Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

نشكر ماريكو ل. بينيت ، ليانا نيكول بونانو ، و سبيروس دارمانيس لمساعدتهم خلال تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا المرفق المشترك لمؤسسه "ستانفورد" ، ولا سيما ميريديث وايغلارز وليزا نيكولز ؛ ين تران ، مايكل Eckart من البروتين ستانفورد ومرفق الحمض النووي (PAN) لدعمهم الكبير للتصوير. ويتم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه JPB ومؤسسه فنسنت j. Coates.

وتتفق جميع الإجراءات المتعلقة بالقوارض مع المبادئ التوجيهية لجامعه ستانفورد ، التي تمتثل للقوانين والسياسات الوطنية والولائية. تمت الموافقة علي جميع الإجراءات الحيوانية من قبل الفريق الإداري لجامعه ستانفورد المعني برعاية الماشية في المختبرات.
ملاحظه: يتم توفير...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

الميكروبات تتفاعل بنشاط مع أنواع الخلايا الأخرى في الوحدة العصبية الخاصة ، وانها حساسة جدا للمؤثرات البيئية. من أجل التقليل من الاستجابات التهابيه والتغيرات الشاذة في التعبير الجيني اثناء عمليه العزل ، تم تبسيط هذا البروتوكول من الطريقة9المنشورة سابقا ، وهو الآن مناسب لعزل ...

الأجزاء الصغيرة التي تمثل 5% − 10% من جميع الخلايا العصبية هي الضامة المقيمة المنتشرة في جميع انحاء الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. المحمية وراء حاجز الدم في الدماغ, الميكروبات النموذجية في الدماغ الكبار صحية تحتوي علي العديد من العمليات الدقيقة التي تمتد بسرعة والتراجع للتفاعل مع الخلايا العصبية وغيرها من الكريات الدبقيه في parenchyma. ويمكن أيضا ان تعتمد الخلايا الصغيرة المورفولوجية الشكل الأميبا المرتبطة بزيادة وظيفة البالعة خلال مراحل تنموية محدده أو عند التحديات المناعية في الإصابات والامراض1،2،3،4. كما يتم توضيح المزيد من وظائف الخلايا الصغيرة الصغرى ، ويغذي الاثاره أكثر من الدراسات علم الوراثة البشرية ، والتي أظهرت ان العديد من الجينات خطر الامراض العصبية ، مثل TREM2 ، هي في الغالب أو حصرا التي أعرب عنها ميكروليا5،6،7. نظرا لأهميتها في التنمية والأدوار المعقولة القيادة المرض, وقد تم مؤخرا بذل جهد هائل نحو فهمنا لتنظيم الجينات ميكروجليال ووظيفة في الأمل في العثور علي أهداف علاجيه جديده للامراض التنكسية العصبية1,8.
ويسمح تسلسل الحمض الريبي النيبالي (RNA-seq) بتوصيف غير متحيز للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية ، والذي بدوره يرشد العلماء إلى التحقيق في وظائف الجينات في الشبكات الخلوية الكثيفة7. وقد تم الحمض الريبي النيبالي-seq في الغالب علي عينات السائبة ، مما يؤدي إلى اكتشاف التوقيع الجينات ميكروجليال التماثل الذي يميزها عن الخلايا العصبية والمناعية الأخرى9. ومع ذلك ، يمكن ان يغفل هذا النهج الاختلافات الجزيئية والوظيفية بين الخلايا الصغيرة ، وخاصه تلك الموجودة بشكل عابر في التنمية ، أو المرتبطة بالشيخوخة والمرض. وفي الواقع ، فان الخلية الواحدة RNA-seq (scrna-seq) تقدم الحساسية والدقة التي أحدثت ثوره في المجال من خلال الكشف عن عدم التجانس في السابق من الميكروبات الصغيرة في مجموعه متنوعة من السياقات2،3،10. الاضافه إلى ذلك ، ونظرا لوجود خلايا مناعية مماثله أخرى في واجهه الجهاز العصبي الدوران ، يوفر scRNA-seq معلومات تساعد علي تصميم أدوات جديده لفصل وتشريح وظيفيا هذه الخلايا ذات الصلة مع القليل من المعرفة السابقة2،11.
وقد تم اختراع مجموعه متنوعة من المنصات التي تليها scRNA ، كل مناسبه لتطبيقات معينه12. وبصفه عامه ، فان الطرق القائمة علي القطرات ، مثل الجينوم الجيني 10x ، تكون اعلي في الانتاجيه مع (عشرات) آلاف الخلايا المتسلسلة في كل شوط ، وهي اقل انتقائية للمدخلات التي قد تحتوي علي مجموعات مختلطة من الخلايا التي تتطلب تصنيفا واسعا. توفر الطرق المستندة إلى اللوحة حساسية اعلي وقراءه العمق13،14، وعاده ما تستهدف الفئات السكانية المحددة من فرز الخلايا للكشف عن الاختلافات الدقيقة أو النصوص النادرة. 
هنا ، ونحن نقدم تفاصيل حول كيفيه عزل الخلايا الصغيرة من مناطق مختلفه من الدماغ الماوس تشريح من نصف الكره الواحد ، والتي تستخدم لخليه واحده (أو السائبة) الحمض الريبي النيبالي-seq بعد اجراء شبه الألى لوحه القائمة علي التحضير للمكتبة. ويمكن بعد ذلك استخدام نصف الكره الآخر للتحقق من صحة الانسجه. تبسيط من الطريقة المنشورة سابقا9، ويهدف هذا البروتوكول العزلة لتعظيم العائد من كميه صغيره من مواد البداية ، وفي الوقت نفسه الحفاظ علي ملامح التعبير الجيني ميكروجليال الذاتية. نستخدم الفرز الخلوي المنشط (FACS) لإثراء الأجزاء الصغيرة (أو الخلايا المناعية الأخرى ذات الاهتمام) في لوحات 96 وتصغير احجام الكواشف لاعداد المكتبة من أجل زيادة الانتاجيه. ونحن نسلط الضوء علي هذه المنصة الحساسة ، علي الرغم من انه يمكن تطبيق استراتيجيات أخرى قائمه علي اللوحات. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهوله لعزل الخلايا الصغيرة من الانسجه الأخرى التي تم تشريحها ، مثل الاصابه أو بؤر المرض ، ويمكن ان يختلف عمر الماوس عبر اي مراحل ما بعد الولادة تقريبا. ومن شان العزل الفعال للخلايا الصغيرة الاقليميه للدراسات الناسخة أحاديه الخلية ان يسهل الفهم الأفضل لوظائفهم في مجال الصحة والمرض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

