Name: production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo
Uploaded: 2019-12-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Prof. Dr. Madden'e bu proje boyunca yaptığı birçok faydalı tartışma için teşekkür ederiz. Prof. Dr. D. Bolon'a optimize edilmiş GCN4 sarmal bobinini içeren plazmidin hediyesi için teşekkür ederiz. Dr. B. Guo'ya NEMO plazmidleri için teşekkür ederiz. Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili ve Amy E. Kennedy'ye prosedürü gösterdikleri için teşekkür ederiz. BioMT Kristalografi Çekirdek Tesisi ve Dartmouth'taki Biyokimya ve Hücre Biyolojisi bölümlerine kristalografi ekipmanlarının ve BioMT personelinin desteği için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Synchrotron Işık Kaynağı II, bir ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Ofis Bilim Kullanıcı Tesisi Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından DoE Ofis için sözleşmeli No altında işletilen AMX ışın hattı kullanılır. DE-SC0012704. NSLS II personeline desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH'nin R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 ve P20GM1131332 ve Munck-Pfefferkorn Roman ve İnteraktif hibeleri ile finanse edilmiştir.

1. Kristalografi için yapı tasarımı
<ol><li>N-terminal heksa-histidin etiketi ve proteaz dekolte sitesi de dahil olmak üzere, T7 promotörü kullanarak E. coli ifade için bir vektör önceki yayın12 olarak NEMO-EEAA dizisini klonlamak. NOT: Bu protokolde, n-terminal hekza-histidin etiketi ve Tütün Etch Virüs (TEV) dekolte sitesi10içerecek şekilde değiştirilmiş bir vektör kullandık. Bu vektör protein kristalizasyonu için Onun etiketinin böl?...

<ol>
	<li>Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+NF-kappaB:+players,+pathways,+perspectives.">Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives.</a> Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).</li><li>Bass&#232;res, D. S., Baldwin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor-kappaB+and+inhibitor+of+kappaB+kinase+pathways+in+oncogenic+initiation+and+progression.">Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression.</a> Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).</li><li>Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+and+the+immune+response.">NF-kappaB and the immune response.</a> Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+and+its+misregulation+in+disease.">Transcriptional regulation and its misregulation in disease.</a> Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).</li><li>Courtois, G., Gilmore, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+NF-kappaB+signaling+pathway:+implications+for+human+disease.">Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease.</a> Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+NEMO-binding+domain+mimetics+for+inhibiting+IKK/NF-&#954;B+activation.">Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-&#954;B activation.</a> PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).</li><li>Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=30+Years+of+NF-&#954;B:+a+blossoming+of+relevance+to+human+pathobiology.">30 Years of NF-&#954;B: a blossoming of relevance to human pathobiology.</a> Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).</li><li>Jin, D. Y., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+full-length+cDNA+and+chromosomal+localization+of+human+NF-kappaB+modulator+NEMO+to+Xq28.">Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28.</a> Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).</li><li>Rushe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+NEMO/IKK-associating+domain+reveals+architecture+of+the+interaction+site.">Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site.</a> Structure. 16 (5), 798-808 (2008).</li><li>Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+the+N-terminus+of+NEMO:+structure+stabilization+and+rescue+of+IKK&#946;+binding.">Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKK&#946; binding.</a> Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).</li><li>Havranek, J. J., Harbury, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+specificity+in+molecular+recognition.">Automated design of specificity in molecular recognition.</a> Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).</li><li>Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IKK-binding+domain+of+NEMO+is+an+irregular+coiled+coil+with+a+dynamic+binding+interface.">The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).</li><li>Arimori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fv-clasp:+an+artificially+designed+small+antibody+fragment+with+improved+production+compatibility,+stability,+and+crystallizability.">Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability.</a> Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).</li><li>Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors.">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).</li><li>Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+GCN4+leucine-zipper+domain+does+not+uniquely+specify+a+dimeric+oligomerization+state.">The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state.</a> Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).</li><li>Truebestein, L., Leonard, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coils:+The+long+and+short+of+it.">Coiled-coils: The long and short of it.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Miladi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tagged-TEV+protease:+construction,+optimisation+of+production,+purification+and+test+activity.">A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity.</a> Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).</li><li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), (2019).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+model+building,+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard.">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).</li><li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coot:+model-building+tools+for+molecular+graphics.">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).</li><li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=phenix.mr_rosetta:+molecular+replacement+and+model+rebuilding+with+Phenix+and+Rosetta.">phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).</li><li>Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Tickle, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> STARANISO. , (2018).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).</li><li>Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+rational+protein+crystallization:+A+Web+server+for+the+design+of+crystallizable+protein+variants.">Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-mediated+stabilization+of+the+I&#954;B+kinase+binding+domain+of+NF-&#954;B+essential+modulator+(NEMO).">Disulfide-mediated stabilization of the I&#954;B kinase binding domain of NF-&#954;B essential modulator (NEMO).</a> Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+what+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned.</a> Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).</li></ol>

NEMO'nun bağlanmamış formda kristalizasyon girişimleri, tam uzunlukta protein ve IKK bağlayıcı etki alanını kapsayan çeşitli kesilme yapıları da dahil olmak üzere başarısız oldu. DAIRESEL dikromizm, NMR spektroskopisi ve floresan anisotropi ile NEMO IKK bağlayıcı etki alanı (kalıntı 44-111) bizim biyofiziksel karakterizasyonu, ikkβ bağlamak mümkün olsa da, konformasyonel değişimbir devlet var olduğunu gösterdi 9,10. Yaklaşımımız...

