Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Vi takker Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno og Spyros Darmanis for deres hjælp under udviklingen af denne protokol. Vi takker også Stanford Shared FACS-faciliteten, især Meredith Weglarz og Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart fra Stanford protein og Nucleic Acid facilitet (PAN) for deres store støtte til optagelserne. Dette arbejde finansieres af JPB Foundation og Vincent J. Coates Foundation.

Alle procedurer, der involverer gnavere, er udformet til Stanford University retningslinjer, som er i overensstemmelse med nationale og stats love og politikker. Alle dyreforsøg blev godkendt af Stanford universitetets administrative panel om laboratorie pleje af dyr.
Bemærk: Alle løsninger og buffer kompositioner er angivet i tabel over materialer.
1. forberedelse på dagen for celle isolering
<ol><li>Forbered følgende reagen...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Microglia interagerer aktivt med andre celletyper i CNS, og de er meget følsomme over for miljømæssige stimuli. For at minimere inflammatoriske reaktioner og afvigende ændringer i deres genekspression under isolations processen, er denne protokol blevet strømlinet fra en tidligere offentliggjort metode9, og det er nu egnet til at isolere microglia fra flere regioner af en enkelt mus hjerne halvkugle parallelt. Væv og reagenser holdes ved kold temperatur, og eksperimenter udføres rettidigt (...

Microglia, der repræsenterer 5% − 10% af alle neurale celler, er residente makrofager spredt over hele centralnervesystemet (CNS)1. Beskyttet bag blod-hjerne barrieren, typisk microglia i en sund voksen hjerne indeholder mange fine processer, der hurtigt udvide og trække sig tilbage for at interagere med neuroner og andre gliale celler i parentchyma. Microglia kan også vedtage amoeboid morfologi forbundet med øget Fagocytisk funktion i specifikke udviklingsmæssige stadier eller på immun udfordringer i skade og sygdom1,2,3,4. Nylige spændende opdagelser har klart vist, at microglia er på ingen måde passive tilskuere til hjerne-afledte eller patologiske signaler, men spiller centrale roller i at kontrollere hjernens udvikling og homøostase, for eksempel ved at støtte neuronal overlevelse, beskæring umodne synapser, fremme oligodendrocyte Lineage celler differentiering samt angiogenese1. Som flere funktioner i microglia er belyst, spændingen er yderligere næret af humangenetik undersøgelser, som viste, at mange neurodegenerative sygdomme risiko gener, såsom TREM2, overvejende eller udelukkende udtrykkes ved microglia5,6,7. I betragtning af deres betydning i udvikling og plausible sygdom-kørsel roller, enorm indsats er for nylig blevet sat i retning af vores forståelse af mikroglial gen regulering og funktion i håb om at finde nye terapeutiske mål for Neurodegenerative sygdomme 1,8.
RNA-sekvensering (RNA-SEQ) giver mulighed for objektiv karakterisering af celletype-specifik genekspression, som igen guider forskerne til at undersøge genfunktioner i tætte cellulære netværk7. RNA-SEQ var for det meste udført på bulkprøver, hvilket førte til opdagelsen af en homeostatisk mikroglial gensignatur, der adskiller dem fra andre neurale og immunceller9. Men, en sådan tilgang kunne overse molekylære og funktionelle forskelle mellem microglia, især dem, der forbigående i udvikling, eller forbundet med aldring og sygdom. Enkelt celle-RNA (scrna-SEQ) tilbyder den følsomhed og opløsning, der har revolutioneret feltet ved at afsløre tidligere undervurderet heterogenitet af microglia i en række forskellige sammenhænge2,3,10. På grund af tilstedeværelsen af andre lignende immunceller i CNS-cirkulations interfacet giver scRNA-SEQ oplysninger, der er med til at designe nye værktøjer til at adskille og funktionelt dissekere disse relaterede celler med lidt forudgående viden2,11.
