Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis por sua ajuda durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também à Instalação FACS Compartilhada de Stanford, particularmente Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) por seu grande apoio para as filmagens. Este trabalho é financiado pela Fundação JPB e pela Fundação Vincent J. Coates.

Todos os procedimentos envolvendo roedores se conformaram com as diretrizes da Universidade de Stanford, que cumprem as leis e políticas nacionais e estaduais. Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Painel Administrativo de Cuidados Com Animais laboratoriais da Universidade de Stanford.
Nota: Todas as composições de solução e tampão são fornecidas na Tabela de Materiais.
1. Preparação no Dia do Isolamento Celular...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Microglia interage ativamente com outros tipos de células no SNC, e eles são muito sensíveis a estímulos ambientais. A fim de minimizar as respostas inflamatórias e as mudanças aberrantes em sua expressão gênica durante o processo de isolamento, este protocolo foi simplificado a partir de um método publicado anteriormente9, e agora é adequado para isolar microglia de várias regiões de um único hemisfério cerebral do rato em paralelo. Os tecidos e reagentes são mantidos em temperatur...

Microglia, representando 5%−10% de todas as células neurais, são macrófagos residentes espalhados por todo o sistema nervoso central (SNC)1. Protegido atrás de barreira sangue-cérebro, microglia típica em um cérebro adulto saudável contêm muitos processos finos que se estendem rapidamente e se retraem para interagir com neurônios e outras células gliais na parenchyma. Microglia também pode adotar a morfologia ameboiídea associada ao aumento da função fagocítica durante estágios específicos de desenvolvimento ou sobre desafios imunológicos em lesão e doença1,2,3,4. Recentes descobertas emocionantes demonstraram claramente que a microglia não são de forma passiva para sinais patológicos ou derivados do cérebro, mas desempenham papéis fundamentais no controle do desenvolvimento cerebral e homeostase, por exemplo, apoiando a sobrevivência neuronal, podar sinapses imaturas, promover a diferenciação de células de linhagem de oligodendrocyte, bem como angiogênese1. À medida que mais funções da microglia são elucidadas, a excitação é ainda mais alimentada por estudos de genética humana, que mostraram que muitos genes de risco de doenças neurodegenerativas, como trem2, são predominantemente ou exclusivamente expressos pela microglia5,6,7. Dada a sua importância no desenvolvimento e plausíveis papéis de condução de doenças, um enorme esforço foi recentemente colocado para a nossa compreensão da regulação do gene microglial e função na esperança de encontrar novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas1,8.
O sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite caracterização imparcial da expressão gênica específica do tipo celular, que por sua vez orienta os cientistas a investigar as funções gênicas em redes celulares densas7. RNA-seq tinha sido feito principalmente em amostras a granel, levando à descoberta de uma assinatura do gene microglial homeostático que os distingue de outras células neurais e imunes9. No entanto, tal abordagem poderia ignorar as diferenças moleculares e funcionais entre a microglia, especialmente aqueles que estão transitoriamente presentes no desenvolvimento, ou associados ao envelhecimento e à doença. Na verdade, rna-seq de célula única (scRNA-seq) oferece a sensibilidade e resolução que revolucionaram o campo, revelando a heterogeneidade anteriormente subestimada da microglia em uma variedade de contextos2,3,10. Além disso, devido à presença de outras células imunes semelhantes na interface de circulação do SNC, a scRNA-seqs fornece informações que auxiliam o projeto de novas ferramentas para separar e dissecar funcionalmente essas células relacionadas com pouco conhecimento prévio2,11.
Uma disposição diversa de plataformas do scRNA-seq foi inventada, cada um apropriada para determinadas aplicações12. Em geral, os métodos baseados em gotículas, como 10x Genômica, são mais elevados em taxa de rendimento com (dezenas de) milhares de células sequenciadas em cada corrida, e são menos seletivas para a entrada que pode conter populações de células mistas que exigem uma categorização ampla. Métodos baseados em placas fornecem maior sensibilidade e ler profundidade13,14, geralmente visando populações específicas de classificação celular para revelar diferenças sutis ou transcrições raras. Dada a pequena porcentagem de células microgliais, particularmente aquelas subpopulações associadas ao desenvolvimento ou à doença, entre todos os tipos de células do SNC, muitas vezes é desejável isolar a microglia de uma região específica de interesse e obter informações transcriomicas profundas e completas para entender sua heterogeneidade.
Aqui, fornecemos detalhes sobre como isolar a microglia de diferentes regiões cerebrais do camundongo dissecadas de um único hemisfério, que são usados para RNA-seq de célulaúnica (ou a granel) após um procedimento de preparação de biblioteca semi-automatizado baseado em placa. O outro hemisfério pode então ser usado para validação histológica. Simplificado a partir de um método publicado anteriormente9,este protocolo de isolamento visa maximizar o rendimento de uma pequena quantidade de materiais de partida e, entretanto, manter perfis endógenos de expressão gênica microglial. Usamos a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para enriquecer a microglia (ou outras células imunes de interesse relacionadas) em placas de 96 poços e miniaturizar os volumes de reagentes para a preparação da biblioteca, a fim de aumentar a taxa de transferência. Destacamos essa plataforma scRNA-seq sensível, embora outras estratégias baseadas em placas possam ser aplicadas. Este método pode ser facilmente adaptado para isolar a microglia de outros tecidos dissecados, como lesões ou focos de doença, e a idade do rato pode variar em quase todos os estágios pós-natais. O isolamento eficiente da microglia regional para estudos de transcriptômica unicelular facilitará uma melhor compreensão de suas funções na saúde e na doença.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Como macrófagos residentes no sistema nervoso central, microglia controlar ativamente o desenvolvimento do cérebro e homeostase, e suas disfunções podem conduzir doenças humanas. Avanços consideráveis foram feitos para descobrir as assinaturas moleculares da microglia homeostática, bem como alterações de sua expressão gênica em resposta a estímulos ambientais. Com o advento e maturação de metodologias genômicas unicelulares, é cada vez mais reconhecido que a microglia heterogênea pode estar subjacente aos diversos papéis que desempenham em diferentes condições de desenvolvimento e patológicas. Uma dissecção mais adicional de tal heterogeneity pode ser conseguida com a isolação eficiente do microglia de uma região de interesse dada, seguida pelo perfil sensível de pilhas individuais. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o rápido isolamento da microglia de diferentes regiões cerebrais em um único hemisfério cerebral adulto do rato. Também demonstramos como usar essas microglias classificadas para sequenciamento de RNA de células únicas profundas à base de placa. Discutimos a adaptabilidade deste método a outros cenários e fornecemos diretrizes para melhorar o sistema para acomodar estudos em larga escala.

