uma concentração final de 113 micromolar. Em seguida, alíquotar a proteína para armazenamento a quatro graus Celsius, por até um mês.Para triagem matricial esparsa, adicione 60 microliters de solução matricial esparsa em cada um dos 96 poços de uma placa de cristalização de câmara de duas gotas. Para sentar e soltar difusão de vapor. E adicione a solução de proteína a um setter robótico.Em seguida, use um setter robótico, para distribuir 100 nanoliters de solução proteica a 1,65 miligramas por mililitro, em uma proporção de um para um com solução de reservatório em queda um, para um volume final de 200 nanoliters. E adicionar 66 nanoliters de solução proteica com 134 nanoliters de solução de reservatório, a um volume final de 200 nanoliters em queda dois. Em seguida, sele imediatamente a placa com fita de vedação de três polegadas de largura.Em seguida, armazene as bandejas em um armazenamento de imagens cristalizadores, a 20 graus Celsius. Verificando as imagens coletadas automaticamente, para a presença de cristais, começando dois dias após o armazenamento das placas. Para geração de sementes, transfira toda a gota contendo o cristal de interesse, em 50 microliters de solução de condição de cristalização, no frasco fornecido, a partir de um kit de geração de sementes.E vórtice o estoque de sementes, com 20 segundos de pulsação e 10 segundos de descanso, por três minutos. Então, diluir em série o estoque de sementes, em um a 10 incrementos, para um a 10.000. E armazene as diluições a quatro graus Celsius, até usar mais.Um a dois dias antes do embarque para síncrotron, corte a fita do topo do poço, com o cristal de juros. E adicione 0,5 microliters de solução de cristalização contendo 12%um, dois propanos DiO crioprotetor, diretamente ao poço. Desaloja suavemente o cristal com um laço criogeno.Enrole o cristal do poço, e armazene o cristal contendo loop crio em um disco imerso em nitrogênio líquido, até o envio para difração de raios-X. Depois de receber os dados de difração de raios-X, processe as intensidades dimensionadas no servidor STAR e ISO. Usando uma indexação de cristalografia de raios-X cortada média, de 1,2 para a superfície limite de difração para os dados.E carregue em Phoenix. Para determinar a estrutura, use a estrutura de raios-X do GCN4 como modelo de busca para substituição molecular, usando MRage em Phoenix. A estrutura 4DMD será definida como um conjunto.E a solução MRage será construída com sucesso para a parte da estrutura, correspondendo ao adaptador de bobina coiled do terminal final do NEMO-EEEA. para o modelo de pesquisa, para ambas as cadeias no dimer. A proteína sobre expressa aparece em uma banda, com aproximadamente 14 kilodalton marcador de peso molecular, antes da primeira purificação da coluna IMAC.E exibe uma banda monômera e uma banda mais fraca, aos 14 e 28 kilodaltons, respectivamente, após a primeira eluição. O decote TEV está praticamente completo, seguindo a elução, através da segunda coluna IMAC. Quase inteiramente como um mais escuro, com o peso molecular esperado.Cromatografia de exclusão de tamanho, exibe um único pico, iludindo entre 60 a 65 mililitros, que estão respondendo ao estonteante. A triagem fina produz cristais que podem ser utilizados para produzir um estoque de sementes para a produção de cristais NEMO-EEEA, para coleta de dados. Aqui, são mostrados os perfis de difração de cristais nemo-EEEA representativos.A análise estrutural da proteína NEMO-EEEA revela uma bobina paralela irregular homodimerica, aproximadamente 175 angstroms de comprimento. A região regular da bobina enrolada abrange a sequência ideal do adaptador de bobina enrolada, no final do cupinus. E os dois primeiros heptads da sequência adequada nemo.Uma bobina enrolada regular, também está presente no cupinus C. Começando pelo resíduo NEMO 97 e abrangendo o adaptador ideal de bobina do terminal C. A estrutura beta vinculada do IKK exibe uma confirmação de bobina enrolada mais aberta, para acomodar o ligante.Com um espaçamento interélico maior por 1 a 2,2 angstroms nesta região. A estrutura de um ligante em NEMO, oferece um novo alvo para o design de inibidores através de métodos computacionais. E para a triagem visual de bolsos de ligação com pequenas bibliotecas de moléculas.Agora temos um caminho para cristalização da construção de NEMO projetada em complexo com ligantes de moléculas pequenas. Para ajudar no desenvolvimento e otimização de uma nova classe de inibidores.

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

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Bioquímica

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

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