Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Ringraziamo Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis per il loro aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche lo Stanford Shared FACS Facility, in particolare Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart di Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) per il loro grande supporto per le riprese. Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione JPB e dalla Fondazione Vincent J. Coates.

Tutte le procedure che coinvolgono roditori sono conformi alle linee guida della Stanford University, che rispettano le leggi e le politiche nazionali e statali. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio.
 NOT:</</c0> Tutte le composizioni di soluzioni e buffer sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione il giorno ...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Microglia interagiscono attivamente con altri tipi di cellule nel SNC, e sono molto sensibili agli stimoli ambientali. Al fine di ridurre al minimo le risposte infiammatorie e i cambiamenti aberranti nella loro espressione genica durante il processo di isolamento, questo protocollo è stato semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 ed è ora adatto per isolare la microglia da più regioni di un singolo emisfero cerebrale del topo in parallelo. I tessuti e i reagenti sono tenuti a temper...

Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)1. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie1,2,3,4. Recenti scoperte entusiasmanti hanno chiaramente dimostrato che le microglia non sono affatto astanti passivi a segnali derivati dal cervello o patologici, ma svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo cerebrale e dell'omeostasi, ad esempio, sostenendo la sopravvivenza neuronale, potando sinapsi immature, promuovendo la differenziazione delle cellule lignaggio oligodocito e l'asgiogenesi1 . Man mano che le funzioni della microglia sono chiarite, l'eccitazione è ulteriormente alimentata da studi di genetica umana, che hanno dimostrato che molti geni del rischio di malattie neurodegenerative, come TREM2, sono prevalentemente o esclusivamente espressi da microglia5,6,7. Data la loro importanza nello sviluppo e nei plausibili ruoli guidati dalle malattie, recentemente è stato compiuto un enorme sforzo verso la nostra comprensione della regolazione genica microgliale e della funzione nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative1,8.
Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente una caratterizzazione imparziale dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, che a sua volta guida gli scienziati a studiare le funzioni geniche nelle reti cellulari dense7. L'RNA-seq era stato fatto per lo più su campioni sfusi, portando alla scoperta di una firma del gene microgliale omeostatica che li distingue da altre cellule neurali e immunitarie9. Tuttavia, un tale approccio potrebbe trascurare le differenze molecolari e funzionali tra le microglia, in particolare quelle temporanee presenti in fase di sviluppo o associate all'invecchiamento e alla malattia. Infatti, RNA-seq unicellulare (scRNA-seq) offre la sensibilità e la risoluzione che hanno rivoluzionato il campo rivelando l'eterogeneità della microglia precedentemente sottovalutata in una varietà di contesti2,3,10. Inoltre, a causa della presenza di altre cellule immunitarie simili all'interfaccia di circolazione del CNS, scRNA-seq fornisce informazioni che aiutano la progettazione di nuovi strumenti per separare e sezionare funzionalmente queste cellule correlate con poca conoscenza precedente2,11.
È stata inventata una vasta gamma di piattaforme scRNA-seq, ognuna adatta per determinate applicazioni12. In generale, i metodi basati sulle goccioline, come 10x Genomica, sono più elevati in termini di produttività con (decine di) migliaia di cellule sequenziate in ogni esecuzione e sono meno selettivi per l'input che può contenere popolazioni di cellule miste che richiedono un'ampia categorizzazione. I metodi a base di piastre forniscono una maggiore sensibilità e profondità di lettura13,14, di solito mirando a popolazioni specifiche dallo smistamento delle cellule per rivelare sottili differenze o trascrizioni rare. Data la piccola percentuale di cellule microgliali, in particolare quelle sottopopolazioni associate allo sviluppo o alla malattia, tra tutti i tipi di cellule SNC, è spesso auspicabile isolare la microglia da una specifica regione di interesse e ottenere informazioni trascrittomiche profonde e complete per comprenderne l'eterogeneità.
Qui, forniamo dettagli su come isolare microglia da diverse regioni del cervello del topo sezionate da un singolo emisfero, che vengono utilizzate per l'RNA-seq a singola cellula (o alla rinfusa) seguendo una procedura di preparazione della libreria semi-automatica basata su lamiere. L'altro emisfero può quindi essere utilizzato per la convalida istologica. Semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 , questo protocollo di isolamento mira a massimizzare la resa da piccole quantità di materiali di partenza, e nel frattempo mantenere profili di espressione genica microgliale endogeni. Utilizziamo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire la microglia (o altre cellule immunitarie correlate di interesse) in piastre di 96 pozze e diimentare i volumi di reagenti per la preparazione della biblioteca al fine di aumentare la produttività. Mettiamo in evidenza questa piattaforma scRNA-seq sensibile, anche se possono essere applicate altre strategie basate su piastre. Questo metodo può essere facilmente adattato per isolare microglia da altri tessuti sezionati, come lesioni o foci di malattia, e l'età del topo può variare in quasi tutti gli stadi postnatali. L'isolamento efficiente della microglia regionale per gli studi sulla trascrittomica a una cellula faciliterà una migliore comprensione delle loro funzioni in materia di salute e malattia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Come macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, microglia controllano attivamente lo sviluppo cerebrale e l'omeostasi, e le loro disfunzioni possono guidare le malattie umane. Sono stati compiuti notevoli progressi per scoprire le firme molecolari della microglia omeostatica e le alterazioni della loro espressione genica in risposta agli stimoli ambientali. Con l'avvento e la maturazione delle metodologie genomiche unicellulari, è sempre più riconosciuto che la microglia eterogina può essere alla base dei diversi ruoli che svolgono in diverse condizioni di sviluppo e patologiche. Un'ulteriore dissezione di tale eterogeneità può essere ottenuta attraverso un isolamento efficiente delle microglia da una determinata regione di interesse, seguito da una profilazione sensibile delle singole cellule. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il rapido isolamento della microglia da diverse regioni del cervello in un singolo emisfero certo adulto. Dimostriamo anche come utilizzare queste microglia ordinate per il sequenziamento profondo dell'RNA a cellule a base di piastre. Discutiamo l'adattabilità di questo metodo ad altri scenari e forniamo linee guida per migliorare il sistema per accogliere studi su larga scala.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e ordinare microglia da diverse regioni del cervello in un emisfero cerebrale perfuso adulto, seguito da scRNA-seq. Usiamo il douncing per creare sospensioni a singola cellula e anche come primo passo per arricchire la microglia. Insufficiente o sovradosso riduce la resa. Inoltre, cervelli di topi adulti contengono alti livelli di mielina, che può anche ridurre l'efficienza di selezione e la resa se non rimosso correttamente. Pertanto, esaminiamo la sospensione cellulare ...