NF-κB yolu, inflamatuar ve immün yanıt, hücre ölümü veya sağkalım ve çoğalmasından sorumlu hedef genlerin ekspresyonunu düzenlemek için sitokinler, mikrobiyal ürünler ve stres gibi çeşitli uyaranlara yanıt olarak aktive edilir1. Enflamatuar ve otoimmün hastalıklar ve kanser2,3,4,5 gibi patolojiler, NF-κB aktivitesinin modülasyonunu yeni tedavilerin gelişimi için ana hedef haline getiren yolun hiperaktivasyonu ile ilişkili dir6,7.
Özellikle kanonik NF-κB yolu, ikk kompleksinin kinases IKKα ve IKKβ ile montajı için iskele proteini NEMO 'ya (NF-κB temel modülatör8)olan lenforganogenez ve B hücre aktivasyonundan sorumlu kanonik olmayan patikadan ayrılır. IKK kompleksi, bozulmayı hedefleyen IκBα 'nın (κB inhibitörü) fosforilasyonundan sorumludur, nf-κB dimerlerini gen transkripsiyon1 için çekirdeğe çevirmeye serbest düşürür ve bu nedenle NF-κB aktivitesini modüle etmek için inhibitörlerin geliştirilmesi için cazip bir hedeftir.
Araştırmamız, IKK kompleks oluşumunun küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesi için NEMO'yu hedefleyen NEMO ve IKKβ arasındaki protein-protein etkileşiminin karakterizasyonuna odaklanmaktadır. IKKβ'yı bağlamak için gereken NEMO'nun minimal bağlayıcı etki alanı, 44-111 artıklarını kapsar ve yapısı IKKβ dizisi 701-7459'akarşılık gelen bir peptit ile kompleks olarak belirlenmiştir. NEMO ve IKKβ, NEMO dimer'in ikkβ'nın (701-745) iki sarsıcısını genişletilmiş etkileşim arabirimine sahip uzatılmış açık olukta barındırdığı dört sarnıçlı bir paket oluşturur. IKKβ (734-742), aynı zamanda NEMO bağlayıcı etki alanı (NBD) olarak da bilinir, iki temel triptotreksin (739.741) NEMO cebine derinlemesine gömdükleri bağlama için en önemli sıcak noktayı tanımlar. Karmaşık yapının ayrıntıları, NEMO'yu hedef alan küçük molekül inhibitörlerinin yapı tabanlı tasarımına ve optimizasyonuna yardımcı olabilir. Aynı zamanda, küçük bir molekül veya peptid inbağlanması nemo tam konformasyonel değişim yeniden olacağını zordur (yani, NEMO bobin dimer geniş açılış) uzun IKKβ bağlanması nedeniyle (701-745), kristal gözlenen, ve küçük bir molekül inhibitörü bağlı bağlı NEMO veya NEMO yapısı yapı tabanlı tasarım ve inhibe edici ilaç ve inhibitör için daha iyi bir hedef temsil edebilir.