En bred vifte af scRNA-SEQ platforme er blevet opfundet, hver egnet til visse anvendelser12. Generelt, dråbe baserede metoder, såsom 10x Genomics, er højere i gennemløb med (titusinder) af celler sekvenserede i hvert løb, og de er mindre selektive for input, som kan indeholde blandede cellepopulationer, der kræver bred kategorisering. Plade baserede metoder giver højere følsomhed og læse dybde13,14, som regel rettet mod bestemte populationer fra celle sortering for at afsløre subtile forskelle eller sjældne udskrifter. I betragtning af den lille procentdel af mikrogliale celler, især de udviklings-eller sygdomsrelaterede delpopulationer, blandt alle CNS-celletyper, er det ofte ønskeligt at isolere mikroglia fra en bestemt region af interesse og opnå dybe og fuld længde transkriptomic oplysninger for at forstå deres heterogenitet.
Her giver vi oplysninger om, hvordan man isolerer mikroglia fra forskellige mus-hjerneområder, der er dissekeret fra en enkelt halvkugle, som bruges til enkelt celle-RNA-SEQ efter en halvautomatiseret plade baseret forberedelsesprocedure. Den anden halvkugle kan derefter anvendes til histologisk validering. Strømlinet fra en tidligere offentliggjort metode9, denne isolation protokol har til formål at maksimere udbyttet fra små mængde af råvarer, og i mellemtiden opretholde endogene microglial Gen ekspression profiler. Vi bruger fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) til at berige microglia (eller andre relaterede immunceller af interesse) i 96-brønd plader og miniaturize mængderne af reagenser til Biblioteks forberedelse for at øge gennemløb. Vi fremhæver denne følsomme scRNA-SEQ-platform, selv om der kan anvendes andre plade baserede strategier. Denne metode kan let tilpasses til at isolere mikroglia fra andre dissekeret væv, såsom skade eller sygdom Foci, og alder af musen kan variere på tværs af næsten alle postnatale stadier. En effektiv isolering af det regionale mikroglia til undersøgelser af enkelt cellet transkriptomik vil gøre det lettere at forstå deres funktioner inden for sundhed og sygdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Som hjemmehørende makrofager i centralnervesystemet, microglia aktivt kontrollere hjernens udvikling og homøostase, og deres dysfunktioner kan drive sygdomme hos mennesker. Der er gjort betydelige fremskridt for at afdække de molekylære signaturer af homeostatisk mikroglia samt ændringer af deres genekspression som reaktion på miljømæssige stimuli. Med fremkomsten og modning af enkelt-celle genomiske metoder, er det i stigende grad erkendes, at heterogene mikroglia kan ligge til grund for de forskellige roller, de spiller i forskellige udviklingsmæssige og patologiske forhold. Yderligere dissektion af sådanne heterogenitet kan opnås ved effektiv isolering af mikroglia fra en given region af interesse, efterfulgt af følsom profilering af individuelle celler. Her giver vi en detaljeret protokol til hurtig isolering af microglia fra forskellige hjerneområder i en enkelt voksen mus hjerne halvkugle. Vi demonstrerer også, hvordan man bruger disse sorterede mikroglia til plade baseret dyb enkelt celle-RNA-sekvensering. Vi diskuterer tilpasningsevnen af denne metode til andre scenarier og giver retningslinjer for at forbedre systemet til at rumme store undersøgelser.

Denne protokol beskriver en metode til at isolere og sortere mikroglia fra forskellige hjerneområder i en voksen perfbrugt hjerne halvkugle, efterfulgt af scRNA-SEQ. Vi bruger douncing til at skabe enkelt cellesuspension og også som et første skridt til at berige microglia. Utilstrækkelig eller over-douncing reducerer udbyttet. Derudover indeholder voksne musehjerner høje niveauer af myelin, som også kan reducere sorteringseffektivitet og udbytte, hvis det ikke fjernes korrekt. Derfor undersøger vi cellesuspension...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Vi leverer en protokol til isolering af microglia fra forskellige dissekted regioner af en voksen mus hjerne halvkugle, efterfulgt af semi-automatiseret bibliotek forberedelse til dyb single-celle RNA sekvensering af fuld længde transkriptomer. Denne metode vil bidrage til at belyse funktionelle heterogenitet mikroglia i sundhed og sygdom.

