Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
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私たちは、このプロトコルの開発中に彼らの助けをマリコL.ベネット、リアナニコールボナンノ、およびスパイロスダルマニスに感謝します。また、スタンフォード・シェアドFACS施設、特にメレディス・ウェグラーツとリサ・ニコルズに感謝します。スタンフォード・プロテイン・アンド・核酸施設(PAN)のヤン・トラン、マイケル・エッカートが撮影を大いにサポート。この作品は、JPB財団とヴィンセント・J・コーツ財団が出資しています。

げっ歯類に関するすべての手順は、スタンフォード大学のガイドラインに準拠し、国および州の法律およびポリシーに準拠しています。すべての動物の手順は、スタンフォード大学の実験動物ケアに関する行政パネルによって承認されました.
注:すべてのソリューションおよびバッファー構成は、材料の表に記載されています。
<p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

ミクログリアは、CNSの他の細胞タイプと積極的に相互作用し、環境刺激に非常に敏感です。単離過程における炎症反応および遺伝子発現の異常変化を最小限に抑えるために、このプロトコルは以前に公開された方法9から合理化され、ミクログリアを単一マウス脳半球の複数の領域から並列に分離するのに適している。組織および試薬は冷温に保たれ、実験は限られた組織サ...

ミクログリアは、全神経細胞の5%−10%を表し、中枢神経系(CNS)1全体に散在するマクロファージである。血液脳関門の背後で保護され、健康な成人の脳の典型的なミクログリアは、急速に拡張し、毛陰腫のニューロンや他のグリア細胞と相互作用するために後退する多くの微細なプロセスを含んでいます。ミクログリアはまた、特定の発達段階の間、または傷害および疾患1、2、3、4における免疫上の課題に関連する貪食性形態を採用することができる。最近のエキサイティングな発見は、ミクログリアが脳由来または病理学的シグナルに対して決して受動的な傍観者ではなく、脳の発達と恒常性を制御する上で極めて重要な役割を果たすことを明らかに示している。ミクログリアのより多くの機能が解明されるにつれて、TREM2のような多くの神経変性疾患リスク遺伝子がミクログリア5、6、7によって主にまたは排他的に発現されることを示したヒト遺伝学研究によって興奮がさらに促進される。開発における彼らの意義ともっともらしい疾患駆動の役割を考えると、神経変性疾患1、8の新しい治療標的を見つけることを期待して、近年、微小グリア遺伝子の調節と機能の理解に向けて多大な努力が払われている。
RNAシーケンシング(RNA-seq)は、細胞型特異的遺伝子発現の偏りのない特徴付けを可能にし、これにより科学者が高密度細胞ネットワーク7における遺伝子機能を調査するよう導く。RNA-seqは、主にバルクサンプル上で行われていたが、他の神経細胞および免疫細胞9とそれらを区別する恒静性微小グリア遺伝子シグネチャの発見につながった。しかし、このようなアプローチは、ミクログリア、特に開発中に一過性に存在するミクログリア間の分子的および機能的な違いを見落とす可能性があり、老化や疾患に関連する。実際、単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)は、様々な文脈2、3、10においてミクログリアの不均一性を以前に過小評価したことを明らかにすることによって、フィールドに革命をもたらした感度と分解能を提供する。さらに、CNS循環界面に他の同様の免疫細胞が存在するため、scRNA-seqは、これらの関連細胞を分離し、機能的に解剖するための新しいツールの設計を助ける情報を提供する。
scRNA-seqプラットフォームの多様な配列が発明され、それぞれが特定のアプリケーション12に適しています。一般に、10xゲノミクスのような液滴ベースの方法は、各実行で配列された数千個の細胞とのスループットが高く、広範な分類を必要とする混合細胞集団を含む可能性のある入力に対する選択性が低くなります。プレートベースの方法は、より高い感度と読み取り深さ13、14を提供し、通常、微妙な違いやまれなトランスクリプトを明らかにするために、細胞ソートから特定の集団を対象とします。ミクログリア細胞の小さな割合、特に開発または疾患関連のサブ集団を考えると、すべてのCNS細胞型の中で、ミクログリアを特定の目的領域から単離し、それらの異質性を理解するために深く、全長の転写情報を得ることがしばしば望ましい。
ここでは、半自動化されたプレートベースのライブラリ調製手順に従って単一細胞(またはバルク)RNA-seqに使用される単一半球から解剖された異なるマウス脳領域からミクログリアを分離する方法について詳しく説明します。その後、他の半球を組織学的検証に使用できます。以前に公開された方法9から合理化されたこの絶縁プロトコルは、少量の出発物質からの歩留まりを最大化し、一方で内因性微小グリア遺伝子発現プロファイルを維持することを目的とする。蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、ミクログリア(または対象の他の関連免疫細胞)を96ウェルプレートに濃縮し、ライブラリ調製用試薬の量を小型化してスループットを向上させます。我々は、他のプレートベースの戦略が適用される可能性があるが、この敏感なscRNA-seqプラットフォームを強調する。この方法は、損傷や疾患病巣などの他の解剖組織からミクログリアを分離するために容易に適応することができ、マウスの年齢は、ほぼすべての出生後段階にわたって変化し得る。単一細胞トランストランスクリプトミクス研究のための局所ミクログリアの効率的な分離は、健康および疾患におけるその機能のより良い理解を促進する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