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Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Questo metodo consente la cattura imparziale dell'espressione genica della microglia a un livello a singola cellula, che può aiutare a chiarire l'eterogeneità molecolare delle microglia in un cervello sano e mato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una procedura dettagliata per un rapido isolamento delle microglia da diverse regioni cerebrali e mostra come generare in modo efficiente la base di riproduzione delle librerie RA6 a cella singola per il sequenziamento profondo. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i buffer e le soluzioni necessari come delineato nel protocollo di testo e raffreddarli sul ghiaccio.Dopo aver eutanasiato e decapitato il topo, usa piccole forbici per aprire la pelle sulla testa per esporre il cranio sottostante. Quindi, tagliare la sutura sagittale, la sutura lambdoidale e la sutura coronale. Utilizzare le forcelle per estrarre entrambi i lati dell'osso parietale e dell'osso interparietale senza danneggiare il tessuto e spostare attentamente il cervello in una piastra di Petri di dissezione contenente il mezzo A.Utilizzando una lama pre-refrigerata, tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi.Utilizzare le forcep numero 55 per separare il cervelletto dal lobo corticale e dal tronco encefalico. Quindi, utilizzare le forcelle numero 55 per sezionare attentamente l'ippocampo e lo striato dalla corteccia e trasferire ogni tessuto in una piastra di Petri di raccolta separata. Per prima cosa, usa una lama di rasoio per tagliare ogni regione cerebrale in pezzi fini inferiori a un millimetro cubo.Utilizzando una pipetta da un millilitro con la punta tagliata, trasferire i pezzi di tessuto in omogeneizzatori Dounce pre-refrigerati. Omogeneizzare il tessuto ruotando lentamente il pistone all'interno e all'uscita dall'omogeneizzatore Dounce per sei-10 tratti completi fino a quando non sono presenti pezzi visibili. Quindi, trasferire i tessuti dissociati in tubi da 50 millilitri attraverso filtri da 70 micrometri.Risciacquare ogni omogeneizzatore e pistone Dounce con un totale di sei millilitri di mezzo freddo A, quindi trasferire il risciacquo in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione. Centrifuga la sospensione a cella singola a 400 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti con una pausa a cinque. Risciacquare una grande colonna di esaurimento e tre grandi colonne di selezione in un separatore magnetico con tre millilitri di MCS.Quando la centrifugazione per i campioni di tessuto è completa, pipettare fuori e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Rimescolare le cellule nel buffer MCS che contiene l'inibitore della RNasi. Aggiungere 100 microlitri di perline di rimozione della mielina a ciascun tubo contenenti cellule ri-sospese dalla corteccia e dal cervelletto e aggiungere 50 microlitri di perline di rimozione della mielina a ciascuno dei tubi contenenti cellule ri-sospese dall'ippocampo e dallo striato.Incubare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, aggiungere MCS al tubo contenente celle corticali per portare il suo volume fino a due millilitri e ai tubi rimanenti per portare ciascuno dei loro volumi fino a un millilitro. Una volta che le colonne sono vuote di tampone di risciacquo, caricare due millilitri di celle corticali sulla colonna di esaurimento di grandi dimensioni e un millilitro l'uno dell'altro sospensione cellulare su colonne di selezione di grandi dimensioni separate.Successivamente, lavare quelli di grandi colonne di esaurimento con un millilitro di buffer MCS e lavare due volte ogni colonna di selezione di grandi dimensioni utilizzando un millilitro di buffer MCS per ogni lavaggio. Filtrare le celle attraverso tappi filtranti a 35 microliter in tubi FACS a fondo tondo. Centrifuga questi tubi a 400 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellettare le cellule.Quindi, versare lentamente il supernatante e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Rimospendare le celle in ogni tubo con 300 microlitri di tampone FACS. In primo luogo, aggiungere cinque microlitri dei recettori FC del mouse bloccano il reagente a ciascun tubo.Incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, aggiungere un microlitro di FORMATO CD45 PE sette e un microlitro di CD11B BV421 a ciascun tubo. Incubare i tubi su uno shaker a temperatura ambiente per 10 minuti.Dopo questo, aggiungere due millilitri di tampone FACS da lavare. Centrifugare a 400 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellettare le cellule. Rimescolare le cellule in ogni tubo con 400 microlitri di tampone FACS contenenti un microlitro