Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Мы благодарим профессора Д. Мэддена за многочисленные полезные дискуссии на протяжении всего проекта. Мы благодарим профессора Д. Болона за дар плазмиды, содержащей оптимизированную катушки GCN4. Мы благодарим доктора Б. Го за плазмиды NEMO. Мы благодарим Кристину Р. Арнольди, Тамар Басиашвили и Эми Кеннеди за демонстрацию процедуры. Мы благодарим БиоМТ Кристаллография Основной фонд и кафедры химии и биохимии и клеточной биологии в Дартмуте за использование кристаллографического оборудования и персонала BioMT за их поддержку. В этом исследовании использовалась линия луча AMX Национального синхротронного источника света II, Управления министерства энергетики США (DOE) Управления научных пользователей, работаемого для Управления науки Министерства энергетики США По линии Брукхейвенской национальной лаборатории по контракту No. ДЕ-SC0012704. Мы благодарим сотрудников NSLS II за их поддержку. Эта работа была профинансирована грантами NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 и P20GM1131332, а также грантом Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

1. Конструкция конструкции для кристаллографии
<ol><li>Клон последовательность NEMO-EEAA, как и в предыдущей публикации12 в векторе для выражения в кишечной палочке с помощью промоутера T7, в том числе N-терминал hexa-гистидин теги и протеазы расщепления сайта. ПРИМЕЧАНИЕ: В это...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Попытки кристаллизации NEMO в несвязанной форме оказались безуспешными, включая попытки использования полноформатного белка и несколько конструкций усечения, охватывающих область, связывающую IKK. Наша биофизическая характеристика МКК-связывающей области NEMO (остатки 44-111) круговой дихр...

Путь НФ-ЗБ активируется в ответ на различные стимулы, включая цитокины, микробные продукты и стресс, для регулирования экспрессии генов-мишеней, ответственных за воспалительный и иммунный ответ, гибель клеток или выживание и пролиферацию1. Патологии, включая воспалительные и аутоиммунные заболевания и рак2,3,4,5 были коррелированы с гиперактивацией пути, что сделало модуляцию деятельности NF-QB основной мишенью для разработки новых методов лечения6,7.
Канонический путь NF-QB, в частности, отличается от неканонического пути, ответственного за лимфорганогенез и активацию В-клеток, зависимостью первого от леса белка NEMO (NF-QB основной модулятор8) для сборки IKK-комплекса с кининами IKK и IKK. Комплекс IKK отвечает за фосфорилирование ИЗБЗ (ингибитор ЗВ), который нацелен на деградацию, освобождая димеры NF-qB для перемещения в ядро для транскрипциигенов 1 ЗЗ и, следовательно, является привлекательной мишенью для развития ингибиторов для модулирования активности NF-B.
Наше исследование фокусируется на характеристике белково-белкового взаимодействия между NEMO и IKK, ориентированной на NEMO для разработки малых молекул ингибиторов формирования комплекса IKK. Минимальная связывающая область NEMO, необходимая для связывания ИККЗ, включает в себя остатки 44-111, и его структура была определена в комплексе с пептидом, соответствующим последовательности IKK 701-7459. NEMO и IKK' образуют четырехсепарок, где NEMO dimer вмещает два сипов IKK (701-745) в удлиненный открытый паз с расширенным интерфейсом взаимодействия. IkK (734-742), также известный как NEMO-обязательный домен (NBD), определяет наиболее важную горячую точку для связывания, где два основных триптофанов (739 741) хоронят глубоко в кармане NEMO. Детали сложной структуры могут помочь в структуре на основе проектирования и оптимизации малых ингибиторов молекулы ориентации NEMO. В то же время, трудно, что связывание небольшой молекулы или пептида воссоздало бы в NEMO полное конформивное изменение (т.е. обширное открытие dimer с коритой сутышки NEMO), вызванное связыванием длинной IKK (701-745), как наблюдается в кристалле, и структура несвязанной NEMO или NEMO, связанной с небольшим ингибитором молекулы, может представлять собой лучшую структуру ингибирования.