Ikk bağlayıcı etki alanını kapsayan tam uzunlukta NEMO ve daha küçük kesilme yapıları X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) yöntemleri 10 ile bağlanmamış formda yapı tayini için inatçı kanıtlanmıştır10, hangi bize NEMO IKK bağlayıcı etki geliştirilmiş bir sürümünü tasarlamak için istenir. Nitekim, NEMO (44-111) bağlanmamış formda sadece kısmen katlanmış ve konformasyonel değişim uğrar ve bu nedenle onun dimeric yapısı stabilize etmek için ayarlayın, bobin kıvrım ve istikrar, IKKβ için bağlayıcı yakınlık korurken. Proteinin N-ve C-termini'sinde ideal dimerik bobin dizilerinin11'ini ve dört noktalı mutasyonları üç heptads ekleyerek, tam uzunlukta NEMO12için gözlenen nanomolar aralığına IKK-bağlama afiyeti kurtardı bir yapı tamamen dimeric ve katlanmış nemo-EEAA, bir yapı oluşturduk. Ek bir avantaj olarak, bobin adaptörlerinin (GCN4 dizisine göre) kristalizasyonu kolaylaştıracağını ve sonunda moleküler değiştirme yoluyla X-ışını yapısı nın belirlenmesine yardımcı olacağını umduk. Bobin adaptörleri benzer şekilde hem stabiliteyi artırmak, hem çözüm davranışını iyileştirmek hem de trimerik sarmal bobinler ve antikor parçaları için kristalizasyonu kolaylaştırmak için kullanılmıştır13,14. NEMO-EEAA kolayca ifade edilir ve Escherichia. coli hücrelerinden bir dekolte Histidine etiketi ile saflaştırılmış, çözünür, kararlı bir dimerik bobin katlanmış ve kolayca kristalize, kırınımı ile 1.9 Å. GCN4'ün sıralı sarmal bobin bölgelerinin varlığı, GCN415'inbilinen yapısını kullanarak moleküler değiştirme ile NEMO-EEAA kristallerinden gelen verilerin kademeli olarak ele alınmasına yardımcı olabilir.
Apo-NEMO-EEAA ile elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, burada açıklanan protokollerin, NEMO inhibisyonu ve yüksek afiniteye ilk kurşun inhibitörlerinin yapı tabanlı optimizasyonu için gerekli şartları anlamak amacıyla, küçük peptidler (NBD peptid gibi) veya küçük molekül inhibitörleri varlığında NEMO-AÇAA'nın kristalizasyonuna da uygulanabileceğine inanıyoruz. Birçok sarmal-bobin etki16plastisite ve dinamik doğası göz önüne alındığında, sarmal-bobin adaptörleri kullanımı yapısal belirlenmesine yardımcı daha genel uygulanabilirlik bulabiliriz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% w/v &#947;-PGA (Na+ form, LM)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-150</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>132724</td>
			<td>For dialysis removal of imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Stirred Cell</td>
			<td>Millipose Sigma</td>
			<td>UFSC 05001</td>
			<td>For protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9025-65-4</td>
			<td>For digestion of nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Model: 230245</td>
			<td>TEV expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPro</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-073</td>
			<td>Cryo-protectants kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td>For minimal media labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DF043817</td>
			<td>For culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol &#62; 99%</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td>For reduction of disulfides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli: Rosetta 2 (DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71400-3</td>
			<td>Expression of unlabeled NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORMULATOR</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Liquid handler/ screen builder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-581</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>For size exclusion purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 mL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524802</td>
			<td>For purification of His-tagged NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 MIDAS</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-59</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT 96 Morpheous</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>288-32-4</td>
			<td>For elution from His-trap column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C5</td>