di inibitore della RNasi e 0,5 microlitri di ioduro di propidio.Seguendo la procedura FACS standard, ordinare singole microglia vive con un ugello da 100 micrometri in piastre PCR da 96 po 'che contengono quattro microlitri di tampone di lisi in ogni pozzo. Vortice brevemente le piastre e farle girare verso il basso usando una centrifuga da banco. Conservare le piastre a meno 80 gradi Celsius fino alla preparazione della libreria.Quando è pronto per procedere, scongelare il piatto sul ghiaccio. Utilizzare un ciclore termico per eseguire una prima trascrizione per generare cDNA e amplificare il cDNA con un ulteriore passaggio di digestione dell'esonucleasi come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, purificare il cDNA aggiungendo 18 microlitri di perline magnetiche ad ogni pozzo.Incubare la piastra su un supporto magnetico per cinque minuti. Quindi, rimuovere il supernatante e lavare i campioni due volte con etanolo appena fatto all'80% utilizzando 80 microlitri di etanolo per pozzo per ogni lavaggio. Per eseguire la tagmentazione, utilizzare una pipettatrice nanoliter per mescolare 0,4 microlitri di ogni campione di cDNA con 1,2 microlitri di reagenti di tagmentazione Tn5 dal kit di preparazione della libreria in una piastra da 384 pozzetti a 55 gradi Celsius per 10 minuti.Per interrompere la reazione di tagmentazione, aggiungere 0,4 microlitri di tampone di neutralizzazione a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, con 384 indici e 1,2 microlitri di PCR mescolati ai campioni e amplificando le librerie come delineato nel protocollo di testo. Raggruppa tutte le singole librerie dalla stessa piastra da 384 po 'e usa perline magnetiche per purificare le librerie in pool finali.In questo studio, le microglia sono isolate dalla corteccia, dal cervelletto, dall'ippocampo e dallo striato dell'emisfero cerebrale di un topo adulto. La sospensione cellulare preparata viene esaminata al microscopio utilizzando tripano blu e un emocitometro per stimare la resa, la vitalità cellulare e l'efficacia della rimozione della mielina prima di eseguire la colorazione degli anticorpi. Il numero totale di cellule a questo punto dovrebbe essere superiore a 30.000 per la corteccia e oltre 5.000 per gli altri tessuti.Oltre il 90% delle cellule dovrebbe essere vitale con piccoli detriti di mielina. Una macchina FACS viene utilizzata per ordinare le microglia, che sono tipicamente cd45 basse e CD11B positive. Un isolamento riuscito dovrebbe generare oltre l'80% di microglia da tutte le singole cellule vive, almeno per il tessuto corticale.Una volta che le singole microglia vengono catturate nel buffer di lisi, l'RNA viene rilasciato e successivamente trascritto in cDNA, che viene quindi amplificato per 23 cicli. Come piattaforma capillare di elettroforesi, l'analizzatore di frammenti e i kit di frammenti NGS ad alta sensibilità forniscono informazioni rapide e accurate sulla distribuzione delle dimensioni, nonché sulla quantità di molecole di cDNA presenti in ogni pozzo di una piastra da 96 porri. Campioni che mostrano uno striscio compreso tra 500 e 5.000 coppie di basi e sono al di sopra di una certa soglia di concentrazione possono essere utilizzati per creare librerie.I campioni vengono sequenziati a una profondità di oltre un milione di letture grezze per cella, che satura il potere di rilevamento della metodologia di sequenziamento dell'RNA a singola cella. Con un tasso di mappatura di circa il 60% su 2.000 geni possono essere rilevati per cellula microgliale. I dati pubblicati in precedenza generati da questo metodo di isolamento sono riprodotti da esperimenti indipendenti, dimostrando la sensibilità per il rilevamento di geni specifici di microglia attraverso la popolazione sequenziata.Con le informazioni delle trascrizioni di singole microglia, i ricercatori possono scoprire le popolazioni cellulari uniche nel contesto del loro interesse e studiare ulteriormente la rilevanza funzionale di queste popolazioni appena identificate.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

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Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

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Ricerca

Neuroscienze

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Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

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Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

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Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

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Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

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