Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Vi takker Mariko L. Bennett, Liana Nicole bonanno, og Spyros Darmanis for deres hjelp under utviklingen av denne protokollen. Vi takker også Stanford Shared FACS Facility, særlig Meredith Weglarz og Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart fra Stanford protein og nukleinsyre acid Facility (PAN) for sin store støtte til filming. Dette arbeidet er finansiert av JPB Foundation og Vincent J. Coates Foundation.

Alle prosedyrer som involverer gnagere likedannet til Stanford University retningslinjer, som overholder nasjonale og statlige lover og retningslinjer. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Stanford University ' s administrative panel på laboratorium Animal Care.
Merk: Alle løsninger og buffer komposisjoner er gitt i tabell over materialer.
1. forberedelse på dagen for Cell Isolation
<ol><li>Klargjør følgende reagenser og chill...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Mikroglia aktivt samhandle med andre celletyper i CNS, og de er svært følsomme for miljømessige stimuli. For å minimere inflammatoriske reaksjoner og avvikende endringer i deres genuttrykk i løpet av isolasjons prosessen, har denne protokollen blitt strømlinjeformet fra en tidligere publisert metode9, og det er nå egnet til å isolere mikroglia fra flere regioner av en enkelt mus hjerne halvkule parallelt. Vev og reagenser holdes ved kald temperatur og eksperimenter utføres innen rimelig t...

Mikroglia, som representerer 5% − 10% av alle nevrale celler, er bosatt makrofager spredt over hele det sentrale nervesystemet (CNS)1. Beskyttet bak blod-hjerne barriere, typisk mikroglia i en sunn voksen hjernen inneholder mange fine prosesser som raskt utvide og trekke seg tilbake til å samhandle med neurons og andre gliacellene celler i parenchyma. Mikroglia kan også vedta Amoeboid morfologi forbundet med økt phagocytic funksjon under bestemte utviklingstrinn eller på immun utfordringer i skade og sykdom1,2,3,4. Nylige spennende oppdagelser har tydelig vist at mikroglia er på ingen måte passive tilskuere til hjerne-avledet eller patologiske signaler, men spiller avgjørende roller i å kontrollere hjernens utvikling og homeostase, for eksempel ved å støtte neuronal overlevelse, beskjæring umodne synapser, fremme oligodendrocyte avstamning celler differensiering samt angiogenese1. Som flere funksjoner mikroglia er belyst, spenningen er ytterligere fueled av Human genetikk studier, som viste at mange nevrodegenerative sykdom risiko gener, som TREM2, er overveiende eller utelukkende uttrykt av mikroglia5,6,7. Gitt sin betydning i utvikling og sannsynlig sykdom-kjøring roller, har enorm innsats nylig blitt satt mot vår forståelse av mikrogliaaggregater gen regulering og funksjon i håp om å finne nye terapeutiske mål for nevrodegenerative sykdommer1,8.
RNA sekvensering (RNA-SEQ) tillater objektiv karakterisering av celle type-spesifikke genuttrykk, som i sin tur veileder forskere til å undersøke gen funksjoner i tette mobilnettverk7. RNA-SEQ hadde vært stort sett gjort på bulk prøver, fører til oppdagelsen av en homøostatisk mikrogliaaggregater gen signatur som skiller dem fra andre nevrale og immune celler9. Imidlertid kan en slik tilnærming overse molekylære og funksjonelle forskjeller blant mikroglia, spesielt de midlertidig stede i utvikling, eller forbundet med aldring og sykdom. Faktisk, enkelt celle RNA-SEQ (scRNA-SEQ) tilbyr følsomhet og oppløsning som har revolusjonert feltet ved å avsløre tidligere underappreciated heterogenitet av mikroglia i en rekke sammenhenger2,3,10. I tillegg, på grunn av tilstedeværelsen av andre lignende immunceller på CNS-sirkulasjon grensesnitt, scRNA-SEQ gir informasjon hjelpe utformingen av nye verktøy for å skille og funksjonelt analysere disse relaterte celler med litt tidligere kunnskap2,11.