كما الضامة المقيمين في الجهاز العصبي المركزي ، الميكروبات الصغيرة بنشاط السيطرة علي نمو الدماغ والتوازن ، واختلالاتها قد تدفع الامراض البشرية. وقد أحرز تقدم كبير للكشف عن التواقيع الجزيئية من الخلايا الصغيرة الساكنة ، فضلا عن التغييرات في التعبير الجيني لديها استجابه للمؤثرات البيئية. مع ظهور ونضوج المنهجيات الجينية أحاديه الخلية ، فانه من المسلم به بشكل متزايد ان غير متجانس الصغيرة قد تكمن وراء الأدوار المتنوعة التي تلعبها في الظروف التنموية والمرضية المختلفة. ويمكن تحقيق مزيد من التشريح لهذا التغاير من خلال العزل الفعال للخلايا الصغيرة من منطقه معينه من الاهتمام ، يليه التنميط الحساس لكل خليه. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للعزل السريع من الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الدماغية الماوس الكبار واحد. ونحن أيضا شرح كيفيه استخدام هذه الخلايا الصغيرة فرزها لتسلسل المستندة إلى لوحه عميقة الحمض الريبي النيبالي. ونناقش قابليه هذه الطريقة للتكيف مع سيناريوهات أخرى ونقدم مبادئ توجيهيه لتحسين النظام لاستيعاب الدراسات الواسعة النطاق.

يصف هذا البروتوكول أسلوبا لعزل وفرز الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الارضيه الدماغ البالغة ، تليها scRNA-seq. نحن نستخدم دونسينج لإنشاء تعليق خليه واحده وأيضا كخطوه اولي لإثراء الخلايا الصغيرة. نقص أو الإفراط في دونسينج يقلل من الغلة. الاضافه إلى ذلك ، تحتوي أدمغه الفئرا...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

نحن نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا الصغيرة من المناطق تشريح مختلفه من نصف الكره الدماغ الفار الكبار ، تليها اعداد المكتبة شبه المؤتمتة لعمق خليه واحده الحمض الريبي النيبالي تسلسل كامل طول الكتابات النصية. ستساعد هذه الطريقة علي توضيح التغاير الوظيفي للدبقيه الصغيرة في الصحة والمرض.

عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

تسمح هذه الطريقة بالتقاط غير متحيز للتعبير الجيني ميكروجليا على مستوى خلية واحدة، والتي يمكن أن تساعد في توضيح التغاير الجزيئي للميكروفليا في الدماغ السليم والمُرَض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يوفر إجراء مفصل لعزل سريع من microglia من مناطق الدماغ المختلفة ويبين كيفية توليد بكفاءة لعب قاعدة المكتبات RA6 خلية واحدة لتسلسل عميق. لبدء هذا الإجراء، إعداد جميع المخازن المؤقتة والحلول المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول النص وتهدئة لهم على الجليد.بعد القتل الرحيم وقطع رأس الماوس، استخدم مقص صغير لقطع فتح الجلد على الرأس لفضح الجمجمة تحتها. ثم، وقطع من خلال خياطة القوس، خياطة لامدويدال، وخياطة الإكلالي. استخدام ملقط لسحب قبالة كلا الجانبين من العظام الجدارية والعظام بين الزبقية دون إتلاف الأنسجة ونقل الدماغ بعناية إلى طبق بيتري تشريح تحتوي على A.Using شفرة ما قبل المبردة، وقطع الدماغ من خلال خط الوسط إلى نصفين.استخدم عدد 55 ملقط لفصل المخيخ عن الفص القشري و جذع الدماغ. ثم، استخدام عدد 55 ملقط لتشريح بعناية من قرن آمون و المخطط من القشرة ونقل كل الأنسجة في طبق بيتري مجموعة منفصلة. أولاً، استخدم شفرة حلاقة لختم كل منطقة من مناطق الدماغ إلى قطع دقيقة أقل من ملليمتر مكعب واحد.باستخدام ماصة ملليلتر واحد مع قطع طرف قبالة، ونقل قطع الأنسجة إلى المجانسات Dounce المبردة مسبقا. التجانس الأنسجة عن طريق التواء ببطء المكبس داخل وخارج التجانس Dounce لمدة ستة إلى 10 السكتات الدماغية الكاملة حتى لا توجد قطع مرئية موجودة. ثم، نقل الأنسجة المتفككة إلى أنابيب 50 ملليلتر من خلال 70 ميكرومتر مصافي.شطف كل التجانس Dounce ومكبس مع ما مجموعه ستة ملليلتر من المتوسط البارد A ثم نقل الشطف إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي. نظام التعليق أحادي الخلية بالطرد المركزي بمعدل 400 مرة ز وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق مع كسر في الخامسة. شطف عمود استنزاف كبير واحد وثلاثة أعمدة اختيار كبيرة في فاصل مغناطيسي مع ثلاثة ملليلترات من MCS.عندما يكون الطرد المركزي لعينات الأنسجة كاملة، ماصة خارج والتخلص من السوبر دون إزعاج بيليه. إعادة بناء الخلايا في المخزن المؤقت MCS الذي يحتوي على مثبط RNase. إضافة 100 ميكرولترات من الخرز إزالة المايلين إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا إعادة تعليق من القشرة والمخيخ وإضافة 50 ميكرولترات من الخرز إزالة المايلين إلى كل من الأنابيب التي تحتوي على خلايا إعادة تعليق من قرن آمون وstriatum.احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف MCS إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا القشرية ليصل حجمه إلى ملليلترين وإلى الأنابيب المتبقية لجلب كل وحدة من وحدات التخزين الخاصة بها إلى ملليلتر واحد. بمجرد أن تكون الأعمدة فارغة من المخزن المؤقت للشطف، قم بتحميل ميليلترين من الخلايا القشرية على عمود الاستنزاف الكبير و ملليلتر واحد من كل تعليق خلية أخرى على أعمدة تحديد كبيرة منفصلة.بعد ذلك، قم بغسل أعمدة الاستنفاد الكبيرة بميليلتر واحد من المخزن المؤقت MCS وغسل كل عمود تحديد كبير مرتين باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت MCS لكل غسل. تصفية الخلايا من خلال 35 كبسولات مصفاة ميكرولتر في أنابيب FACS مستديرة القاع. أجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الخلايا.ثم، صب ببطء خارج ناظر وداب حافة الأنبوب على ورقة الأنسجة. إعادة تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 300 ميكرولترات من العازلة FACS. أولا، إضافة خمسة microliters من مستقبلات FC الماوس كتلة الكاشف إلى كل أنبوب.احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من حجم CD45 PE سبعة وميكر واحد من CD11B BV421 إلى كل أنبوب. احتضان الأنابيب على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.