Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Wir danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno und Spyros Darmanis für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken auch der Stanford Shared FACS Facility, insbesondere Meredith Weglarz und Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart von Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) für ihre große Unterstützung bei den Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von der JPB Foundation und der Vincent J. Coates Foundation finanziert.

Alle Verfahren, an denen Nagetiere beteiligt sind, entsprachen den Richtlinien der Stanford University, die den nationalen und staatlichen Gesetzen und Richtlinien entsprechen. Alle Tierverfahren wurden vom Verwaltungsgremium für Labortierpflege der Stanford University genehmigt.
HINWEIS: Alle Lösungs- und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle der Materialienenthalten.
1. Vorbereitung am Tag der Zellisolierung
<ol><li>Bereiten...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Mikroglia interagieren aktiv mit anderen Zelltypen im ZNS und sind sehr empfindlich auf Umweltreize reagieren. Um Entzündungsreaktionen und abnorme Veränderungen in ihrer Genexpression während des Isolationsprozesses zu minimieren, wurde dieses Protokoll von einer zuvor veröffentlichten Methode9gestrafft und ist nun geeignet, Mikroglia aus mehreren Regionen einer einzelnen Maushirnhälfte parallel zu isolieren. Die Gewebe und Reagenzien werden bei kalter Temperatur gehalten und Experimente wer...

Mikroglia, die 5 % der Nervenzellen ausmacht, sind über das zentralnervousische System (ZNS) verstreuteMakrophagen. Geschützt hinter Blut - Hirn-Schranke, typische Mikroglia in einem gesunden erwachsenen Gehirn enthalten viele feine Prozesse, die schnell erweitern und zurückziehen, um mit Neuronen und anderen Gliazellen im Parenchym interagieren. Microglia kann auch die amoemoide Morphologie annehmen, die mit einer erhöhten phagozytischen Funktion in bestimmten Entwicklungsstadien oder bei Immunherausforderungen bei Verletzungen und Krankheiten1,2,3,4verbunden ist. Jüngste spannende Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Mikroglia keineswegs passive Zuschauer von hirnabgeleiteten oder pathologischen Signalen sind, sondern eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Gehirnentwicklung und Homöostase spielen, beispielsweise durch die Unterstützung des neuronalen Überlebens, das Beschnitt unreifer Synapsen, die Förderung der Differenzierung von Oligodendrozyten-Linienzellen sowie die Angiogenese1. Da mehr Funktionen von Mikroglia aufgeklärt werden, wird die Aufregung durch humangenetische Studien weiter angeheizt, die zeigten, dass viele neurodegenerative Krankheitsrisikogene, wie TREM2, überwiegend oder ausschließlich durch Mikroglia5,6,7ausgedrückt werden. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und der plausiblen rolle der Krankheit wurden in letzter Zeit enorme Anstrengungen unternommen, um unser Verständnis der mikroglialen Genregulation und -funktion zu verstehen, in der Hoffnung, neue therapeutische Ziele für neurodegenerative Erkrankungen zu finden1,8.
Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ermöglicht eine unvoreingenommene Charakterisierung der zelltypspezifischen Genexpression, was wiederum Wissenschaftler bei der Untersuchung von Genfunktionen in dichten Zellnetzen leitet7. RNA-seq wurde hauptsächlich auf Massenproben durchgeführt, was zur Entdeckung einer panostatischen mikrogliaalen Gensignatur führte, die sie von anderen neuronalen und Immunzellen unterscheidet9. Ein solcher Ansatz könnte jedoch molekulare und funktionelle Unterschiede zwischen Mikroglia übersehen, insbesondere solche, die vorübergehend in der Entwicklung vorhanden sind oder mit Alterung und Krankheit in Verbindung gebracht werden. Tatsächlich bietet einzellige RNA-seq (scRNA-seq) die Empfindlichkeit und Auflösung, die das Feld revolutioniert haben, indem sie zuvor unterschätzte Heterogenität von Mikroglia in einer Vielzahl von Kontexten2,3,10. Darüber hinaus liefert scRNA-seq aufgrund des Vorhandenseins anderer ähnlicher Immunzellen an der CNS-Zirkulationsschnittstelle Informationen, die das Design neuer Werkzeuge unterstützen, um diese verwandten Zellen mit wenig Vorkenntnissen zu trennen und funktionell zu sezieren2,11.