En mangfoldig oppstille av scRNA-SEQ plattform ha blitt konstruere, hver egnet til bestemt søknadene12. Generelt er dråpe BAS ert metoder, for eksempel 10x Genomics, høyere i gjennomstrømming med (titusenvis av) celler sekvensielt i hver kjøring, og de er mindre selektive for innspill som kan inneholde blandet celle populasjoner som krever bred kategorisering. Plate BAS ert metoder gir høyere følsomhet og lese dybde13,14, vanligvis rettet mot bestemte populasjoner fra celle sortering for å avdekke subtile forskjeller eller sjeldne transkripsjoner. Gitt den lille prosentandelen av mikrogliaaggregater celler, spesielt de utvikling-eller sykdoms-assosiert subpopulasjoner, blant alle CNS celletyper, er det ofte ønskelig å isolere mikroglia fra en bestemt region av interesse og få dyp og full-lengde transcriptomic informasjon for å forstå deres heterogenitet.
Her gir vi informasjon om hvordan du isolerer mikroglia fra ulike mus hjernen regioner dissekert fra en enkelt halvkule, som brukes for én celle (eller bulk) RNA-SEQ etter en semi-automatisert plate-basert bibliotek forberedelse prosedyre. Den andre halvkule kan deretter brukes til histologiske validering. Strømlinjeformet fra en tidligere publisert metode9, denne isolasjons protokollen har som mål å maksimere avkastningen fra små mengder av Start materialer, og i mellomtiden opprettholde endogene mikrogliaaggregater genuttrykk profiler. Vi bruker fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for å berike mikroglia (eller andre relaterte immunceller av interesse) i 96-brønn plater og miniaturize volumene av reagenser for biblioteks forberedelser for å øke gjennomstrømningen. Vi fremhever denne følsomme scRNA-SEQ-plattformen, selv om andre plate-baserte strategier kan brukes. Denne metoden kan lett tilpasses til å isolere mikroglia fra andre dissekert vev, slik som skade eller sykdoms prioriteringer, og alder av musen kan variere over nesten alle postnatal etapper. Effektiv isolering av regionale mikroglia for enkelt celle transcriptomics studier vil gjøre det lettere å forstå deres funksjoner i helse og sykdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Som bosatt makrofager i det sentrale nervesystemet, mikroglia aktivt kontrollere hjernens utvikling og homeostase, og deres dysfunksjoner kan drive menneskelige sykdommer. Det er gjort betydelige fremskritt for å avdekke de molekylære signaturene av homøostatisk mikroglia samt endringer av deres genuttrykk som svar på miljømessige stimuli. Med bruk og modning av single-Cell genomisk metoder, er det stadig mer anerkjent at heterogene mikroglia kan ligger til grunn de ulike rollene de spiller i ulike utviklingsmessige og patologiske forhold. Ytterligere Disseksjon av slike heterogenitet kan oppnås gjennom effektiv isolering av mikroglia fra en gitt region av interesse, etterfulgt av følsom profilering av individuelle celler. Her gir vi en detaljert protokoll for rask isolering av mikroglia fra ulike hjernens regioner i en enkelt voksen mus hjerne halvkule. Vi viser også hvordan du bruker disse sorterte mikroglia for plate BAS ert, dyp enkelt celle RNA-sekvenser. Vi diskuterer tilpasning av denne metoden til andre scenarier og gir retningslinjer for å forbedre systemet for å imøtekomme store studier.

Denne protokollen beskriver en metode for å isolere og sortere mikroglia fra forskjellige hjerneområder i en voksen perfusert hjerne halvkule, etterfulgt av scRNA-SEQ. Vi bruker douncing til å lage enkelt celle oppheng og også som et første skritt for å berike mikroglia. Utilstrekkelig eller over-douncing reduserer utbyttet. I tillegg voksen mus hjerner inneholder høye nivåer av myelin, som også kan redusere sortering effektivitet og yield hvis ikke fjernes riktig. Derfor undersøker vi celle fjæringen under mi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Vi tilbyr en protokoll for isolering av mikroglia fra ulike dissekert regioner av en voksen mus hjerne halvkule, etterfulgt av semi-automatisert bibliotek forberedelse for dyp enkelt celle RNA sekvensering av full lengde transcriptomes. Denne metoden vil bidra til å belyse funksjonell heterogenitet av mikroglia i helse og sykdom.