中枢神経系の常駐マクロファージとして、ミクログリアは脳の発達と恒常性を積極的に制御し、その機能不全がヒト疾患を駆動する可能性がある。恒静性ミクログリアの分子シグネチャや、環境刺激に応じた遺伝子発現の変化を明らかにするために、かなりの進歩が見られた。単一細胞ゲノム方法論の出現と成熟により、異種ミクログリアは、異なる発達および病理学的条件において果たす多様な役割の根底にある可能性がますます認識されています。このような不均一性のさらなる解剖は、目的の所定の領域からミクログリアを効率的に分離することによって達成され、続いて個々の細胞の敏感なプロファイリングが行われる。ここでは、単一の成人マウス脳半球における異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細なプロトコルを提供する。また、プレートベースのディープシングルセルRNAシーケンシングにこれらのソートミクログリアを使用する方法も示します。この方法の適応性を他のシナリオに議論し、大規模な研究に対応するためのシステム改善のためのガイドラインを提供する。

このプロトコルは、1人の成人の浸透した脳半球において異なる脳領域からミクログリアを分離およびソートする方法を記述し、続いてscRNA-seqを行う。私たちは、単一の細胞懸濁液を作成するために、またミクログリアを豊かにするための最初のステップとして、ドーニングを使用しています。不十分または過度の実行は、収量を減少させます。さらに、大人のマウスの脳はミエリンの高レベ...

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Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

