Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Agradecemos al Profesor D. Madden, por muchas discusiones útiles a lo largo de este proyecto. Agradecemos al profesor D. Bolon por el regalo del plásmido que contiene la bobina enrollada GCN4 optimizada. Agradecemos al Dr. B. Guo por los plásmidos NEMO. Agradecemos a Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili y Amy E. Kennedy por demostrar el procedimiento. Agradecemos a la Instalación Básica de Cristalografía BioMT y a los departamentos de Química y De Bioquímica y Biología Celular de Dartmouth por el uso del equipo de cristalografía y el personal de BioMT por su apoyo. Esta investigación utilizó la línea de haz AMX de la National Synchrotron Light Source II, una Oficina de Usuarios de Ciencias del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704. Agradecemos al personal de NSLS II por su apoyo. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 y P20GM113132, y una subvención Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

1. Diseño de la construcción para cristalografía
<ol><li>Clonar la secuencia de NEMO-EEAA como en la publicación anterior12 en un vector para la expresión en E. coli utilizando el promotor T7, incluyendo una etiqueta de hexa-histidina N-terminal y un sitio de escisión de proteasa. NOTA: En este protocolo, utilizamos un vector modificado para incluir una etiqueta N-terminal hexa-histidina y un sitio de escote del Virus etch del Tabaco (TEV)10. Este vector...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. 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F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. 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R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. 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S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Los intentos de cristalización de NEMO en forma no enlazada no tuvieron éxito, incluidos los intentos de usar la proteína de longitud completa y varias construcciones de truncamiento que abarcan el dominio de unión IKK. Nuestra caracterización biofísica del dominio iKK-unión de NEMO (residuos 44-111) por dicroísmo circular, espectroscopia de RMN y anisotropía de fluorescencia indicó que la construcción, aunque capaz de unir IKK, existía en un estado de intercambio conformación, no adecuado para la cristaliza...

La vía NF-B se activa en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, productos microbianos y estrés, para regular la expresión de genes diana responsables de la respuesta inflamatoria e inmunitaria, la muerte celular o la supervivencia y proliferación1. Patologías incluyendo enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer2,3,4,5 se han correlacionado con la hiperactivación de la vía, que ha hecho de la modulación de la actividad NF-B un objetivo principal para el desarrollo de nuevas terapias6,7.
La vía canónica NF-B, en particular, se distingue de la vía no canónica, responsable de la linfoorganogénesis y la activación de las células B, por la dependencia de la primera de la proteína de andamios NEMO (modulador esencial NF-B8) para el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. El complejo IKK es responsable de la fosforilación de I-B (inhibidor de la B) que se dirige a su degradación, liberando los dimers NF-B para translocar se translocando al núcleo para la transcripción génica1 y por lo tanto es un objetivo atractivo para el desarrollo de inhibidores para modular la actividad NF-B.
Nuestra investigación se centra en la caracterización de la interacción proteína-proteína entre NEMO e IKK, dirigida a NEMO para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de formación compleja IKK. El dominio de unión mínimo de NEMO, necesario para unir IKK, abarca los residuos 44-111, y su estructura se ha determinado en complejo con un péptido correspondiente a la secuencia 701-7459de IKK. NEMO e IKK forman un paquete de cuatro hélices donde el dimer NEMO acomoda los dos hélices de IKK(701-745) en una ranura abierta alargada con una interfaz de interacción extendida. IKK-(734-742), también conocido como el dominio de unión NEMO (NBD), define el punto caliente más importante para la unión, donde los dos triptófanos esenciales (739,741) entierran profundamente dentro del bolsillo nemo. Los detalles de la estructura compleja pueden ayudar en el diseño basado en la estructura y la optimización de pequeños inhibidores de moléculas dirigidos a NEMO. Al mismo tiempo, es difícil que la unión de una molécula pequeña o péptido recree en NEMO el cambio de conformación completo (es decir, la apertura extensiva del dimer de bobina enrollada NEMO) causada por la unión de la larga IKK(701-745), como se observa en el cristal, y la estructura de NEMO o NEMO unido a un inhibidor de molécula pequeña puede representar un mejor objetivo para el diseño de fármacos basados en la estructura y la optimización de inhibidores.