Полноформатные NEMO и более мелкие конструкции усечения, охватывающие область IKK-связывания, оказались неразрешимыми для определения структуры в несвязанной форме с помощью рентгеновской кристаллографии и методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР)10, что побудило нас разработать улучшенную версию обязательной области NEMO. Действительно, NEMO (44-111) в несвязанной форме лишь частично сложен и претерпевает конформационный обмен, и поэтому мы намерены стабилизировать его димерную структуру, складку свернутой катушки и стабильность, сохраняя при этом связывающее сродство к IkK. Путем связывать 3 heptads идеально dimeric coiled-coil последовательностей11 на N-и C-termini протеина, и серии 4 перегласовок пункта, мы произвели NEMO-EEAA, конструкцию полно dimeric и сложенную в свернутой катушке, которая спасла IKK-связывающе сродство к наномолярному диапазону как наблюдаемое для полной длины NEMO12. В качестве дополнительного преимущества мы надеялись, что адаптеры с кудрявых катушек (на основе последовательности GCN4) облегчат кристаллизацию и в конечном итоге помогут в определении структуры рентгеновского излучения с помощью молекулярной замены. Сонючие катушка адаптеры были аналогичным образом использованы как для повышения стабильности, улучшить поведение решения и облегчить кристаллизацию для тримерных скудных катушек и фрагментов антител13,14. NEMO-EEAA легко выражается и очищается от клеток Escherichia. coli с размытым тегом гистидина, растворяется, сложен в стабильную тусклую свернутую катушки и легко кристаллизуется, с дифракцией до 1,9 евро. Наличие упорядоченных спиральных катушек регионов GCN4 может дополнительно помочь в постепенном использовании данных из кристаллов NEMO-EEAA путем молекулярной замены с использованием известной структуры GCN415.
Учитывая результаты, полученные с apo-NEMO-EEAA, мы считаем, что описанные здесь протоколы также могут быть применены к кристаллизации NEMO-EEAA в присутствии небольших пептидов (например, пептида NBD) или малых ингибиторов молекулы, с целью понимания требований к ингибированию NEMO и структурной оптимизации первоначальных ингибиторов свинца к высокой сродости. Учитывая пластичность и динамичный характер многих доменов скудной катушки16,использование смоченной катушки адаптеры могли бы найти более общую применимость в оказании помощи структурного определения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO – это белок, который играет важную роль на пути NF-ЗБ, собирая IKK-комплекс с киназами IKK и IKK. После активации комплекс IKK фосфорилатирует молекулы I'B, ведущие к ядерной транслокации NF-'B и активации генов-мишеней. Ингибирование взаимодействия NEMO/IKK является привлекательной терапевтической парадигмой для модуляции активности пути NF-ЗВ, что делает NEMO мишенью для проектирования и открытия ингибиторов. Чтобы облегчить процесс обнаружения и оптимизации ингибиторов NEMO, мы разработали улучшенную конструкцию связывающей области NEMO, которая позволила бы определить структуру белка в форме апо и при этом привязанных к небольшим молекулярным ингибитогам веса. Здесь мы представляем стратегию, используемую для проектирования, выражения и структурной характеристики мкноэ, имеющей обязательную область NEMO. Белок выражается в клетках кишечной палочки, растворяется в условиях денатурирования и очищается через три хроматографических шага. Мы обсуждаем протоколы получения кристаллов для определения структуры и описываем стратегии сбора и анализа данных. Протоколы найдут широкое применимость к структурному определению комплексов ИНГибиторов NEMO и малых молекул.

Клонирование, выражение и очищение связывающей области NEMO, имеющей обязательную iKK. Протокол, последовавший в этом исследовании, чтобы получить окончательную последовательность NEMO-EEAA(Рисунок 1A), который произвел дифракционные кристаллы качества, уч...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Мы описываем протоколы для определения структуры IKK-обязательной области NEMO с помощью рентгеновской кристаллографии. Методы включают экспрессию белка, очищение и характеристику, а также стратегии успешной оптимизации кристалла и определения структуры белка в его несвязанной форме.

Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Этот протокол облегчает успешное определение структуры обязательной области NEMO IKK в ее несвязавом виде. И подробности его производства и кристаллизации. Протокол, использует эту стабилизацию родного подтверждения обязательного фрагмента домена IKK NEMO, через катушки катушки адаптеры, которые облегчают кристаллизацию и определение структуры.Структурная биология NEMO, как мишень, обеспечивает важное преимущество в развитии ингибиторов NEMO для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний и рака. Этот протокол может быть распространен на определение структуры комплексов NEMO, с пептидными или небольшими ингибиторами молекул для обнаружения или оптимизации лекарств. Рефолдирование и концентрация белка на этапе производства белка имеют основополагающее значение для получения чистого димера NEMO.Ограничение агрегации и обеспечение солуства в условиях кристаллизации. Демонстрацией процедур будут Тамар и Эми, аспиранты нашей лаборатории. Начните с добавления 20 миллилитров потрясающего раствора бульона.И 20 микролитров 100 миллиграмма на миллилитр стокового раствора ампициллина. К колбе 125 миллилитров Эрленмайера. Затем несколько микролитров запасов глицерола клеток, от 80 градусов по Цельсию хранения, BL21DE3 компетентных клеток.Преобразовано с вектором. После встряхивания стартер культуры на ночь, при 37 градусов по Цельсию и 220 вращений в минуту, разбавить клетки OD600 из 0,1 и 250 миллилитров потрясающий бульон. И добавить ампициллин к окончательной концентрации 100 микрограмм на миллилитр.Когда OD600 культуры достигает 0,8 к 1, добавьте IPTG к культуре, к концентрации 500 микромолеров. И расти клетки в течение четырех часов, при 37 градусов по Цельсию, пока OD600 достигает 6 до 10. В конце инкубации осадок клеток центрифугации.И повторно приостановить гранулы в 40 миллилитров буфера лиза. Разделите повторно приостановленные ячейки на две алициты от 20 до 25 миллилитров. И используйте французскую прессу, чтобы применить около 25 000 фунтов на квадратный дюйм давления на клетки, два-три раза на алицит, в холодной комнате.Затем добавьте мочевину в лисаты клетки, к конечной концентрации восьми молар. И инкубировать клеточный раствор на качалке платформы в течение двух-шести часов, при комнатной температуре. На следующее утро перенесите лисаты в ультра-центрифуговые трубки, по крайней мере, до трех четвертей на одну трубку.И улрта центрифуга лисаты, в течение 45 минут. Декант supernatants в 50 миллилитров конической трубки. И загрузите инкубированный супернатант мочевины на столбец IMAC, со счетом 3 миллилитров в минуту.Когда весь супернатант проехав через столбец, вымойте столбец на 10 томов столбца, с связывающим буфером, по три миллилитров в минуту. И выполнить градиент elution белка NEMO-EEAA от 10 до 500 миллимолейных имидазолов, в течение 12 градиента объема столбца. Сбор одного миллилитра aliquots eluate, в пластину сбора фракций.После анализа страницы SDS, потяните фракции, содержащие чистый целевой белок и измерить концентрацию белка Брэдфорд анализа, в соответствии со стандартным протоколом. Выберите ускользаемые фракции, содержащие белок. Чтобы расщепить тег HIS6 и удалить избыток имидазола из образца, добавьте протеазу TEV, при соотношении веса от одного до 10, расщепленного белка TEV, в образец целевого белка.И расширить образец на ночь в четырех литрах 20 миллимолейных Трис. 150 миллимолярд хлорида натрия и два миллимолярского раствора DTT. На следующее утро загрузите образец NEMO-EEAA на вторую колонку IMAC со счетом 1 миллилитр в минуту.Сбор потока через в один миллилитр фракций, в 96 чаши фракции сбора пластины. Вымойте колонку пятью томами 20 миллимолярной трис, 150 миллимолярный хлорид натрия и 10 миллимолярный раствор имидазола, на один миллилитр в минуту. После последней стирки, elute TEV и uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, с тремя томами колонки 20 миллимолярной Трис, 150 миллимолярный хлорид натрия, 500 миллимолярный имидазол и два миллимолярной DTT решение, в 50 миллилитровую колбу.Потяните поток через фракции, содержащие расщепленную конструкцию NEMO-EEAA и сконцентрировать образец с концентратором перемешивают клетки, до пяти миллилитров. После ночного диализа, как было продемонстрировано, загрузите пять миллилитров образца на 16 миллиметров на 60 сантиметров размером с хроматографические столбцы. Повторение по мере необходимости, в зависимости от объема выборки.На один миллилитр в минуту, и на два миллимолярные три, 100 миллимолярный хлорид натрия и два миллимолярных раствора ДДТ. Потянув фракции, соответствующие димерик NEMO-EEAA, концентрируют образец в концентраторе перемешиваемой клетки, с молекулярным весом, отрезанным мембраной в три килодалтона, до конечной концентрации 113 микромолей. Затем, aliquot белка для хранения при четырех градусах по Цельсию, на срок до одного месяца.