この方法は、単一細胞レベルでのミクログリア遺伝子発現の公平な捕捉を可能にし、健康で病気の脳におけるミクログリアの分子不均一性を解明するのに役立つ。この技術の主な利点は、異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細な手順を提供し、効率的に深いシーケンシングのための単一細胞RA6ライブラリの再生ベースを生成する方法を示しています。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているとおりに必要なすべてのバッファとソリューションを準備し、氷の上で冷やします。マウスを安楽死させ、首を切った後、小さなはさみを使って頭の皮膚を切り開いて下の頭蓋骨を露出させます。次に、矢状縫合糸、ラムドイド型縫合糸、および冠状縫合糸を切断する。鉗子を使用して組織を損傷することなく頭頂骨と足間骨の両側を引き離し、慎重に脳を中程度のAを含む解剖ペトリ皿に移動させます。小脳と皮質葉と脳幹を分離するために55番鉗子を使用してください。その後、55番鉗子を使用して、海馬と線条体を皮質から慎重に解剖し、各組織を別々のコレクションペトリ皿に移します。まず、カミソリの刃を使用して、各脳領域を1立方ミリメートル未満の細かい部分に切り刻みます。先端を切り落とした1ミリリットルのピペットを使用して、組織片を冷やされたDounceホモジナイザーに移します。目に見える塊がなくなるまで、6〜10フルストロークでDounceホモジナイザーのピストンをゆっくりとねじることによって組織を均質化します。次いで、解約した組織を70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの管に移す。各Dounceホモジナイザーとピストンを合計6ミリリットルの冷媒Aでリンスし、遠心分離のために15ミリリットルのチューブにリンスを移します。遠心分離機単細胞懸濁液は400g、摂氏4度で5分間、5時に休憩を取る。3ミリリットルのMCSを備えた磁気セパレータで、1つの大きな枯渇カラムと3つの大きな選択カラムをリンスします。組織サンプルの遠心分離が完了すると、ピペットを出してペレットを乱すことなく上清を捨てます。RNase阻害剤を含むMCSバッファ内の細胞を再中断します。皮質および小脳からの再懸濁細胞を含む各チューブにミエリン除去ビーズの100マイクロリットルを加え、海馬および線条体から再懸濁細胞を含む各チューブに50マイクロリットルのミエリン除去ビーズを加える。氷上のチューブを10分間インキュベートします。この後、皮質細胞を含むチューブにMCSを加え、その体積を最大2ミリリットルにし、残りのチューブに1ミリリットルまでの体積を持ち込みます。カラムがすすいバッファーの空になったら、2 ミリリットルの皮質細胞を大きな枯渇カラムに、互いのセル懸濁液を 1 ミリリットルずつ別々の大きい選択列にロードします。次に、大きな枯渇カラムを1ミリリットルのMCSバッファで洗浄し、各洗浄に1ミリリットルのMCSバッファを使用して各大きな選択カラムを2回洗浄します。丸底FACSチューブに35マイクロリットルストレーナーキャップを介して細胞をフィルタリングします。これらのチューブを400倍gで遠心し、5分間摂氏4度で細胞をペレット化する。その後、上清をゆっくりと注ぎ、ティッシュペーパーにチューブの端をささげます。FACSバッファーの300マイクロリットルで各チューブ内の細胞を再懸濁します。まず、マウスFC受容体ブロック試薬を5マイクロリットルずつ各チューブに加えます。氷の上で5分間インキュベートします。次に、CD45 PEサイズ7の1マイクロリットルとCD11B BV421の1マイクロリットルを各チューブに加えます。室温でシェーカーにチューブを10分間インキュベートします。この後、2 ミリリットルの FACS バッファーを加えて洗浄します。遠心分離機は400倍gで、摂氏4度で5分間細胞をペレットする。各チューブ内の細胞を、RNase阻害剤の1マイクロリットルとヨウ化プロピジウム0.5マイクロリットルを含むFACSバッファーの400マイクロリットルで再懸濁します。標準的なFACS手順に従って、100マイクロメートルノズルを備えた単一の生きたミクログリアを、各ウェルに4マイクロリットルのライシスバッファーを含む96ウェルPCRプレートにソートします。簡単にプレートを渦巻き、ベンチトップ遠心分離機を使用してそれらを回転させます。図書館の準備までマイナス80度でプレートを保管してください。先に進む準備ができたら、氷の上にプレートを解凍します。サーマルサイクラーを使用して最初の転写を行い、cDNAを生成し、テキストプロトコルで概説されているように、追加のエキソヌクレアーゼ消化ステップでcDNAを増幅します。この後、各ウェルに18マイクロリットルの磁気ビーズを加えてcDNAを精製します。磁気スタンドにプレートを5分間インキュベートします。その後、上清を取り除き、1回の洗浄ごとに80マイクロリットルのエタノールを使用して作りたての80%エタノールでサンプルを2回洗浄します。タグメンテーションを実行するには、ナノリットルのピペット加工機を使用して、各cDNAサンプルの0.4マイクロリットルを、ライブラリ調製キットのTn5タグメンテーション試薬の1.2マイクロリットルと共に、摂氏55度の384ウェルプレートで10分間混合します。タグ化反応を停止するには、室温で0.4マイクロリットルの中和バッファーを5分間加えます。次に、384個のインデックスと1.2マイクロリットルのPCRをサンプルに混合し、テキストプロトコルで概説されているようにライブラリを増幅します。同じ384ウェルプレートからすべての個々のライブラリを一緒にプールし、最終的なプールされたライブラリを浄化するために磁気ビーズを使用します。本研究では、ミクログリアは、成体マウスの脳半球の皮質、小脳、海馬、線条体から分離される。調製した細胞懸濁液を顕微鏡下で調べるには、トリパンブルーとヘモサイトメーターを用いて、抗体染色を行う前にミエリン除去の収率、細胞生存率、および有効性を推定する。この時点での総細胞数は、皮質の場合は30,000以上、他の組織では5,000以上である必要があります。細胞の90%以上は、ミエリンの破片を少なくして生存可能であるべきである。FACS マシンは、通常 CD45 低と CD11B 陽性であるミクログリアを並べ替えるために使用されます。正常な分離は、少なくとも皮質組織のために、すべての生きた単細胞から80%以上のミクログリアを生成する必要があります。個々のミクログリアがリシスバッファーに取り込まれると、RNA が放出され、その後 cDNA に逆転転写され、23 サイクル増幅されます。キャピラリー電気泳動プラットフォームとして、フラグメントアナライザと高感度NGSフラグメントキットは、サイズ分布に関する迅速かつ正確な情報と、96ウェルプレートの各ウェルに存在するcDNA分子の量を提供します。500と5,000の塩基対の間のスミアを示し、一定の濃度閾値を超えているサンプルは、ライブラリを作るために使用することができます。サンプルは、1細胞当たり100万個以上の生読み取りの深さに配列され、単細胞RNAシーケンシング方法論の検出力を飽和させます。マッピング率が約60%以上2の場合、1個のミクログリア細胞につき000個の遺伝子を検出できます。この分離法から生成された以前に公開されたデータは、独立した実験から再現され、配列配列された集団全体でミクログリア特異的遺伝子を検出するための感度を実証する。単一のミクログリア転写の情報を使用すると、研究者は関心のある文脈でユニークな細胞集団を発見し、これらの新たに同定された集団の機能的関連性をさらに研究することができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...