Nemo de longitud completa y construcciones de truncamiento más pequeñas que abarcan el dominio de unión IKK han demostrado ser intratables para la determinación de la estructura en la forma no enlazada a través de los métodos10de cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (NMR), lo que nos llevó a diseñar una versión mejorada del dominio de unión IKK de NEMO. De hecho, NEMO (44-111) en forma no enlazada sólo está parcialmente plegado y se somete a un intercambio conformación y, por lo tanto, nos fijamos para estabilizar su estructura dimerica, pliegue de bobina enrollada y estabilidad, preservando al mismo tiempo la afinidad de unión para IKK. Al anexar tres heptads de secuencias de bobinas enrolladas dimíricas ideales11 en el N-y C-termini de la proteína, y una serie de mutaciones de cuatro puntos, generamos NEMO-EEAA, una construcción totalmente dimerica y doblada en una bobina enrollada, que rescató la afinidad de unión IKK al rango nanomolar como se observó para la longitud completa de NEMO12. Como ventaja adicional, esperábamos que los adaptadores de bobina enrollada (basados en la secuencia GCN4) facilitarían la cristalización y eventualmente ayudarían en la determinación de la estructura de rayos X a través del reemplazo molecular. Los adaptadores de bobina enrollada se han utilizado de manera similar para aumentar la estabilidad, mejorar el comportamiento de la solución y facilitar la cristalización de bobinas recortadas y fragmentos de anticuerpos13,14. NEMO-EEAA se expresa y purifica fácilmente a partir de células de Escherichia. coli con una etiqueta de Histidina escleable, es soluble, doblado en una bobina de bobinado tenue estable y se cristaliza fácilmente, con difracción a 1,9o. La presencia de las regiones ordenadas de bobinas enrolladas de GCN4 podría ayudar adicionalmente a la eliminación gradual de los datos de los cristales de NEMO-EEAA mediante reemplazo molecular utilizando la estructura conocida de GCN415.
Dados los resultados obtenidos con apo-NEMO-EEAA, creemos que los protocolos descritos aquí también podrían aplicarse a la cristalización de NEMO-EEAA en presencia de pequeños péptidos (como el péptido NBD) o inhibidores de moléculas pequeñas, con el objetivo de comprender los requisitos para la inhibición de NEMO y la optimización basada en la estructura de los inhibidores iniciales de plomo a alta afinidad. Dada la plasticidad y la naturaleza dinámica de muchos dominios de bobina sin bobina16,el uso de los adaptadores de bobina enrollada podría encontrar una aplicabilidad más general para ayudar a la determinación estructural.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO es una proteína de andamiaje que desempeña un papel esencial en la vía NF-B mediante el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. Tras la activación, el complejo IKK fosforila las moléculas de I-B que conducen a la translocación nuclear NF-B y a la activación de genes diana. La inhibición de la interacción NEMO/IKK es un paradigma terapéutico atractivo para la modulación de la actividad de la vía NF-B, haciendo de NEMO un objetivo para el diseño y el descubrimiento de inhibidores. Para facilitar el proceso de descubrimiento y optimización de los inhibidores NEMO, diseñamos una construcción mejorada del dominio de unión IKK de NEMO que permitiría la determinación de la estructura de la proteína en forma de apo y mientras se unía a inhibidores de peso molecular pequeño. Aquí presentamos la estrategia utilizada para el diseño, expresión y caracterización estructural del dominio de enlace IKK de NEMO. La proteína se expresa en células de E. coli, solubilizadas en condiciones de desnaturalización y purificadas a través de tres pasos cromatográficos. Discutimos los protocolos para la obtención de cristales para la determinación de la estructura y describimos las estrategias de adquisición y análisis de datos. Los protocolos encontrarán una amplia aplicabilidad a la determinación de la estructura de los complejos de NEMO y los inhibidores de moléculas pequeñas.

Clonación, expresión y purificación del dominio iKK vinculante de NEMO. El protocolo seguido en este estudio para obtener la secuencia final de NEMO-EEAA(Figura 1A),que produjo cristales de calidad de difracción, implicó la expresión y caracterización de todas las construcciones intermedias, incluyendo la adición de los adaptadores de bobina enrollada en N- y C-terminus, las mutaciones C76A, C95S y las mutaciones E56A, E57A. L...