Isolering af region-specifikke mikroglia fra en voksen mus hjerne halvkugle for dyb single-celle RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Denne metode giver mulighed for upartisk indfangning af mikroglia-genekspression på et enkeltcelleniveau, hvilket kan hjælpe med at belyse mikroglias molekylære heterogenitet i en sund og syg hjerne. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en detaljeret procedure for hurtig isolering af mikroglia fra forskellige hjerneregioner og viser, hvordan man effektivt generere spillebase encellede RA6 biblioteker for dyb sekventering. For at starte denne procedure skal du forberede alle nødvendige buffere og løsninger som beskrevet i tekstprotokollen og chill dem på is.Efter euthanizing og halshugning musen, bruge små saks til at skære åbne huden på hovedet for at afsløre kraniet nedenunder. Derefter skæres gennem sagittal sutur, lambdoidal sutur, og koronale sutur. Brug scelinter til at trække begge sider af parietal knogle og interparietal knogle uden at beskadige vævet og omhyggeligt flytte hjernen ind i en dissektion Petriskål, der indeholder medium A.Using en pre-kølet klinge, skære hjernen gennem midterlinjen i to halvkugler.Brug nummer 55 kraftang til at adskille lillehjernen fra den kortikale lap og hjernestammen. Brug derefter nummer 55-vices til omhyggeligt at dissekere hippocampus og striatum fra cortex og overføre hvert væv til en separat samling Petriskål. Først skal du bruge et barberblad til at hugge hver hjerneregion i fine stykker, der er mindre end en kubikmeter.Ved hjælp af en en milliliter pipette med spidsen afskåret, overføre væv stykker i forkølet Dounce homogenisatorer. Homogeniser vævet ved langsomt at dreje stemplet ind og ud af Dounce homogenisatoren i seks til 10 fulde slag, indtil der ikke er synlige stykker til stede. Derefter overføres de dissocierede væv til 50 milliliterrør gennem 70 mikrometerspatorer.Skyl hver Dounce homogenisator og stempel med i alt seks milliliter koldt medium A derefter overføre skylningen til en 15 milliliter rør til centrifugering. Centrifuge encellede suspension ved 400 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter med en pause på fem. Skyl en stor udtyndingssøjle og tre store markeringssøjler i en magnetisk separator med tre milliliter MCS.Når centrifugering for vævsprøverne er afsluttet, pipettes ud og kassere supernatant uden at forstyrre pellet. Opsaltning af cellerne i MCS-bufferen, der indeholder RNase-hæmmer. Der tilsættes 100 mikroliter myelinfjernede perler til hvert rør, der indeholder re-suspenderede celler fra cortex og cerebellum, og der tilsættes 50 mikroliter myelinfjernede perler til hvert af rørene, der indeholder re-suspenderede celler fra hippocampus og striatum.Inkuber rørene på is i 10 minutter. Derefter tilsættes MCS til røret, der indeholder kortikale celler, for at bringe dets volumen op til to milliliter og til de resterende rør for at bringe hvert af deres volumen op på en milliliter. Når kolonnerne er tomme af skyllebuffer, skal du lægge to milliliter kortikale celler på den store udtyndingskolonne og en milliliter af hinandens cellesuspension på separate store markeringskolonner.Dernæst vaskes de store udtyndingssøjler med en milliliter MCS-buffer, og vask hver stor markeringskolonne to gange ved hjælp af en milliliter MCS-buffer for hver vask. Cellerne filtreres gennem 35 mikroliterstænshætter i FACS-rør i runde bund. Centrifuge disse rør ved 400 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter for at pellet cellerne.Derefter langsomt hælde ud supernatant og dab kanten af røret på silkepapir. Opslæmmede cellerne i hvert rør med 300 mikroliter FACS-buffer. Først tilsættes fem mikroliter af mus FC receptorer blokere reagens til hvert rør.Inkuber på is i fem minutter. Derefter tilsættes en mikroliter af CD45 PE størrelse syv og en mikroliter cd11B BV421 til hvert rør. Slangerne inkuberes på en rystelse ved stuetemperatur i 10 minutter.Derefter tilsættes to milliliter FACS-buffer til vask. Centrifuge ved 400 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter for at pellet cellerne. Cellerne i hvert rør resuspenerede cellerne i hvert rør med 400 mikroliter FACS-buffer, der indeholder en mikroliter RNase-hæmmer og 