بعد هذا، إضافة ملليلتر اثنين من المخزن المؤقت FACS لغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الخلايا. Resuspend الخلايا في كل أنبوب مع 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على ميكرولتر واحد من مثبط RNase و 0.5 ميكرولترات من يوديد بروبديسيوم.بعد إجراء FACS القياسية، فرز ميكروجليا حية واحدة مع فوهة 100 ميكرومتر في 96-جيدا لوحات PCR التي تحتوي على أربعة ميكرولترات من العازلة تحلل في كل بئر. دوامة وجيزة لوحات وتدور عليها باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء. تخزين لوحات في ناقص 80 درجة مئوية حتى إعداد المكتبة.عندما تكون جاهزة للمتابعة، اذيب الصحن على الجليد. استخدام دورة حرارية لأداء النسخ الأول لتوليد cDNA وتضخيم cDNA مع إضافية exonuclease خطوة الهضم كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، تنقية cDNA بإضافة 18 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي إلى كل بئر.احتضان لوحة على موقف مغناطيسي لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة نابيرات وغسل العينات مرتين مع الطازجة 80٪ الإيثانول باستخدام 80 ميكرولترات من الإيثانول في بئر لكل غسل. لتنفيذ tagmentation، واستخدام آلة الأنابيب نانولتر لخلط 0.4 ميكرولترات من كل عينة cDNA مع 1.2 ميكرولترات من الكواشف Tn5 tagmentation من عدة إعداد المكتبة في لوحة 384-جيدا في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.لإيقاف رد فعل الضم، أضف 0.4 ميكرولترات من عازلة التحييد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، في 384 فهارس و 1.2 ميكرولترات من PCR مختلطة للعينات وتضخيم المكتبات على النحو المبين في بروتوكول النص. تجمع جميع المكتبات الفردية من نفس لوحة 384-well معا واستخدام الخرز المغناطيسي لتنقية المكتبات المجمعة النهائي.في هذه الدراسة، يتم عزل المايكجليا من القشرة، المخيخ، قرن آمون، و المخطط من نصف الكرة الدماغي للماوس البالغ. يتم فحص تعليق الخلية المعدة تحت المجهر باستخدام الأزرق trypan ومقياس للهيموسيت لتقدير العائد، ونجاعة الخلية، وفعالية إزالة المايلين قبل تنفيذ تلطيخ الأجسام المضادة. يجب أن يكون إجمالي عدد الخلايا في هذه المرحلة أكثر من 30،000 للقشرة وأكثر من 5،000 للأنسجة الأخرى.أكثر من 90٪ من الخلايا يجب أن تكون قابلة للحياة مع حطام الميلين قليلاً. يتم استخدام جهاز FACS لفرز microglia ، والتي عادة ما تكون CD45 منخفضة وD11B إيجابية. وينبغي أن تولد العزلة الناجحة أكثر من 80٪ microglia من أصل جميع الخلايا الحية واحدة، على الأقل بالنسبة للأنسجة القشرية.مرة واحدة يتم التقاط microglia الفردية في العازلة تحلل، يتم تحرير الجيش الملكي النيبالي وعكس في وقت لاحق نسخ إلى cDNA، والتي يتم تضخيمها بعد ذلك لمدة 23 دورة. كمنصة ككهربائية، محلل جزء ومجموعات أجزاء NGS عالية الحساسية توفر معلومات سريعة ودقيقة حول توزيع الحجم، فضلا عن كمية من جزيئات cDNA الموجودة في كل بئر من لوحة 96 جيدا. ويمكن استخدام عينات تظهر مسحة بين 500 و 5000 زوج من أزواج القاعدة، وهي فوق حد تركيز معين لصنع المكتبات.يتم تسلسل العينات إلى عمق أكثر من مليون يقرأ الخام في الخلية الواحدة، مما يشبع قوة الكشف عن منهجية تسلسل الحمض النووي الريبي وحيد الخلية. مع رسم خرائط معدل من تقريبا 60٪ على 2,000 يمكن الكشف عن الجينات لكل خلية ميكروجليال. يتم استنساخ البيانات المنشورة سابقًا التي تم إنشاؤها من طريقة العزل هذه من تجارب مستقلة ، مما يدل على الحساسية للكشف عن الجينات المحددة microglia عبر السكان المتتابعين.مع المعلومات من النسخ microglia واحد، يمكن للباحثين اكتشاف مجموعات الخلايا الفريدة في سياق مصلحتهم، ومواصلة دراسة الأهمية الوظيفية لهذه السكان المحددة حديثا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي الماوس باستخدام الفرز اليدوي وضعف في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

تقييم الحث علي الاكتئاب علي المدى الطويل في شرائح البالغين المخيخار

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...