Es wurde eine Vielzahl von scRNA-seq-Plattformen erfunden, die jeweils für bestimmte Anwendungen geeignet sind12. Im Allgemeinen sind tröpfchenbasierte Methoden, wie z. B. 10x Genomics, höher im Durchsatz mit (Zehntausenden) Tausenden von Zellen, die in jedem Durchlauf sequenziert werden, und sie sind weniger selektiv für die Eingabe, die gemischte Zellpopulationen enthalten kann, die eine umfassende Kategorisierung erfordern. Plattenbasierte Methoden bieten eine höhere Empfindlichkeit und Lesetiefe13,14, in der Regel auf bestimmte Populationen aus der Zellsortierung abzielen, um subtile Unterschiede oder seltene Transkripte aufzudecken. Angesichts des geringen Anteils mikrogliar alataler Zellen, insbesondere dieser entwicklungs- oder krankheitsassoziierten Subpopulationen, unter allen ZNS-Zelltypen ist es oft wünschenswert, Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion zu isolieren und tiefe und umfassende transkriptomische Informationen zu erhalten, um ihre Heterogenität zu verstehen.
Hier bieten wir Details, wie Mikroglia aus verschiedenen Maushirnregionen isoliert werden kann, die von einer einzigen Hemisphäre seziert werden, die nach einem halbautomatischen plattenbasierten Bibliotheksvorbereitungsverfahren für einzellige (oder Massen-) RNA-Seq verwendet werden. Die andere Hemisphäre kann dann für die histologische Validierung verwendet werden. Optimiert von einer zuvor veröffentlichten Methode9zielt dieses Isolationsprotokoll darauf ab, den Ertrag aus einer geringen Menge an Ausgangsmaterialien zu maximieren und in der Zwischenzeit endogene mikrogliaale Genexpressionsprofile zu pflegen. Wir verwenden fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um Mikroglia (oder andere verwandte Immunzellen von Interesse) in 96-Well-Platten anzureichern und die Volumen von Reagenzien für die Bibliotheksvorbereitung zu miniaturisieren, um den Durchsatz zu erhöhen. Wir heben diese sensible scRNA-seq-Plattform hervor, obwohl andere plattenbasierte Strategien angewendet werden können. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Mikroglia von anderen sezierten Geweben zu isolieren, wie Verletzungen oder Krankheitsherde, und das Alter der Maus kann in fast jedem postnatalen Stadium variieren. Eine effiziente Isolierung regionaler Mikroglia für einzellige Transkriptomikstudien wird ein besseres Verständnis ihrer Funktionen bei Gesundheit und Krankheit erleichtern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Als ansässige Makrophagen im zentralen Nervensystem, Mikroglia aktiv Steuern gehirnentwicklung und Homöostase, und ihre Funktionsstörungen können menschliche Krankheiten antreiben. Erhebliche Fortschritte wurden gemacht, um die molekularen Signaturen von heimostatischen Mikroglia sowie Veränderungen ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize aufzudecken. Mit dem Aufkommen und der Reifung einzelliger genomischer Methoden wird zunehmend erkannt, dass heterogene Mikroglia den unterschiedlichen Rollen zugrunde liegen können, die sie in verschiedenen entwicklungs- und pathologischen Bedingungen spielen. Eine weitere Zerlegung einer solchen Heterogenität kann durch eine effiziente Isolierung von Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion erreicht werden, gefolgt von einer sensiblen Profilierung einzelner Zellen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer einzigen erwachsenen Maus-Gehirnhälfte. Wir zeigen auch, wie diese sortierten Mikroglia für die plattenbasierte tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung verwendet werden. Wir diskutieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an andere Szenarien und stellen Richtlinien für die Verbesserung des Systems für groß angelegte Studien bereit.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer erwachsenen perfundierten Gehirnhälfte zu isolieren und zu sortieren, gefolgt von scRNA-seq. Wir verwenden Douncing, um einzellige Suspension zu erstellen und auch als ersten Schritt, um Mikroglia zu bereichern. Unzureichende oder überdouncing reduziert die Ausbeute. Darüber hinaus enthalten erwachsene Mausgehirne hohe Myelinspiegel, die auch die Sortiereffizienz reduzieren und nachgeben können, wenn sie nicht richtig entfe...