Isolering av region-spesifikke Mikroglia fra en voksen mus Brain halvkule for Deep single-celle RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Denne metoden tillater objektiv fangst av mikroglia genuttrykk på encellet nivå, noe som kan bidra til å belyse mikroglias molekylære heterogenitet i en sunn og syk hjerne. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir en detaljert prosedyre for rask isolering av mikroglia fra forskjellige hjerneregioner og viser hvordan man effektivt kan generere spillebase encellede RA6-biblioteker for dyp sekvensering. For å starte denne prosedyren, klargjør alle nødvendige buffere og løsninger som beskrevet i tekstprotokollen og chill dem på is.Etter euthanizing og halshugge musen, bruk liten saks for å kutte åpne huden på hodet for å avsløre skallen under. Deretter skjærer du gjennom sagittal sutur, lambdoidal sutur og koronar sutur. Bruk tang til å trekke av begge sider av parietal bein og interparietal bein uten å skade vevet og forsiktig flytte hjernen inn i en disseksjon Petri parabolen som inneholder medium A.Bruk en pre-kjølt blad, skjære hjernen gjennom midtlinjen i to halvkuler.Bruk nummer 55 tang for å skille lillehjernen fra kortikale flik og hjernestammen. Deretter bruker du nummer 55 tang for å forsiktig dissekere ut hippocampus og striatum fra cortex og overføre hvert vev til en egen samling Petriskål. Bruk først et barberblad til å hogge hver hjerneregion i fine biter som er mindre enn en kubikkmillimeter.Ved hjelp av en en milliliter pipette med spissen avskåret, overfør vevsbitene til forkjølte Dounce homogenisatorer. Homogenisere vevet ved sakte å vri stempelet inn og ut av Dounce homogenisator for seks til 10 fulle slag til ingen synlige biter er til stede. Deretter overfører du det dissosierte vevet til 50 milliliter rør gjennom 70 mikrometersiler.Skyll hver Dounce homogenisator og stempel med totalt seks milliliter kaldt medium A og overfør deretter skyllingen til et 15 milliliter rør for sentrifugering. Sentrifuge encellede suspensjon på 400 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter med en pause på fem. Skyll en stor uttømmingskolonne og tre store markeringskolonner i en magnetisk separator med tre milliliter MCS.Når sentrifugeringen for vevsprøvene er fullført, pipette ut og kast supernatant uten å forstyrre pelleten. Resuspend cellene i MCS buffer som inneholder RNase hemmer. Tilsett 100 mikroliter myelin fjerning perler til hvert rør som inneholder re-suspenderte celler fra cortex og cerebellum og tilsett 50 mikroliter myelin fjerning perler til hver av rørene som inneholder re-suspendert celler fra hippocampus og striatum.Inkuber rørene på is i 10 minutter. Etter dette, legge MCS til røret som inneholder kortikale celler for å bringe volumet opp til to milliliter og til de resterende rørene for å bringe hver av sine volumer opp til en milliliter. Når kolonnene er tomme for skyllebuffer, laster du to milliliter kortikale celler på den store uttømmingskolonnen og en milliliter av hverandre cellesuspensjon på separate store utvalgskolonner.Deretter vasker du de store uttømmingskolonnene med én milliliter MCS-buffer og vasker hver store markeringskolonne to ganger ved hjelp av én milliliter MCS-buffer for hver vask. Filtrer cellene gjennom 35 mikrolitersilsilhett i rundbunnede FACS-rør. Sentrifuge disse rørene på 400 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter for å pellet cellene.Deretter, sakte helle ut overnaturlig og dab kanten av røret på silkepapir. Gjenoppusst cellene i hvert rør med 300 mikroliter FACS-buffer. Først legger du til fem mikroliter mus FC reseptorer blokkere reagens til hvert rør.Inkuber på is i fem minutter. Deretter legger du til en mikroliter CD45 PE størrelse syv og en mikroliter CD11B BV421 til hvert rør. Inkuber rørene på en shaker ved romtemperatur i 10 minutter.Etter dette legger du til to milliliter FACS-buffer for å vaske. Sentrifuge på 400 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter for å pellet cellene. Resuspend cellene i hvert rør med 400 mikroliter FACS buffer som inneholder en mikroliter RNase hemmer og 0,5 mikroliter propidiumjodid.Etter standard FACS-prosedyren sorterer du enkelt levende mikroglia med en 100 mikrometerdyse i 96-brønns PCR-plater som inneholder fire mikroliter lysisbuffer i hver brønn. Virvle platene kort og spinn dem ned ved hjelp av en benkeplate sentrifuge. Oppbevar platene på minus 80 grader Celsius til bibliotekforberedelsen.Når du er klar til å fortsette, tin platen på is. Bruk en termisk cycler til å utføre en første transkripsjon for å generere cDNA og forsterke cDNA med et ekstra exonuclease fordøyelsestrinn som beskrevet i tekstprotokollen. Etter dette renser du cDNA ved å legge til 18 mikroliter magnetiske perler til hver brønn.Inkuber platen på et magnetisk stativ i fem minutter. Fjern deretter supernatanten og vask prøvene to ganger med nylaget 80% etanol ved hjelp av 80 mikroliter etanol per brønn for hver vask. For å utføre tagmentasjon, bruk en nanoliter pipetteringsmaskin til å blande 0,4 mikroliter av hver cDNA-prøve med 1,2 mikroliter Tn5 tagmentasjonsreagenser fra bibliotekets forberedelsessett i en 384-brønnsplate ved 55 grader Celsius i 10 minutter.For å stoppe merkereaksjonen, legg til 0,4 mikroliter nøytraliseringsbuffer ved romtemperatur i fem minutter. Deretter, på 384 indekser og 1,2 mikroliter pcr blandet til eksemplene og forsterke bibliotekene som beskrevet i tekstprotokollen. Samle alle de enkelte bibliotekene fra samme 384-brønnsplate sammen og bruk magnetiske perler for å rense de endelige samlede bibliotekene.I denne studien er microglia isolert fra cortex, cerebellum, hippocampus og striatum av en voksen mus hjernehalvdel. Den forberedte cellesuspensjonen undersøkes under et mikroskop ved hjelp av trypanblå og et hemocytometer for å estimere utbyttet, celle levedyktigheten og effekten av myelinfjerning før du utfører antistofffarging. Totale celletall på dette punktet bør være over 30.000 for cortex og over 5.000 for de andre vevene.Over 90% av cellene skal være levedyktige med lite myelinavfall. En FACS-maskin brukes til å sortere microglia, som vanligvis er CD45 lav og CD11B positiv. Vellykket isolasjon bør generere over 80% microglia ut av alle levende enkeltceller, i hvert fall for kortikale vev.Når individuell mikroglia er fanget inn i lysisbufferen, frigjøres RNA og deretter reversere transkribert til cDNA, som deretter forsterkes i 23 sykluser. Som en kapillær elektroforeseplattform gir fragmentanalysatoren og høysensitive NGS-fragmentsett rask og nøyaktig informasjon om størrelsesfordeling, samt mengde cDNA-molekyler som finnes i hver brønn av en 96-brønnsplate. Prøver som viser et smør mellom 500 og 5000 basispar og er over en viss konsentrasjonsterskel kan brukes til å lage biblioteker.Prøvene er sekvensert til en dybde på over en million rå leser per celle, som metter deteksjonskraften til encellede RNA sekvenseringsmetodikk. Med en kartleggingshastighet på ca. 60 % over 2, kan 000 gener påvises per mikroglial celle. Tidligere publiserte data generert fra denne isolasjonsmetoden reproduseres fra uavhengige eksperimenter, noe som viser følsomheten for å oppdage mikrogliaspesifikke gener på tvers av den sekvenserte befolkningen.Med informasjon om enkle microglia transkripsjoner, forskere kan oppdage de unike cellepopulasjoner i sammenheng med deres interesse, og videre studere den funksjonelle relevansen av disse nyidentifiserte populasjoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og isolering av musen primære Microglia av tetthet gradert sentrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolasjon og RNA utvinning av Neurons, makrofager og Microglia fra larver sebrafisk hjerner

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Encellede RNA sekvensering av Fluorescently merket musen Neurons med manuell sortering og dobbel In Vitro transkripsjon absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...