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Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Este protocolo facilita la determinación satisfactoria de la estructura del dominio vinculante IKK de NEMO, en su forma no enlazada. Y detalles de su producción y cristalización. El protocolo, aprovecha esta estabilización de la confirmación nativa del fragmento de dominio de unión IKK de NEMO, a través de adaptadores de bobina enrollada, que facilitan la cristalización y la determinación de la estructura.La biología estructural de NEMO, como objetivo, proporciona una ventaja importante en el desarrollo de inhibidores de la NEMO para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer. Este protocolo puede extenderse a la determinación de la estructura de los complejos NEMO, con inhibidores de péptidos o moléculas pequeñas para el descubrimiento u optimización de fármacos. El plevolco proteico y la concentración, durante la etapa de producción de proteínas, son fundamentales para obtener un dimer NEMO puro.Limitar la agregación y garantizar la solubilidad en condiciones de cristalización. Demostrando los procedimientos serán Tamar y Amy, estudiantes graduados en nuestro laboratorio. Comience agregando 20 mililitros de excelente solución de caldo.Y 20 microlitros de una solución de 100 miligramos por mililitro de ampicilina. A un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Seguido por unos microlitros de población de glicerol celular, de 80 grados Celsius almacenamiento, de células competentes BL21DE3.Transformado con vector. Después de agitar el cultivo de arranque durante la noche, a 37 grados centígrados y 220 rotaciones por minuto, diluir las células a un OD600 de 0,1 y 250 mililitros de caldo excelente. Y añadir ampicilina a una concentración final de 100 microgramos por mililitro.Cuando la OD600 del cultivo alcance 0,8 a 1, agregue IPTG al cultivo, a una concentración de 500 micromolares. Y hacer crecer las células durante cuatro horas, a 37 grados centígrados, hasta que el OD600 alcance de seis a 10. Al final de la incubación, sedimentar las células por centrifugación.Y re-suspender el pellet en 40 mililitros de tampón de lelisis. Divida las células re-suspendidas en dos alícuotas de 20 a 25 mililitros. Y usa una prensa francesa para aplicar aproximadamente 25.000 libras por pulgada cuadrada de presión a las células, de dos a tres veces por alícuota, en una sala fría.A continuación, agregue urea a los lysates celulares, a una concentración final de ocho molares. E incubar la solución celular en una plataforma de balanceo durante dos a 16 horas, a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, transfiera los lysates a tubos de ultracentrífusión.a por lo menos tres cuartos de lleno, por tubo.Y ulrta centrifugar los lysates.durante 45 minutos. Decantar los sobrenadantes en un tubo cónico de 50 mililitros. Y cargue el sobrenadante incubado por urea en una columna IMAC, a tres mililitros por minuto.Cuando todo el sobrenadante haya corrido a través de la columna, lave la columna para 10 volúmenes de columna, con búfer de enlace, a tres mililitros por minuto. Y realice la elución de gradiente de la proteína NEMO-EEAA de 10 a 500 imidazol milimétrico, sobre un gradiente de volumen de 12 columnas. Recoger un mililitro alícuotas del eluido, en una placa de recogida de fracciones.Después del análisis de página SDS, tire de las fracciones que contienen la proteína objetivo pura y mida la concentración de proteínas por ensayo de Bradford, de acuerdo con el protocolo estándar. Seleccione las fracciones eludidas, que contienen proteínas. Para cortar la etiqueta HIS6 y eliminar el exceso de imidazol de la muestra, agregue TEV proteasa, en una proporción de peso de uno a 10, de proteína cortada TEV, a la muestra de proteína objetivo.Y dilatar la muestra durante la noche en cuatro litros de 20 Tris mililares. Cloruro de sodio de 150 milimolares y dos soluciones de TDT miliamlar. A la mañana siguiente, cargue la muestra NEMO-EEAA cortada TEV, en una segunda columna IMAC, a un mililitro por minuto.Recoger el flujo a través de fracciones de mililitro, en una placa de recolección de fracción de 96 cuencos. Lavar la columna con cinco volúmenes de 20 Tris milimétricos, cloruro de sodio de 150 milimolares y solución de imidazol de 10 milimolar, a un mililitro por minuto. Después del último lavado, eluía el TEV y efiló HIS6 NEMO-EEAA, con tres volúmenes de columna de 20 Tris milimétricos, cloruro de sodio de 150 milivolilares, 500 imidazol milimétrico y dos soluciones de TDT milimiolar, en un matraz de 50 mililitros.Tire del flujo a través de fracciones, que contienen la construcción NEMO-EEAA cortada y concentrar la muestra con un concentrador de células agitadas, a cinco mililitros. Después de la diálisis durante la noche como se ha demostrado, cargue cinco mililitros de la muestra en columnas de cromatografía de exclusión de 16 milímetros por 60 centímetros de tamaño. Repetir según sea necesario, según el volumen de la muestra.A un mililitro por minuto, y a dos Tris