0,5 mikroliter propidiumidodid.Efter standard FACS procedure, sortere enkelt levende mikroglia med en 100 mikrometer dyse i 96-brønd PCR plader, der indeholder fire mikroliter lysis buffer i hver brønd. Kort vortex pladerne og drej dem ned ved hjælp af en bænk top centrifuge. Opbevar pladerne på minus 80 grader Celsius indtil bibliotekets forberedelse.Når du er klar til at fortsætte, tø pladen på is. Brug en termisk cycler til at udføre en første transskription til at generere cDNA og forstærke cDNA med en ekstra exonuclease fordøjelse trin som skitseret i tekstprotokollen. Efter dette rense cDNA ved at tilføje 18 mikroliter af magnetiske perler til hver brønd.Inkuber pladen på en magnetisk stander i fem minutter. Fjern derefter supernatanten og vask prøverne to gange med frisklavet 80% ethanol med 80 mikroliter ethanol pr. brønd for hver vask. For at udføre tagmentation skal du bruge en nanoliterrørende maskine til at blande 0,4 mikroliter af hver cDNA-prøve med 1,2 mikroliter Tn5-tagmentation reagenser fra bibliotekets forberedelsessæt i en 384-brøndplade ved 55 grader Celsius i 10 minutter.For at stoppe tagmentationsreaktionen tilsættes 0,4 mikroliter neutraliseringsbuffer ved stuetemperatur i fem minutter. Dernæst ved 384 indekser og 1,2 mikroliter PCR blandet til prøverne og forstærke bibliotekerne som skitseret i tekstprotokollen. Pool alle de enkelte biblioteker fra den samme 384-brønd plade sammen og bruge magnetiske perler til at rense den endelige pooled biblioteker.I denne undersøgelse, mikroglia er isoleret fra cortex, lillehjernen, hippocampus, og striatum af en voksen mus hjernehalvdel. Den forberedte celle suspension undersøges under et mikroskop ved hjælp af trypan blå og et hæmocytometer til at vurdere udbyttet, celle levedygtighed, og effekten af myelin fjernelse før du udfører antistof farvning. Samlede celletal på dette punkt bør være over 30,000 for cortex og over 5, 000 for de andre væv.Over 90% af cellerne skal være levedygtige med lidt myelin snavs. En FACS maskine bruges til at sortere mikroglia, som typisk er CD45 lav og CD11B positiv. Vellykket isolation bør generere over 80% mikroglia ud af alle levende enkelt-celler, i det mindste for det kortikale væv.Når individuelle mikroglia er fanget i lysis buffer, RNA frigives og efterfølgende omvendt transskriberes til cDNA, som derefter forstærkes til 23 cyklusser. Som kapillær elektroforese platform, fragment analysator og høj-følsomme NGS fragment kits giver hurtig og præcis information om størrelsesfordeling, samt mængden af cDNA molekyler til stede i hver brønd af en 96-brønd plade. Prøver, der viser en udtværing mellem 500 og 5, 000 base par og er over en vis koncentration tærskel kan bruges til at gøre biblioteker.Prøverne er sekvenseret til en dybde på over en million rå læser pr celle, hvilket mætter detektionseffekten af enkeltcelle-RNA-sekventeringsmetoden. Med en kortlægningshastighed på ca. 60 % over 2 kan der detekteres 000 gener pr. mikroglial celle. Tidligere offentliggjorte data genereret fra denne isolationsmetode er gengivet fra uafhængige eksperimenter, der viser følsomheden for påvisning af mikrogliaspecifikke gener på tværs af den sekvenserede population.Med oplysninger om enkelte mikroglia transskriptioner, kan forskerne opdage de unikke cellepopulationer i forbindelse med deres interesse, og yderligere undersøgelse af den funktionelle relevans af disse nyligt identificerede populationer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Ikke-Laser Capture Mikroskopi Tilgang til mikrodissektion af diskrete Mouse Brain Regioner for Total RNA Isolation og downstream næste generation sekventering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og Isolation af musen primære mikroglia ved tæthed Gradient centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation og RNA udvinding af neuroner, makrofager og mikroglia fra larve zebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolering af voksen rygmarven kerner for massivt Parallel Single-kernen RNA sekventering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Encellede RNA sekventering af Fluorescently mærket mus neuroner ved hjælp af manuel sortering og dobbelt In Vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...