			<td>For induction of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC2 crystallization plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-083</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT8 - Drop Setter</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-16b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>69662</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-45b</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71327</td>
			<td>For cloning of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>36978</td>
			<td>For inhibition of proteases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>339160</td>
			<td>Ultracentrifuge bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 20,000</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-609</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRK793 (TEV)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid 8827</td>
			<td>For TEV production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuikChange XL II</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200522</td>
			<td>Site directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Required Cap Assembly:</td>
			<td>Beckmann Coulter</td>
			<td>355623</td>
			<td>Ultracenttrifuge bottle cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK IMAGER</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td></td>
			<td>Crystallization Imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td>Seed generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP1</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Berkeley Screen</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>MD15-Berekely</td>
			<td>For sparse matrix screening of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The PGA Screen</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-50</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris &#8211; 1.0 M Solution</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-589</td>
			<td>For fine screen crystallization of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Tris Buffer (powder format)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15504020</td>
			<td>For buffering of purification solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29700</td>
			<td>For denaturation of NEMO-EEAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization, and structure determination of the ikk-binding domain of nemo

NEMO, IKK-kompleksini IKKα ve IKKβ ile birleştirerek NF-κB yolunda önemli bir rol oynayan bir iskele proteinidir. Aktivasyon üzerine IKK kompleksi, NF-κB nükleer translokasyonuna ve hedef genlerin aktivasyonuna yol açan IκB moleküllerini fosforilasyona yol açar. NEMO/IKK etkileşiminin inhibisyonu, NF-κB yol aktivitesinin modülasyonu için çekici bir terapötik paradigmaolup, NEMO'yu inhibitörlerin tasarımı ve keşfi için bir hedef haline getirerek. NEMO inhibitörlerinin keşif ve optimizasyon sürecini kolaylaştırmak için, nemo'nun IKK-bağlayıcı etki alanının, apo formunda ve küçük molekül ağırlık inhibitörlerine bağlı olarak proteinin yapı tayinine olanak sağlayacak geliştirilmiş bir yapı tasarladık. Burada, NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının tasarımı, ifadesi ve yapısal karakterizasyonu için kullanılan stratejiyi sıyoruz. Protein E. coli hücrelerinde ifade edilir, denatüre koşulları altında çözünür ve üç kromatografik adım ile saflaştırılmış. Yapı belirleme için kristal elde etme protokollerini tartışıyor ve veri toplama ve analiz stratejilerini açıklıyoruz. Protokoller, NEMO ve küçük molekül inhibitörleri komplekslerinin yapı tayininde geniş uygulanabilirlik bulacaksınız.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının klonlanması, ifade lenmesi ve arınması. Bu çalışmada, kırınım kalitesinde kristaller üreten NEMO-EEAA 'nın(Şekil 1 A)son sekansını elde etmek için, N- ve c-terminus'taki bobin bağlaç adaptörleri, C76A, C95S mutasyonları ve E56A, E57A mutasyonları da dahil olmak üzere tüm ara yapıların ifade ve karakterizasyonu yer almıştır. Şekil 1B, <strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO at JoVE.com

