Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Мы благодарим Марико Л. Беннетт, Лиану Николь Бонанно и Спироса Дарманиса за помощь в разработке этого протокола. Мы также благодарим Стэнфордский общий фонд FACS, в частности Мередит Вегларц и Лиза Николс; Иен Тран, Майкл Экарт из Стэнфордского протеина и нуклеиновой кислоты фонда (PAN) за их большую поддержку для съемок. Эта работа финансируется Фондом JPB и Фондом Винсента Коутса.

Все процедуры с участием грызунов соответствовали руководящим принципам Стэнфордского университета, которые соответствуют национальным законам и политике штатов. Все процедуры для животных были одобрены Административной группой Стэнфордского университета по уходу за лабораторным...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Микроглия активно взаимодействует с другими типами клеток в ЦНС, и они очень чувствительны к экологическим стимулам. Для того, чтобы свести к минимуму воспалительные реакции и аномальные изменения в экспрессии их генов в процессе изоляции, этот протокол был упорядочен из ранее опублик...

Микроглия, представляющая 5%-10% всех нервных клеток, являются резидентными макрофагами, разбросанными по всей центральной нервной системе (ЦНС)1. Защищенный за гематоэнцефалии барьер, типичные микроглии в здоровом мозге взрослого содержат много тонких процессов, которые быстро продлить и втягивать взаимодействовать с нейронами и другими глиальными клетками в parenchyma. Микроглия может также принять амебоидной морфологии, связанные с увеличением фагоцитарной функции на конкретных стадиях развития или на иммунные проблемы при травме и болезни1,2,3,4. Недавние захватывающие открытия ясно показали, что микроглии ни в коем случае не являются пассивными наблюдателями к мозгу полученных или патологических сигналов, но играют ключевую роль в контроле развития мозга и гомеостаза, например, поддерживая выживание нейронов, обрезка незрелых синапсов, содействие дифференциации линий олигодендроцитов, а также ангиогенез1. По мере того как больше функций микроглии выяснены, возбуждение более далее подпитывается людскими исследованиями генетики, которые показали что много нейродегенеративных генов риска заболевания, such as TREM2, большей частью или исключительн выражено микроглией5,6,7. . Учитывая их значение в развитии и правдоподобные болезни вождения роли, огромные усилия были направлены на наше понимание микроглиальной регуляции генов и функции в надежде найти новые терапевтические цели для нейродегенеративных заболеваний1,8.
Секвенирование РНК (РНК-сек) позволяет объективно охарактеризовать экспрессию генов типа клеток, что, в свою очередь, направляет ученых к изучению функций генов в плотных клеточных сетях7. РНК-сек в основном было сделано на массовых образцов, что привело к открытию гомеостатической микроглиальной подписи гена, который отличает их от других нервных и иммунных клеток9. Однако такой подход может упускать из виду молекулярные и функциональные различия между микроглией, особенно те, которые временно присутствуют в процессе развития, или связанные со старением и болезнями. Действительно, одноклеточный РНК-сек (scRNA-seq) предлагает чувствительность и разрешение, которые произвели революцию в этой области, выявив ранее недооцененную неоднородность микроглии в различных контекстах2,3,10. Кроме того, в связи с наличием других аналогичных иммунных клеток на цНС-циркуляции интерфейса, scRNA-seq предоставляет информацию, помогающую дизайн новых инструментов для разделения и функционально вскрыть эти связанные клетки с небольшим ипредварительных знаний2,11.
Был изобретен разнообразный набор платформ scRNA-seq, каждая из которых подходит для определенных приложений12. В целом, методы на основе капель, такие как 10x геномика, выше пропускной связи с (десятки) тысячи клеток последовательной в каждом запуске, и они менее избирательны для ввода, которые могут содержать смешанные популяции клеток, требующих широкой классификации. Методы на основе плит обеспечивают более высокую чувствительность и глубину чтения13,14, как правило, ориентации конкретных популяций от сортировки клеток, чтобы выявить тонкие различия или редкие стенограммы. Учитывая небольшой процент микроглиальных клеток, особенно субпопуляций, связанных с развитием или болезнями, среди всех типов клеток ЦНС, часто желательно изолировать микроглию от конкретной области, интересуемых, и получить глубокую и полноформатную транскриптомическую информацию, с тем чтобы понять их неоднородность.
Здесь мы предоставляем подробную информацию о том, как изолировать микроглии из различных областей мозга мыши расчленены из одного полушария, которые используются для одноклеточных (или объемных) РНК-сек после полуавтоматической пластины на основе процедуры подготовки библиотеки. Другое полушарие может быть использовано для гистологической проверки. Оптимизированный из ранее опубликованного метода9,этот протокол изоляции направлен на максимизацию выхода от небольшого количества исходных материалов, а тем временем поддерживать эндогенные профили экспрессии микроглиальных генов. Мы используем флуоресценцию активированных клеток сортировки (FACS) для обогащения микроглии (или других связанных иммунных клеток, представляющих интерес) в 96-колодных пластин и миниатюризации объемов реагентов для подготовки библиотеки для того, чтобы увеличить пропускную способность. Мы выделяем эту чувствительную платформу scRNA-seq, хотя могут быть применены и другие стратегии на основе пластин. Этот метод может быть легко адаптирован для изоляции микроглии от других расчлененных тканей, таких как травмы или заболевания очагов, и возраст мыши может варьироваться практически на всех послеродовых стадиях. Эффективная изоляция региональной микроглии для одноклеточных исследований транскриптомики будет способствовать лучшему пониманию их функций в области здравоохранения и болезней.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Как резидент макрофаги в центральной нервной системе, микроглии активно контролируют развитие мозга и гомеостаза, и их дисфункции могут управлять человеческими заболеваниями. Значительные успехи были сделаны, чтобы раскрыть молекулярные подписи гомеостатической микроглии, а также изменения их экспрессии генов в ответ на экологические стимулы. С появлением и созреванием одноклеточных геномных методологий все шире признается, что неоднородная микроглия может лежать в основе различных ролей, которые они играют в различных условиях развития и патологических условиях. Дальнейшее вскрытие такой неоднородности может быть достигнуто путем эффективной изоляции микроглии от данной области интереса, за которой следует чувствительное профилирование отдельных клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для быстрой изоляции микроглии из различных областей мозга в одном полушарии мозга для взрослых мышей. Мы также демонстрируем, как использовать эти отсортированные микроглии для одноклеточного секвенирования РНК на основе пластин. Мы обсуждаем приспособляемость этого метода к другим сценариям и предоставляем руководящие принципы для совершенствования системы для размещения крупномасштабных исследований.