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Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Diese Methode ermöglicht eine unvoreingenommene Kapturisierung der Mikroglia-Genexpression auf einzelzelligem Niveau, was dazu beitragen kann, die molekulare Heterogenität von Mikroglia in einem gesunden und kranken Gehirn aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein detailliertes Verfahren für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Gehirnregionen bietet und zeigt, wie man effizient Spielbasis der einzelligen RA6-Bibliotheken für die tiefe Sequenzierung generiert. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle erforderlichen Puffer und Lösungen, wie im Textprotokoll beschrieben, vor und kühlen Sie sie auf Eis.Nach der Einschläferung und Enthauptung der Maus, verwenden Sie kleine Schere, um die Haut auf dem Kopf zu schneiden, um den Schädel darunter zu belichten. Dann durchschneiden Sie die sagittale Naht, Lambdoidal Naht, und koronare Naht. Verwenden Sie Zangen, um beide Seiten des parietalen Knochens und interparietalen Knochens abzuziehen, ohne das Gewebe zu beschädigen, und bewegen Sie das Gehirn vorsichtig in eine Sezier-Petrischale, die das Medium A enthält.Verwenden Sie die Nummer 55 Zangen, um das Kleinhirn vom kortikalen Lappen und dem Hirnstamm zu trennen. Verwenden Sie dann die Nummer 55 Zangen, um den Hippocampus und das Striatum vorsichtig aus dem Kortex zu sezieren und jedes Gewebe in eine separate Sammlung Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie zunächst eine Rasierklinge, um jede Hirnregion in feine Stücke zu hacken, die weniger als einen Kubikmillimeter betragen.Mit einer Ein-Milliliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze die Gewebeteile in vorgekühlte Dounce-Homogenisatoren übertragen. Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie den Kolben langsam in und aus dem Dounce Homogenisator für sechs bis zehn volle Striche verdrehen, bis keine sichtbaren Brocken vorhanden sind. Dann übertragen Sie die dissoziierten Gewebe in 50 Milliliter-Röhren durch 70 Mikrometer Siebe.Spülen Sie jeden Dounce Homogenisator und Kolben mit der Gesamtsumme von sechs Milliliter kaltem Medium A und übertragen Sie die Spülung dann auf ein 15 Milliliter Rohr für die Zentrifugation. Zentrifugen-Einzelzellsuspension bei 400 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten mit einer Pause bei fünf. Spülen Sie eine große Erschöpfungssäule und drei große Auswahlsäulen in einem magnetischen Separator mit drei MilliliterMCS.Wenn die Zentrifugation für die Gewebeproben abgeschlossen ist, Pipette aus und entsorgen Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie die Zellen im MCS-Puffer, der RNase-Inhibitor enthält, wieder aus. Fügen Sie 100 Mikroliter Myelin-Entfernungsperlen zu jeder Röhre hinzu, die resuspendierte Zellen aus der Kortex und im Kleinhirn enthält, und fügen Sie 50 Mikroliter Myelinentfernungsperlen zu jedem der Röhren hinzu, die resuspendierte Zellen aus dem Hippocampus und Striatum enthalten.Die Rohre 10 Minuten auf Eis bebrüten. Danach fügen Sie MCS in das Rohr mit kortikalen Zellen, um sein Volumen auf zwei Milliliter zu bringen und zu den verbleibenden Röhren, um jedes ihrer Volumen bis zu einem Milliliter zu bringen. Sobald die Spalten leer vom Spülpuffer sind, laden Sie zwei Milliliter kortikaler Zellen auf die große Erschöpfungssäule und einen Milliliter voneinander Zellsuspension auf separate große Auswahlspalten.Als nächstes waschen Sie die großen Erschöpfungssäulen mit einem Milliliter MCS-Puffer und waschen Sie jede große Selektionssäule zweimal mit einem Milliliter MCS-Puffer für jede Wäsche. Filtern Sie die Zellen durch 35 Mikroliter Siebkappen in rund-bodenige FACS-Röhren. Zentrifugieren Sie diese Rohre bei 400 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet.Dann gießen Sie langsam den Überstand aus und tupfen sie den Rand des Rohres auf Tissuepapier aus. Setzen Sie die Zellen in jedem Rohr mit 300 Mikroliter FACS-Puffer wieder aus. Fügen Sie zunächst fünf Mikroliter Maus FC-Rezeptoren Block Reagenz zu jeder Röhre.Fünf Minuten auf Eis bebrüten. Dann fügen Sie einen Mikroliter CD45 PE Größe sieben und ein Mikroliter CD11B BV421 zu jeder Röhre hinzu. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Shaker bei Raumtemperatur für 10 Minuten.Fügen Sie danach zwei Milliliter FACS-Puffer zum Waschen hinzu. Zentrifugieren Bei 400 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet. Setzen Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit 400 Mikroliter FACS-Puffer, der einen Mikroliter RNase-Inhibitor und 0,5 Mikroliter Propidiumjodid enthält, wieder ab.Nach dem Standard-FACS-Verfahren sortieren Sie einzelne Lebende Mikroglia mit einer 100-Mikrometer-Düse in 96-Well-PCR-Platten, die jeweils vier Mikroliter Lysepuffer in jedem Brunnen enthalten. Wirbeln Sie die Platten kurz an und drehen Sie sie mit einer Tischzentrifuge nach unten. Bewahren Sie die Platten bei minus 80 Grad Celsius bis zur Bibliotheksvorbereitung auf.Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie die Platte auf Eis auf. Verwenden Sie einen thermischen Cycler, um eine erste Transkription durchzuführen, um cDNA zu erzeugen und die cDNA mit einem zusätzlichen Exonuklease-Verdauungsschritt zu verstärken, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach reinigen Sie die cDNA, indem Sie jedem Brunnen 18 Mikroliter Magnetperlen hinzufügen.Inkubieren Sie die Platte auf einem magnetischen Ständer für fünf Minuten. Dann entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben zweimal mit frisch hergestelltem 80%Ethanol mit 80 Mikroliter Ethanol pro Brunnen für jede Wäsche. Um die Tagmentierung durchzuführen, verwenden Sie eine Nanoliter-Pipettiermaschine, um 0,4 Mikroliter jeder cDNA-Probe mit 1,2 Mikroliterteinen Tn5-Tagmentationsreagenzien aus dem Bibliotheksvorbereitungskit in einer 384-Well-Platte bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten zu mischen.Um die Tagmentationsreaktion zu stoppen, fügen Sie 0,4 Mikroliter Neutralisationspuffer bei Raumtemperatur für fünf Minuten hinzu. Als nächstes werden bei 384 Indizes und 1,2 Mikroliter PCR zu den Samples gemischt und die Bibliotheken wie im Textprotokoll beschrieben verstärkt. Bündeln Sie alle einzelnen Bibliotheken aus der gleichen 384-Well-Platte zusammen und verwenden Sie magnetische Perlen, um die letzten gepoolten Bibliotheken zu reinigen.In dieser Studie werden Mikroglia aus dem Kortex, Kleinhirn, Hippocampus und Striatum der Gehirnhälfte einer erwachsenen Maus isoliert. Die vorbereitete Zellsuspension wird unter dem Mikroskop mit Trypanblau und einem Hämozytometer untersucht, um die Ausbeute, Zelllebensfähigkeit und Wirksamkeit der Myelinentfernung vor der Durchführung von Antikörperfärbungen zu schätzen. Die Gesamtzahl der Zellwerte sollte zu diesem Zeitpunkt über 30.000 für den Kortex und über 5 000 für die anderen Gewebe betragen.Über 90% der Zellen sollten mit wenig Myelin-Trümmern lebensfähig sein. Eine FACS-Maschine wird verwendet, um die Mikroglia zu sortieren, die in der Regel CD45 niedrig und CD11B positiv sind. Eine erfolgreiche Isolierung sollte über 80% Mikroglia aus allen lebenden Einzelzellen erzeugen, zumindest für das kortikale Gewebe.Sobald einzelne Mikroglia in den Lysepuffer eingefangen werden, wird RNA freigesetzt und anschließend in cDNA umgeschrieben, die dann für 23 Zyklen verstärkt wird. Als Kapillarelektrophorese-Plattform liefern der Fragmentanalysator und die hochempfindlichen NGS-Fragmentkits schnelle und genaue Informationen über die Größenverteilung sowie die Menge der cDNA-Moleküle, die in jedem Brunnen einer 96-Well-Platte vorhanden sind. Proben, die einen Abstrich zwischen 500 und 5 000 Basenpaaren zeigen und einen bestimmten Konzentrationsschwellenwert überschreiten, können verwendet werden, um Bibliotheken herzustellen.Die Proben werden bis zu einer Tiefe von über einer Million Rohlesevorgängen pro Zelle sequenziert, was die Detektionsleistung der einzelligen RNA-Sequenzierungsmethode sätttigt. Mit einer Kartierungsrate von ca. 60% über 2.000 Genen kann pro Mikrogliazelle nachgewiesen werden. Zuvor veröffentlichte Daten, die aus dieser Isolationsmethode generiert wurden, werden aus unabhängigen Experimenten reproduziert, was die Empfindlichkeit für den Nachweis mikrogliaspezifischer Gene in der sequenzierten Population demonstriert.Mit den Informationen einzelner Mikroglia-Transkriptionen können Forscher die einzigartigen Zellpopulationen im Kontext ihres Interesses entdecken und die funktionelle Relevanz dieser neu identifizierten Populationen weiter untersuchen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Forschung

Neurowissenschaften

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...