milimotoras, cloruro de sodio de 100 milimolar y dos solución de DDT mililolar. Después de tirar de las fracciones, correspondientes al dimerico NEMO-EEAA, concentrar la muestra en el concentrador de células agitadas, con una membrana de corte de peso molecular de tres kilodalton, a una concentración final de 113 micromolares. Luego, aliquot la proteína para el almacenamiento a cuatro grados Celsius, por hasta un mes.Para el cribado de matriz dispersa, agregue 60 microlitros de solución de matriz dispersa en cada uno de los 96 pozos de una placa de cristalización de dos cámaras de caída. Para sentarse y soltar la difusión de vapor. Y añadir la solución proteica a un setter de gota robótica.A continuación, utilice un setter de gota robótica, para dispensar 100 nanolitros de solución proteica a 1,65 miligramos por mililitro, en una proporción de uno a uno con solución de depósito en la gota uno, a un volumen final de 200 nanolitores. Y añadir 66 nanolitros de solución proteica con 134 nanolitros de solución de depósito, a un volumen final de 200 nanolitros en la gota dos. A continuación, selle inmediatamente la placa con cinta adhesiva de tres pulgadas de ancho.A continuación, guarde las bandejas en un almacenamiento de imágenes de cristalización, a 20 grados centígrados. Comprobación de las imágenes recogidas automáticamente, para la presencia de cristales, a partir de dos días después de almacenar las placas. Para la generación de stocks de semillas, transfiera toda la gota que contiene el cristal de interés, en 50 microlitros de solución de condición de cristalización, en el vial proporcionado, de un kit de generación de semillas.Y vórtice el stock de semillas, con 20 segundos de pulsación y 10 segundos de descanso, durante tres minutos. Luego, diluya en serie el stock de semillas, en uno a 10 incrementos, hasta uno a 10.000. Y almacene las diluciones a cuatro grados centígrados, hasta su uso posterior.Uno o dos días antes del envío al sincrotrón, cortar la cinta de la parte superior del pozo, con el cristal de interés. Y añadir 0,5 microlitros de solución de cristalización que contiene 12%uno, dos propano DiO crioprotector, directamente al pozo. Desalojar suavemente el cristal con un bucle crio.Saque el cristal del pozo y almacene el cristal que contiene criodato en un disco sumergido en nitrógeno líquido, hasta el envío para la difracción de rayos X. Después de recibir los datos de difracción de rayos X, procese las intensidades escaladas en el servidor STAR e ISO. Utilizando una indexación de cristalografía de rayos X cortada media, de 1.2 para la superficie límite de difracción para los datos.Y carga sobre Phoenix. Para determinar la estructura, utilice la estructura de rayos X de GCN4 como modelo de búsqueda para el reemplazo molecular, utilizando MRage en Phoenix. La estructura 4DMD, se definirá como un conjunto.Y la solución MRage se construirá con éxito a la parte de la estructura, correspondiente al adaptador de bobina enrollada terminal final de NEMO-EEAA. al modelo de búsqueda, para ambas cadenas en el dimer. La proteína expresada en exceso aparece en una banda, a aproximadamente 14 kilodalton marcador de peso molecular, antes de la primera purificación de la columna IMAC.Y muestra una banda monómero y una banda de dimer, a 14 y 28 kilodaltons, respectivamente, después de la primera elución. El escote TEV está prácticamente completo, siguiendo la elución, a través de la segunda columna IMAC. Casi en su totalidad como un dimer, con el peso molecular esperado.Cromatografía de exclusión de tamaño, muestra un solo pico, eludiendo entre 60 y 65 mililitros, que están respondiendo al dimer. El cribado fino produce cristales que se pueden utilizar para producir un stock de semillas para la producción de cristales NEMO-EEAA, para la recolección de datos. Aquí se muestran los perfiles representativos de difracción de cristales NEMO-EEAA.El análisis estructural de la proteína NEMO-EEAA, revela una bobina espiral en espiral paralela irregular homodímica, de aproximadamente 175 angstroms de longitud. La región regular de bobina enrollada, abarca la secuencia de adaptador de bobina enrollada ideal, en la terminal final. Y los dos primeros heptads de la secuencia apropiada neMO.Una bobina enrollada regular, también está presente en la terminal C. Comenzando en el residuo NEMO 97 y abarcando el terminal C ideal adaptador de bobina enrollada. La estructura encuadernada beta IKK, muestra una confirmación de bobina enrollada más abierta, para acomodar el ligando.Con un mayor espaciado interhelical por uno a 2.2 angstroms en esta región. La estructura de un ligando en NEMO, ofrece un nuevo objetivo para el diseño de inhibidores a través de métodos computacionales. Y para el cribado visual de bolsillos de unión con bibliotecas de moléculas pequeñas.Ahora tenemos un camino para la cristalización de la construcción NEMO diseñada en complejo con ligandos de moléculas pequeñas. Ayudar en el desarrollo y optimización de una nueva clase de inhibidores.

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