Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Vi tackar prof. D. Madden, för många hjälpsamma diskussioner i hela detta projekt. Vi tackar prof. D. Bolon för gåvan av plasmiden som innehåller den optimerade GCN4 lindade spolen. Vi tackar Dr. B. Guo för NEMO plasmider. Vi tackar Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili och Amy E. Kennedy för att demonstrera förfarandet. Vi tackar BioMT kristallografi Core facility och avdelningarna för kemi och biokemi & cell bio logi vid Dartmouth för användning av kristallografi utrustning och BioMT personal för deras stöd. Denna forskning används AMX fd av den nationella Synchrotron ljuskälla II, en US Department of Energy (DOE) Office of Science användaranläggning drivs för DOE Office of Science av Brookhaven National Laboratory under kontrakt nr. DE-SC0012704. Vi tackar Personalen på NSLS II för deras stöd. Detta arbete finansierades av NIH bidrag R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 och P20GM113132, och en Munck-Pfefferkorn roman och interaktiva bidrag.

1. konstruktion av konstruktion för kristallografi
<ol><li>Klona sekvensen av NEMO-EEAA som i föregående publikation12 i en vektor för uttryck i E. coli med T7 promotorn, inklusive en N-Terminal hexa-Histidine tagg och en proteas klyvning webbplats. ANMÄRKNINGAR: i detta protokoll använde vi en vektor modifierad för att inkludera en N-Terminal hexa-Histidine tagg och en tobak etch virus (TEV) klyvning plats10. Denna vektor underlättar klyvning av hans ...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

Kristalliserings försök av NEMO i obunden form misslyckades, inklusive försök att använda full längd protein och flera trunkering konstruktioner som omfattar IKK-bindande domän. Vår biofysiska karakterisering av IKK-bindande domän av Nemo (rester 44-111) av cirkulär dichroism, NMR spektroskopi och fluorescens anisotropi uppgav att konstruktionen, om än kunna binda ikkβ, existerade i ett tillstånd av överensstämande utbyte, inte lämpar sig för kristallisation9,<sup class...

NF-κB-vägen aktiveras som svar på en mängd olika stimuli, inklusive cytokiner, mikrobiella produkter och stress, för att reglera uttrycket av målgener som svarar för inflammatoriska och immunrespons, celldöd eller överlevnad och proliferation1. Patologier inklusive inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar och cancer2,3,4,5 har korrelerats till hyperaktivering av vägen, som har gjort modulering av NF-κb aktivitet ett främsta mål för utvecklingen av nya terapier6,7.
Den kanoniska NF-κB-vägen skiljer sig i synnerhet från den icke-kanoniska vägen, som ansvarar för lymphorganogenes och B-cells aktivering, av det förstnämnda beroendet av byggnads ställnings proteinet NEMO (NF-κB Essential modulator8) för monteringen av IKK-komplexet med kinaser IKKα och ikkβ. IKK-komplexet ansvarar för fosforyleringen av IκBα (inhibitor för κB) som riktar den mot nedbrytning, vilket frigör NF-κB-dimererna att translokalisera till kärnan för gentranskription1 och är därför ett attraktivt mål för utvecklingen av inhibitorer för att MODULERA NF-κb-aktiviteten.
Vår forskning fokuserar på karakterisering av protein-protein interaktion mellan NEMO och IKKβ, inriktning NEMO för utveckling av små molekyler hämmare av IKK komplex formation. Den minimala bindnings domänen för NEMO, som krävs för att binda IKKβ, omfattar resthalter 44-111, och dess struktur har fastställts i komplex med en peptid motsvarande IKKβ-sekvens 701-7459. Nemo och ikkβ bildar en Four-Helix bunt där Nemo dimer rymmer de två alfahelixar av ikkβ (701-745) i ett långsträckt öppet spår med en utökad interaktion gränssnitt. IKKβ (734-742), även känd som NEMO-bindande domän (NBD), definierar den viktigaste hot-spot för bindning, där de två viktiga tryptophans (739 741) begrava djupt i NEMO fickan. Detaljerna i den komplexa strukturen kan stöd i struktur-baserad design och optimering av småmolekylära hämmare riktar sig till NEMO. Samtidigt är det svårt att bindningen av en liten molekyl eller peptid skulle återskapa i NEMO den fullständiga överensstämande förändringen (dvs. omfattande öppnande av NEMO coiled-Coil dimer) orsakad av bindning av den långa IKKβ (701-745), som observerats i kristallen, och strukturen av obunden NEMO eller NEMO bunden till en liten molekyl hämmare kan representera ett bättre mål för strukturbaserad läkemedelsdesign och inhibitor optimering.