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Bu protokol, NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının sınırsız biçimde başarılı bir yapı belirlemesini kolaylaştırmaktadır. Ve üretim ve kristalizasyon detayları. Protokol, kristalizasyon ve yapı tayinini kolaylaştıran bobin bağlatan adaptörler aracılığıyla NEMO'nun IKK bağlayıcı etki alanı parçasının yerli teyidinin bu stabilizasyonundan yararlanır.Nemo yapısal biyoloji, bir hedef olarak, inflamatuar ve otoimmün hastalıklar ve kanser tedavisinde NEMO inhibitörleri gelişiminde önemli bir avantaj sağlar. Bu protokol, ilaç keşfi veya optimizasyonu için peptit veya küçük molekül inhibitörleri ile NEMO komplekslerinin yapı tayini için uzatılabilir. Protein refolding ve konsantrasyon, protein üretim aşamasında, saf bir NEMO dimer elde etmek için temel vardır.Kristalizasyon koşullarında agregasyonu sınırlandırma ve çözünürlüğü sağlamak. Prosedürleri gösteren Tamar ve Amy, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencileri olacaktır. Müthiş et çözeltisi 20 mililitre ekleyerek başlayın.Ve mililitre likit çözelti başına 100 miligram lık 20 mikrolitre ampisilin. 125 mililitrelik Erlenmeyer şişesine. Hücre gliserol stok birkaç mikrolitre takip, 80 santigrat depolama, BL21DE3 yetkili hücrelerin.Vektörle dönüştürülmüştür. Başlangıç kültürü bir gecede sallayarak sonra, dakikada 37 derece santigrat ve 220 rotasyonlar, müthiş suyu 0.1 ve 250 mililitre bir OD600 hücreleri seyreltmek. Ve mililitre başına 100 mikrogramlık son konsantrasyona ampisilin ekleyin.Kültürün OD600 0,8-1 ulaştığında, 500 mikromolar konsantrasyonuna, kültüre IPTG ekleyin. Ve hücreleri 4 saat boyunca, 37 derecede, OD600 6-10 dereceye ulaşana kadar büyütün. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri tortu.Ve 40 mililitre likis tamponu yla peleti yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri 20 ila 25 mililitrelik iki ye bölün. Ve bir Fransız basını kullanarak hücrelere yaklaşık 25,000 pound'luk basınç uygulayın, soğuk bir odada aliquot başına 2-3 kez.Daha sonra, hücre lysates için üre ekleyin, sekiz azı dakikası son konsantrasyonuna. Ve hücre çözeltisini oda sıcaklığında 2 ila 16 saat boyunca sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, lysates ultra-santrifüj tüpler, en az dörtte üçü tam, tüp başına aktarın.Ve ulrta santrifüj, lysates için 45 dakika. Süpernatantları 50 mililitrelik konik bir tüpe dönüştürün. Ve üre inkübe süpernatantını dakikada üç mililitre lik bir IMAC sütununa yükleyin.Tüm supernatant sütun boyunca çalıştırdığında, dakikada üç mililitre de, bağlama arabellek ile 10 sütun birimleri için sütun yıkayın. VE 12 sütun luk hacim degradesi üzerinde, 10 ila 500 milimolar imidazol NEMO-EEAA proteingradient elution gerçekleştirin. Bir mililitre lik aliquot'u bir kesir toplama plakasına toplamak.SDS sayfa analizinden sonra, saf hedef proteiniçeren fraksiyonları çekin ve standart protokole göre, Bradford tahlil ile protein konsantrasyonunu ölçmek. Protein içeren kaçan fraksiyonları seçin. HIS6 etiketini cleave ve örnekten fazla imidazol kaldırmak için, tev proteaz ekleyin, bir ila 10 ağırlık oranı, TEV cleaved protein, hedef protein örneğine.Ve 20 milimolar Tris dört litre içinde bir gecede örnek dilate. 150 milimoler sodyum klorür ve iki milimolar DTT çözeltisi. Ertesi sabah, TEV cleaved NEMO-EEAA örneğini dakikada bir mililitre de ikinci bir IMAC sütununa yükleyin.Bir mililitre kesirler üzerinden akış toplama, bir 96 kase fraksiyonu toplama plakası. 20 milimolar Tris, 150 milimolar sodyum klorür ve 10 milimolar imidazol çözeltisi beş cilt ile sütun yıkayın, dakikada bir mililitre. Son yıkamadan sonra, TEV ve amca 20 milimolar Tris, 150 milimolar sodyum klorür, 500 milimolar imidazol ve iki milimolar DTT çözeltisi üç sütun hacmi ile, 50 mililitrelik bir şişe içine HIS6 NEMO-EEAA, elat.Yarık NEMO-EEAA yapısı içeren fraksiyonlar üzerinden akışı çekin ve beş mililitre, bir karıştırılmış hücre konsantratörü ile örnek konsantre. Gösterildiği gibi gece diyalizinden sonra, numunenin beş mililitresini 16 milimetre ile 60 santimetre büyüklüğünde dışlama kromatografi sonları üzerine yükleyin. Örnek hacmine göre gerektiği gibi tekrar.Dakikada bir mililitre, ve iki milimolar Tris, 100 milimolar sodyum klorür ve iki milimolar DDT çözeltisi. Kesirleri çektikten sonra, dimerik NEMO-EEAA'ya