Этот протокол описывает метод изоляции и сортировки микроглии из различных областей мозга в одном взрослом полушарии мозга, за которым следует scRNA-seq. Мы используем douncing для создания одной подвески клеток, а также в качестве первого шага для обогащения микроглии. Недостаточное или чрез?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Мы предоставляем протокол для изоляции микроглии от различных расчлененных областей полушария мозга взрослой мыши, а затем полуавтоматизированную подготовку библиотеки для глубокого одноклеточного секвенирования РНК полнометражных транскриптомов. Этот метод поможет выяснить функциональную неоднородность микроглии в здоровье и болезни.

Изоляция региона конкретных микроглии от одного взрослого полушария мозга мыши для глубокой одноклеточной РНК секвенирования

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Этот метод позволяет объективно каптуризации экспрессии генов микроглии на одноклеточном уровне, что может помочь выяснить молекулярную неоднородность микроглии в здоровом и больном мозге. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает детальную процедуру быстрой изоляции микроглии от различных областей мозга и показывает, как эффективно генерировать игровой базой одноклеточные библиотеки RA6 для глубокого секвенирования. Для начала этой процедуры подготовьте все необходимые буферы и решения, изложенные в текстовом протоколе, и охладите их на льду.После усыпания и обезглавливания мыши, используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать кожу на голове, чтобы разоблачить череп под ним. Затем прорезать сагиттаальный шов, овсяный шов и корональный шов. Используйте типсы, чтобы снять обе стороны теменной кости и межпариетальной кости, не повреждая ткани и осторожно переместить мозг в вскрытие чашки Петри, содержащей средний A.Using предварительно охлажденного лезвия, сократить мозг через середину на два полушария.Используйте 55 типсов, чтобы отделить мозжечок от корковой доли и ствола мозга. Затем используйте 55 типсов, чтобы тщательно вскрыть гиппокамп и стриатум из коры и перенести каждую ткань в отдельную коллекцию чашки Петри. Во-первых, используйте лезвие бритвы, чтобы нарезать каждую область мозга на мелкие кусочки, которые меньше, чем один кубический миллиметр.Используя одноми миллилитровую пипетку с отрезанным кончиком, перенесите кусочки ткани в предварительно охлажденные гомогенизаторы Dounce. Гомогенизировать ткани, медленно скручивания поршня в и из Dounce гомогенизатора в течение шести до 10 полных ударов, пока не видимые куски присутствуют. Затем перенесите диссоциированные ткани в 50 миллилитровых трубок через 70 микрометровых ситечкой.Промыть каждый Dounce гомогенизатор и поршень в общей сложности шесть миллилитров холодной среды, а затем передать полоскания в 15 миллилитров трубки для центрифугации. Центрифуга одноклеточной подвески при 400 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут с перерывом в пять. Промыть один большой столбец истощения и три больших столбца выбора в магнитном сепараторе с тремя миллилитров MCS.Когда центрифугация образцов тканей завершена, пипетка и отказаться от супернатанта, не нарушая гранулы. Повторное использование клеток в буфере MCS, который содержит ингибитор RNase. Добавьте 100 микролитров шариков удаления миелина в каждую трубку, содержащую повторно приостановленные клетки из коры и мозжечка, и добавьте 50 микролитров бусинок удаления миелина в каждую из трубок, содержащих повторно приостановленные клетки из гиппокампа и стриатума.