Full längd NEMO och mindre trunkering konstruktioner som omfattar IKK-bindande domän har visat sig vara svårbevisad för strukturbestämning i obunden form via röntgen kristallografi och kärnmagnetisk resonans (NMR) metoder10, som föranledde oss att utforma en förbättrad version av IKK-bindande domän Nemo. Indeed, Nemo (44-111) i obunden form är bara delvis viks och genomgår konforma utbyte och vi därför att stabilisera sin dimeriskt struktur, lindade-spole vika och stabilitet, samtidigt som bindning affinitet för ikkβ. Genom att lägga till tre heptads av ideal dimeriskt lindade-Coil sekvenser11 vid N-och C-Termini av proteinet, och en serie av fyra punktmutationer, genererade vi Nemo-eeaa, en konstruktion helt dimeriskt och viks i en lindad spole, som räddade IKK-bindande affinitet till nanomolar sortiment som observerats för full längd Nemo12. Som en ytterligare fördel, vi hoppades att lindade-Coil adaptrar (baserat på GCN4 sekvens) skulle underlätta kristallisation och så småningom stöd i röntgen strukturbestämning via molekylär ersättning. Lindade-Coil adaptrar har på samma sätt utnyttjas för att både öka stabiliteten, förbättra lösningen beteende och underlätta kristallisering för trimeric lindade spolar och antikroppar fragment13,14. Nemo-eeaa är lätt att uttryckas och renas från Escherichia. coli -celler med en klyvbar histidin-tagg, är löslig, vikas i en stabil dimeriskt lindad spole och är lätt kristalliserad, med diffraktion till 1,9 Å. Närvaron av de beställda lindade-Coil regioner i GCN4 kan dessutom stöd i fasa data från kristaller av NEMO-EEAA genom molekylär ersättning med hjälp av den kända strukturen i GCN415.
Med tanke på de resultat som erhållits med APO-NEMO-EEAA, tror vi att de protokoll som beskrivs här kan också tillämpas på kristallisering av NEMO-EEAA i närvaro av små peptider (som NBD peptid) eller små molekyler hämmare, med målet att förstå kraven för NEMO hämning och strukturbaserad optimering av initiala bly-hämmare till hög affinitet. Med tanke på plasticitet och dynamiska karaktären hos många lindade-Coil domäner16, användning av lindade-Coil adaptrar kunde hitta mer allmän tillämplighet i medhjälp strukturell beslutsamhet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO är ett byggnads ställnings protein som spelar en viktig roll i NF-κB-vägen genom att montera IKK-komplexet med kinaser IKKα och IKKβ. Vid aktivering, IKK komplexa fosforylerar de iκb molekyler som leder till NF-κb nukleära flyttning och aktivering av målgener. Hämning av den NEMO/IKK interaktion är en attraktiv terapeutisk paradigm för modulering av NF-κB Pathway aktivitet, gör NEMO ett mål för inhibitorer design och upptäckt. För att underlätta processen för upptäckt och optimering av NEMO-hämmare, konstruerade vi en förbättrad konstruktion av IKK-bindande domän av NEMO som skulle möjliggöra strukturbestämning av proteinet i APO-form och samtidigt bunden till småmolekylära vikt hämmare. Här presenterar vi den strategi som används för design, uttryck och strukturell karakterisering av IKK-bindande domän av NEMO. Proteinet uttrycks i E. coli -celler, solubiliseras under denaturerande förhållanden och renas genom tre kromatografiska steg. Vi diskuterar protokollen för att få kristaller för strukturbestämning och beskriver datainsamlings-och analysstrategier. Protokollen kommer att finna stor tillämplighet på strukturen bestämning av komplex av NEMO och små molekyler hämmare.

Kloning, uttryck och rening av den IKK-bindande domänen för NEMO. Protokollet följde i denna studie för att få den slutliga sekvensen av NEMO-EEAA (figur 1A), som producerade diffraktion kvalitet kristaller, involverade uttrycket och karakterisering av alla mellanliggande konstruktioner, inklusive tillägg av lindade-Coil adaptrar på N-och eller C-terminus, mutationer C76A, C95S och mutationer E56A, E57A. Figur 1<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Vi beskriver protokoll för strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO genom röntgenkristallografi. Metoderna omfattar proteinuttryck, rening och karakterisering samt strategier för framgångsrik kristall optimering och strukturbestämning av proteinet i dess obundna form.

Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Detta protokoll underlättar framgångsrik strukturbestämning av IKK-bindande domänen NEMO, i dess obundna form. Och detaljer om dess produktion och kristallisering. Protokollet, drar nytta av denna stabilisering av den infödda bekräftelse av IKK bindande domän fragment av NEMO, genom coiled-coil adaptrar, som underlättar kristallisering och struktur bestämning.Strukturbiologin hos NEMO, som mål, ger en viktig fördel i utvecklingen av NEMO-hämmare för behandling av inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar och cancer. Detta protokoll kan utvidgas till strukturbestämning av NEMO-komplex, med peptid eller små molekylhämmare för upptäckt eller optimering av läkemedel. Proteinet refolding och koncentration, under proteinproduktionsstadiet, är grundläggande för att få en ren NEMO-dimer.Begränsa aggregering och säkerställa löslighet under kristalliseringsförhållanden. Demonstrera förfarandena kommer att Tamar och Amy, doktorander i vårt laboratorium. Börja med att lägga till 20 milliliter av fantastisk buljong lösning.Och 20 mikroliter av en 100 milligram per milliliter stamlösning av ampicillin. Till en 125 milliliter Erlenmeyerkolv. Följt av några mikroliter av cell glycerol lager, från 80 grader Celsius lagring, av BL21DE3 kompetenta celler.Förvandlad med vektor. Efter att ha skakat förrätt kultur över natten, vid 37 grader Celsius och 220 rotationer per minut, späd cellerna till en OD600 av 0,1 och 250 milliliter av fantastisk buljong. Och tillsätt ampicillin till en slutlig koncentration av 100 mikrogram per milliliter.När OD600 av kulturen når 0,8 till 1, lägg IPTG till kulturen, till en 500 mikromolar koncentration. Och odla cellerna i fyra timmar, vid 37 grader Celsius, tills OD600 når sex till 10. Vid slutet av inkuberingen sedimenterar cellerna genom centrifugeringen.Och åter avbryta pelleten i 40 milliliter av lysbuffert. Dela upp de åter upphängda cellerna i två 20 till 25 milliliter alikvoter. Och använda en fransk press för att tillämpa cirka 25, 000 pounds per kvadrattum av tryck till cellerna, två till tre gånger per alikvot, i ett kallt rum.Därefter lägger du till urea till cellen lysates, till en slutlig koncentration av åtta molar. Och inkubera celllösningen på en gungande plattform i två till 16 timmar, vid rumstemperatur. Nästa morgon, överföra lysates till ultra-centrifug rör, till minst tre fjärdedelar full, per rör.Och ulrta centrifugerna, i 45 minuter. Dekantera supernatanterna i ett 50 milliliter koniskt rör. Och ladda urea inkuberade supernatant på en IMAC kolumn, på tre milliliter per minut.När alla supernatanten har kört igenom kolonnen, tvätta kolonnen för 10 kolonnvolymer, med bindningsbuffert, i tre milliliter per minut. Och utföra gradient eluering av NEMO-EESA protein från 10 till 500 millimolar imidazol, över en 12 kolumn volymgradient. Samla en milliliter alikvoter av eluat, till en bråkdel samling tallrik.Efter SDS-sidanalys, dra de fraktioner som innehåller det rena målproteinet och mäta proteinkoncentrationen av Bradford-analys, enligt standardprotokoll. Välj de elerade fraktionerna, som innehåller protein. För att klyva HIS6-taggen och för att avlägsna överskott imidazol från provet, tillsätt TEV proteas, vid ett till 10 viktförhållande, av TEV cleaved protein, till målet proteinprovet.Och vidga provet över natten i fyra liter 20 millimolar Tris. 150 millimolarnatriumklorid och två millimolar DTT-lösning. Nästa morgon, ladda TEV klyvts NEMO-EESA prov, på en andra IMAC kolumn, på en milliliter per minut.Samla flödet genom i en milliliter fraktioner, i en 96 skål fraktion samlingsplatta. Tvätta kolonnen med fem volymer på 20 millimolar tris, 150 millimolarnatriumklorid och 10 millimolar imidazollösning, vid en milliliter per minut. Efter den sista tvätten, elute den TEV och morred HIS6 NEMO-EEAA, med tre kolumn volymer av 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumklorid, 500 millimolar imidazole och två millimolar DTT lösning, till en 50 milliliter kolv.Dra flödet genom fraktioner, innehållande klyvt NEMO-EESA konstruera och koncentrera provet med en rörd cell koncentrator, till fem milliliter. Efter över natten dialys som visat, ladda fem milliliter av provet på 16 millimeter med 60 centimeter storlek uteslutning kromatografi kolumner. Upprepas vid behov, enligt provvolymen.Vid en milliliter per minut, och vid två millimol tris, 100 millimolar natriumklorid och två millimolar DDT lösning. Efter att ha dragit fraktionerna, motsvarande den dimeriska NEMO-EESA, koncentrera provet i den omrörda cellkoncentratorn, med