karşılık gelen, numuneyi karıştırılan hücre konsantratöründe, moleküler ağırlığı üç kilodalton luk bir zardan 113 mikromolar nihai konsantrasyona yoğunlaştırın. Sonra, bir aya kadar, dört santigrat derecede depolama için protein aliquot.Seyrek matris taraması için, iki damla oda kristalizasyon plakasının 96 kuyunun her birine 60 mikrolitre seyrek matris çözeltisi ekleyin. Oturup buhar difüzyonu için. Ve protein çözeltisini robotik bir damla ayarlayıcısına ekleyin.Daha sonra, bir robot damla ayarlayıcı kullanın, mililitre başına 1,65 miligram protein çözeltisi 100 nanolitre dağıtmak için, damla bir rezervuar çözeltisi ile bire bir oranında, 200 nanolitre son hacmi. Ve 134 nanolitre rezervuar çözeltisi ile 66 nanolitre protein çözeltisi ekleyin, 200 nanolitrelik son bir hacim damla iki. Sonra, hemen üç inç genişliğinde sızdırmazlık bandı ile plaka mühür.Daha sonra, 20 santigrat derece bir kristalizasyon görüntüleyici depolama tepsileri saklayın. Plakaların saklanmasından iki gün sonra başlayan kristallerin varlığı için otomatik olarak toplanan görüntüleri kontrol etmek. Tohum stok üretimi için, bir tohum üretim kiti, sağlanan şişe kristalizasyon durum çözümü 50 mikrolitre içine, ilgi kristalkristali içeren tüm damla aktarın.Ve tohum stoku girdap, 20 saniye nabız ve 10 saniye dinlenme ile, üç dakika boyunca. Daha sonra, seri tohum stokseyreltmek, bir ila 10 artışlarla, aşağı bir 10, 000. Ve seyreltmeleri daha fazla kullanılana kadar, 4 santigrat derecede saklayın.Synchrotron'a gönderilmeden 1-2 gün önce, çeyiyi tepeden, ilgi kristaliyle kes. Ve 0.5 mikrolitre kristalizasyon çözeltisi içeren ekleyin 12% bir, iki propan DiO kriyoprotektif, doğrudan kuyuya. Yavaşça bir kriyo döngü ile kristal yerinden.Kristali kuyudan toplayın ve kriyo halkası içeren kristali sıvı nitrojene batırılmış bir diskte saklayın, ta ki X-ışını kırınımı için sevkiyat yapılana kadar. X-ışını kırınım verilerini aldıktan sonra, STAR ve ISO sunucusundaki ölçeklenmiş yoğunlukları işleyin. Bir X-ışını kristalografi indeksleme kullanarak veri için kırınım limit yüzeyi için 1,2 ortalama kesilmiş.Ve Phoenix'e yüklenin. Yapıyı belirlemek için, Phoenix'teki MRage'i kullanarak GCN4'ün X-ışını yapısını moleküler değiştirme için bir arama modeli olarak kullanın. 4DMD yapısı, bir topluluk olarak tanımlanacaktır.Ve MRage çözümü, NEMO-EEAA'nın son terminal sarmal bobin adaptörüne karşılık gelen yapı kısmına başarıyla inşa edilecektir. arama modeline, dimer her iki zincir için. Aşırı ifade protein bir bant görünür, yaklaşık 14 kilodalton molekül ağırlığı marker, ilk IMAC sütun saflaştırma önce.Ve bir monomer bant ve bir dimer bant görüntüler, 14 ve 28 kilodaltons, sırasıyla, ilk elution sonra. TEV dekoltesi, elüsasyonu takiben, ikinci IMAC sütunu aracılığıyla neredeyse tamamlanır. Neredeyse tamamen bir dimer olarak, beklenen molekül ağırlığı.Boyut dışlama kromatografisi, tek bir tepe görüntüler, arasında kaçan 60 için 65 mililitre, kim dimer yanıt veriyor. İnce tarama veri toplama için, NEMO-EEAA kristallerinin üretimi için bir tohum stok üretmek için kullanılabilir kristaller üretir. Burada temsilci NEMO-EEAA kristalleri kırınım profilleri gösterilmiştir.NEMO-EEAA proteininin yapısal analizi, homodimerik düzensiz paralel sarmal bobin, yaklaşık 175 angstrom uzunluğunda ortaya koymaktadır. Normal bobin bölgesi, son terminusta ideal bobin bağlaç adaptör dizisini kapsar. Ve NEMO'nun ilk iki heptads'ı uygun bir dizilim.Düzenli bir sarmal bobin, C terminus da mevcuttur. NEMO kalıntı 97'den başlayıp C terminalini kapsayan ideal sarmal bobin adaptörü. IKK beta ciltli yapısı, ligand karşılamak için, daha açık bir bobin onay görüntüler.Bu bölgede 1-2 angstroms tarafından daha büyük bir interhelical boşluk ile. NEMO'da bir ligand yapısı, hesaplama yöntemleri ile inhibitörlerin tasarımı için yeni bir hedef sunuyor. Ve küçük molekül kütüphaneleri ile bağlayıcı ceplerin görsel tarama için.Şimdi küçük molekül ligandlar ile karmaşık mühendislik NEMO yapıkristalizasyon için bir yol var. Yeni bir inhibitör sınıfının geliştirilmesine ve optimize edilmesine yardımcı olmak.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Alpaka (Lama Paços) Protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...