Este protocolo descreve um método para isolar e classificar microglia de diferentes regiões cerebrais em um hemisfério cerebral adulto perfundido, seguido por scRNA-seq. Usamos douncing para criar suspensão de célula única e também como um primeiro passo para enriquecer microglia. Insuficiente ou excesso de douncing reduz o rendimento. Além disso, os cérebros de camundongos adultos contêm altos níveis de mielina, o que também pode reduzir a eficiência de classificação e o rendimento se não for removido co...

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Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Este método permite a captura imparcial da expressão genética de microglia em um nível unicelular, o que pode ajudar a elucidar a heterogeneidade molecular da microglia em um cérebro saudável e doente. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um procedimento detalhado para o rápido isolamento da microglia de diferentes regiões cerebrais e mostra como gerar eficientemente a base de reprodução das bibliotecas RA6 unicelulares para sequenciamento profundo. Para iniciar este procedimento, prepare todos os buffers e soluções necessários, conforme descrito no protocolo de texto e esfrie-os no gelo.Depois de eutanásia e decapitação do rato, use uma pequena tesoura para cortar a pele na cabeça para expor o crânio por baixo. Em seguida, corte através da sutura sagital, sutura lambdoidal, e sutura coronal. Use fórceps para extrair ambos os lados do osso parietal e do osso interparietal sem danificar o tecido e mover cuidadosamente o cérebro para uma placa de Petri de dissecção contendo a lâmina média A.Usando uma lâmina pré-refrigerada, corte o cérebro através da linha média em dois hemisférios.Use fórceps número 55 para separar o cerebelo do lobo cortical e do tronco cerebral. Em seguida, use o número 55 fórceps para dissecar cuidadosamente o hipocampo e o estriado do córtex e transferir cada tecido para uma placa de petri de coleta separada. Primeiro, use uma lâmina de barbear para cortar cada região cerebral em pedaços finos que são menos de um milímetro cúbico.Usando uma pipeta de um mililitro com a ponta cortada, transfira os pedaços de tecido em homogeneizadores do Dounce pré-refrigerados. Homogeneize o tecido torcendo lentamente o pistão para dentro e para fora do homogeneizador Dounce por seis a 10 golpes completos até que não haja pedaços visíveis. Em seguida, transfira os tecidos dissociados em tubos de 50 mililitros através de cepas de 70 micrômetros.Enxágüe cada homogeneizador e pistão dounce com o total de seis mililitros de meio frio A, em seguida, transfira a lavagem para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Centrífuga suspensão de célula única a 400 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos com uma pausa em cinco. Enxágüe uma grande coluna de esgotamento e três grandes colunas de seleção em um separador magnético com três mililitros de MCS.Quando a centrifugação para as amostras de tecido estiver completa, pipeta para fora e descartar supernasce sem perturbar a pelota. Resuspendice as células no buffer MCS que contém inibidor RNase. Adicione 100 microliters de contas de remoção de mielina a cada tubo contendo células re-suspensas do córtex e cerebelo e adicione 50 microliters de contas de remoção de mielina a cada um dos tubos contendo células re-suspensas do hipocampo e do estriato.Incubar os tubos no gelo por 10 minutos. Depois disso, adicione MCS ao tubo contendo células corticais para aumentar seu volume até dois mililitros e aos tubos restantes para trazer cada um de seus volumes até um mililitro. Uma vez que as colunas estejam vazias de tampão de lavagem, carregue dois mililitros de células corticais na grande coluna de esgotamento e um mililitro da suspensão celular entre si em colunas de seleção separadas.Em seguida, lave as colunas de esgotamento grande com um mililitro de buffer MCS e lave cada grande coluna de seleção duas vezes usando um mililitro de buffer MCS para cada lavagem. Filtre as células através de 35 tampas de coador de microliter em tubos FACS de fundo redondo. Centrifugar esses tubos a 400 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos para pelotar as células.Em seguida, despeje lentamente o sobrenante e dab a borda do tubo em papel de tecido. Resuspense as células em cada tubo com 300 microliters de tampão FACS. Primeiro, adicione cinco microliters de receptores FC de rato