en molekylvikt avskuren membran på tre kilodalton, till en slutlig koncentration av 113 mikromolar. Sedan, aliquot proteinet för lagring vid fyra grader Celsius, i upp till en månad.För gles matrisscreening, tillsätt 60 mikroliter av gles matrislösning i var och en av de 96 brunnarna i en två droppkammare kristallisation platta. För sitta och släppa ångdiffusion. Och tillsätt proteinlösningen till en robotdropsare.Därefter använder en robot drop setter, att fördela 100 nanoliter proteinlösning på 1,65 milligram per milliliter, i en ett till ett förhållande med reservoarlösning i droppe ett, till en slutlig volym på 200 nanoliter. Och tillsätt 66 nanoliter proteinlösning med 134 nanoliter av reservoarlösning, till en slutlig volym på 200 nanoliter i drop two. Sedan, omedelbart försegla plattan med tre tum bred tätningstejp.Sedan, lagra brickorna i en kristallisering imager lagring, vid 20 grader Celsius. Kontroll av bilderna samlas automatiskt, för närvaro av kristaller, med början två dagar efter lagring av plattorna. För utsäde bestånd generation, överföra hela droppe som innehåller kristallen av intresse, i 50 mikroliter av kristallisering skick lösning, i den medföljande injektionsflaskan, från ett frö generation kit.Och virvel fröet lager, med 20 sekunder av pulserande och 10 sekunders vila, i tre minuter. Sedan, seriellt späda utsädet lager, i en till 10 steg, ner till en till 10, 000. Och lagra utspädningar vid fyra grader Celsius, tills vidare användning.En till två dagar före sändningen till synkrotron, skär bandet från toppen av brunnen, med kristallen av intresse. Och tillsätt 0,5 mikroliter av kristallisering lösning som innehåller 12%en, två propan DiO cryoprotectant, direkt till brunnen. Försiktigt rubba kristallen med en kryoslinga.Slinga kristallen från brunnen, och lagra kristallen som innehåller cryo slinga i en puck nedsänkt i flytande kväve, tills transport för röntgendiffraktion. Efter att ha fått röntgendiffraktionsdata, bearbetar du de skalade intensiteterna i STAR- och ISO-servern. Med hjälp av en röntgenkristallografi indexering avskurna medelvärdet, av 1,2 för diffraktion gräns yta för data.Och lasta på Phoenix. För att bestämma strukturen, använd röntgenstrukturen av GCN4 som en sökmodell för molekylär ersättning, med hjälp av MRage i Phoenix. Den 4DMD struktur, kommer att definieras som en ensemble.Och MRage lösningen kommer framgångsrikt att bygga till strukturen delen, motsvarande slutet terminalen coiled-coil adapter av NEMO-EEAA. till sökmodellen, för båda kedjorna i dimern. Det över uttryckta proteinet visas på ett musikband, på ungefärligt 14 kilodalton molekylär viktmarkör, för den första IMAC-kolonnen rening.Och visar ett monomerband och ett dimerband, på 14 respektive 28 kilodalton efter den första eleringen. TEV klyvning är praktiskt taget komplett, efter elueringen, genom den andra IMAC kolumnen. Nästan helt som en dimer, vid den förväntade molekylvikten.Storlek uteslutningskromatografi, visar en enda topp, undkomma mellan 60 till 65 milliliter, som svarar på dimer. Fin screening producerar kristaller som kan utnyttjas för att producera ett fröbestånd för produktion av NEMO-EESA kristaller, för datainsamling. Här visas representativa NEMO-EESA kristaller diffraktion profiler.Strukturell analys av NEMO-EEAA proteinet, avslöjar en homodimeric oregelbundna parallella ringlad-spole, cirka 175 ångströms i längd. Den regelbundna spolen regionen omfattar den idealiska coiled-coil adapter sekvens, i slutet ändstationen. Och de två första heptads av NEMO korrekt sekvens.En vanlig spolspole, är också närvarande vid C ändstationen. Börjar vid NEMO rester 97 och omfattar C terminalen idealisk coiled-coil adapter. Den IKK beta bunden struktur, visar en mer öppen spole-coil bekräftelse, för att rymma ligand.Med ett större interheliskt avstånd med en till 2,2 ångströms i denna region. Strukturen av en ligand i NEMO, erbjuder ett nytt mål för utformningen av hämmare genom beräkningsmetoder. Och för den visuella screening av bindande fickor med små molekyler bibliotek.Vi har nu en väg för kristallisering av den konstruerade NEMO konstruktionen i komplex med små molekyl ligander. Till stöd i att utveckla och optimera en ny klass av hämmare.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisering och strukturbestämning av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding och zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering av alpackor (Lama pacos) med proteinantigener och produktion av Antigen-specifika enda domän antikroppar

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...