Для разреженного матричного скрининга добавьте 60 микролитров разреженного матричного раствора в каждую из 96 скважин из двух капельной камеры кристаллизации пластины. Для сидеть и падение пара диффузии. И добавьте белковый раствор в роботизированный капельный сеттер.Далее используйте роботизированный капельный сеттер, чтобы распределить 100 нанолитров белкового раствора на 1,65 миллиграмма на миллилитр, в соотношении один к одному с раствором резервуара в капле один, до конечного объема 200 нанолитров. И добавьте 66 нанолитров белкового раствора со 134 нанолитров раствора резервуара, к окончательному объему 200 нанолитров в капле два. Затем немедленно запечатать пластину с трех дюймов широкой запечатывания ленты.Затем храните лотки в хранилище изображений кристаллизации при 20 градусах по Цельсию. Проверка изображений, собранных автоматически, на наличие кристаллов, начиная через два дня после хранения пластин. Для генерации семян, передать всю каплю, содержащую кристалл интереса, в 50 микролитров кристаллизации состояние раствора, в предоставленном флаконе, из комплекта поколения семян.И вихрь семенного запаса, с 20 секунд пульсации и 10 секунд отдыха, в течение трех минут. Затем, последовательно разбавить семенной запас, в один-пять шагом, вплоть до одного до 10000. И хранить разбавления при четырех градусах по Цельсию, до дальнейшего использования.За один-два дня до отгрузки синхротрона, вырезать ленту из верхней части хорошо, с кристаллом интереса. И добавьте 0,5 микролитров раствора кристаллизации, содержащего 12%, два пропана ДиО криопротектор, непосредственно к колодец. Аккуратно выбить кристалл с крио петли.Петля кристалла из хорошо, и хранить кристалл, содержащий крио петли в шайбу погружается в жидкий азот, до отгрузки для рентгеновского дифракции. После получения рентгеновских данных дифракции обработать масштабируемые интенсивности на сервере STAR и ISO. Использование рентгеновской кристаллографии индексации отрезал среднее, 1,2 для дифракции предел поверхности для данных.И загрузите Феникс. Чтобы определить структуру, используйте рентгеновую структуру GCN4 в качестве модели поиска молекулярной замены, используя MRage в Фениксе. Структура 4DMD, будет определена как ансамбль.И решение MRage будет успешно строить на структуру часть, соответствующая конечной терминал спиральный катушки адаптер NEMO-EEAA. к модели поиска, для обеих цепей в димере. Более выраженный белок появляется в полосе, примерно на 14 килодальтон молекулярном маркере веса, до первой очистки колонки IMAC.И отображает мономерную полосу и более уменьшение полосы, на 14 и 28 килодалтонов, соответственно, после первого elution. Расщепление TEV практически завершено, следуя за элюционом, через вторую колонку IMAC. Почти полностью как димер, при ожидаемом молекулярном весе.Размер исключение хроматографии, отображает один пик, ускользая от 60 до 65 миллилитров, которые реагируют на димер. Тонкий скрининг производит кристаллы, которые могут быть использованы для производства семенного запаса для производства кристаллов NEMO-EEAA, для сбора данных. Здесь показаны репрезентативные профили дифракции кристаллов NEMO-EEAA.Структурный анализ белка NEMO-EEAA, показывает гомодимерные нерегулярные параллельные спиральные катушки, примерно 175 ангстремов в длину. Регулярная область спиральной катушки, включает в себя идеальную последовательность адаптера спиральной катушки, в конце срока. И первые два гептада надлежащей последовательности NEMO.Регулярные спиральный катушки, также присутствует на C терминуса. Начиная с остатка NEMO 97 и охватывая терминал C идеальный катушки катушки адаптер. Бета-структура IKK, отображает более открытое подтверждение спиральной катушки, для размещения лиганда.С большим межгелийский интервал от одного до 2,2 ангстремов в этом регионе. Структура лиганда в NEMO, предлагает новую цель для разработки ингибиторов с помощью вычислительных методов. И для визуального скрининга связывающих карманов с небольшими молекулами библиотек.Теперь у нас есть путь для кристаллизации спроектированной конструкции NEMO в комплексе с небольшими лигандами молекул. Помочь в разработке и оптимизации нового класса ингибиторов.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Производство, Кристаллизация и структура Определение<em&gt; C. несговорчивый</em&gt; PPEP-1 с помощью Microseeding и цинк-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Определение содержания гликогена в цианобактериях

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Руководство по продукции, кристаллизации и определения структуры человеческого IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Иммунизации альпаки (лама pacos) с белков антигенов и производства антиген специфические антитела одного домена

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...