bloqueiam o reagente a cada tubo.Incubar no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione um microliter de CD45 PE tamanho sete e um microliter de CD11B BV421 para cada tubo. Incubar os tubos em um agitador em temperatura ambiente por 10 minutos.Depois disso, adicione dois mililitros de tampão FACS para lavar. Centrifugar a 400 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos para pelotar as células. Resuspenque as células em cada tubo com 400 microliters de tampão FACS contendo um microliter de inibidor de RNase e 0,5 microliters de iodeto de propídio.Seguindo o procedimento FACS padrão, classifique microglia viva única com um bocal de 100 micrômetros em placas PCR de 96 poços que contêm quatro microliters de tampão de lise em cada poço. Brevemente vórtice das placas e gire-as para baixo usando uma centrífuga superior de banco. Armazene as placas a menos 80 graus Celsius até a preparação da biblioteca.Quando estiver pronto para prosseguir, descongele a placa no gelo. Use um cicloviário térmico para realizar uma primeira transcrição para gerar cDNA e amplificar o cDNA com uma etapa adicional de digestão exonuclease, conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, purifique o cDNA adicionando 18 microliters de contas magnéticas a cada poço.Incubar a placa em um suporte magnético por cinco minutos. Em seguida, remova o supernascer e lave as amostras duas vezes com 80% de etanol recém-feito usando 80 microliters de etanol por poço para cada lavagem. Para realizar a tagmentação, use uma máquina de pipetação nanoliter para misturar 0,4 microliters de cada amostra cDNA com 1,2 microliters de reagentes de tagmentação Tn5 do kit de preparação da biblioteca em uma placa de 384 poços a 55 graus Celsius por 10 minutos.Para parar a reação de tagmentação, adicione 0,4 microliters de tampão de neutralização à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, com 384 índices e 1,2 microliters de PCR misturados às amostras e amplificando as bibliotecas conforme descrito no protocolo de texto. Misture todas as bibliotecas individuais da mesma placa de 384 poços e use contas magnéticas para purificar as bibliotecas finais.Neste estudo, a microglia está isolada do córtex, cerebelo, hipocampo e estriado do hemisfério cerebral de um camundongo adulto. A suspensão celular preparada é examinada sob um microscópio usando azul tripano e um hemócito para estimar o rendimento, a viabilidade celular e a eficácia da remoção da mielina antes de realizar a coloração de anticorpos. A contagem total de células neste momento deve ser de mais de 30.000 para o córtex e mais de 5.000 para os outros tecidos.Mais de 90% das células devem ser viáveis com pequenos detritos de mielina. Uma máquina FACS é usada para classificar a microglia, que normalmente são CD45 baixa e CD11B positivo. O isolamento bem sucedido deve gerar mais de 80% de microglia de todas as células únicas vivas, pelo menos para o tecido cortical.Uma vez que a microglia individual é capturada no tampão de lise, o RNA é liberado e posteriormente transcrito para cDNA, que é então amplificado para 23 ciclos. Como uma plataforma de eletroforese capilar, o analisador de fragmentos e kits de fragmentos de NGS altamente sensíveis fornecem informações rápidas e precisas sobre a distribuição do tamanho, bem como a quantidade de moléculas de CDNA presentes em cada poço de uma placa de 96 poços. Amostras que mostram uma mancha entre 500 e 5.000 pares de base e estão acima de um certo limiar de concentração podem ser usadas para fazer bibliotecas.As amostras são sequenciadas a uma profundidade de mais de um milhão de leituras brutas por célula, o que satura o poder de detecção da metodologia de sequenciamento de RNA unicelular. Com uma taxa de mapeamento de aproximadamente 60% sobre 2.000 genes podem ser detectados por célula microglial. Dados publicados anteriormente gerados a partir deste método de isolamento são reproduzidos a partir de experimentos independentes, demonstrando a sensibilidade para detectar genes específicos de microglia em toda a população sequenciada.Com as informações de transcrições de microglia únicas, os pesquisadores podem descobrir as populações celulares únicas no contexto de seu interesse, e estudar melhor a relevância funcional dessas populações recém-identificadas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Neurociência

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...