Инкубировать трубки на льду в течение 10 минут. После этого добавьте MCS в трубку, содержащую корковые клетки, чтобы довести его объем до двух миллилитров и до остальных трубок, чтобы довести каждый из их объемов до одного миллилитра. После того, как столбцы пусты для полоскания буфера, загрузите два миллилитров корковых ячеек на большой столбец истощения и один миллилитр друг друга подвески ячейки на отдельные большие столбцы отбора.Затем вымойте большие столбцы истощения одним миллилитром буфера MCS и помойте каждый большой столбец выделения дважды, используя один миллилитр буфера MCS для каждой стирки. Фильтр клетки через 35 микролитер ситечко шапки в круглое дно FACS труб. Центрифуга эти трубки в 400 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки.Затем медленно вылейте супернатант и мазок края трубки на бумаге ткани. Перепродюсовать клетки в каждой трубке с 300 микролитров буфера FACS. Во-первых, добавьте пять микролитров рецепторов мыши FC блок реагент для каждой трубки.Инкубировать на льду в течение пяти минут. Затем добавьте один микролитер cd45 PE размером семь и один микролитер CD11B BV421 к каждой трубке. Инкубировать трубки на шейкер при комнатной температуре в течение 10 минут.После этого добавьте два миллилитров буфера FACS для мытья. Центрифуга при 400 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Повторное использование клеток в каждой трубке с 400 микролитров буфера FACS, содержащих один микролитер ингибитора RNase и 0,5 микролитров пропидия йодида.Следуя стандартной процедуре FACS, сортируют одну живую микроглию со 100-метровым соплом в 96-колодец ПЦР пластин, которые содержат четыре микролитера буфера лиза в каждой колодец. Кратко вихрь пластин и спина их вниз с помощью скамейки верхней центрифуги. Храните тарелки при температуре минус 80 градусов по Цельсию до подготовки библиотеки.Когда вы будете готовы к работе, разморозьйте плиту на льду. Используйте тепловой циклер для выполнения первой транскрипции для генерации кДНК и усиления кДНК с дополнительным шагом пищеварения экзонуклеазы, как указано в текстовом протоколе. После этого очистите cDNA, добавив 18 микролитров магнитных бусин к каждой хорошо.Инкубировать пластину на магнитной подстоять в течение пяти минут. Затем снимите супернатант и мыть образцы дважды с свежеприготовленным 80%этанола с использованием 80 микролитров этанола на колодец для каждой стирки. Для выполнения тегментации используйте нанолитровую трубочную машину для смешивания 0,4 микролитров каждого образца cDNA с 1,2 микролитров реагентов Tn5 tagmentation из комплекта подготовки библиотеки в пластине 384-колодец при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут.Чтобы остановить реакцию тегментации, добавьте 0,4 микролитера буфера нейтрализации при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее, на 384 индексах и 1,2 микролитерах ПЦР смешиваются с образцами и усиливают библиотеки, как указано в текстовом протоколе. Объединить все отдельные библиотеки из той же пластины 384 хорошо вместе и использовать магнитные бусы для очистки окончательных объединенных библиотек.В этом исследовании, микроглии изолированы от коры головного мозга, мозжечка, гиппокампа и стриатума полушария мозга взрослой мыши. Подготовленная клеточная подвеска изучается под микроскопом с помощью трипан-голубого и гемоцитометра для оценки урожайности, жизнеспособности клеток и эффективности удаления миелина перед выполнением окрашивания антител. Общее количество клеток на данный момент должно быть более 30 000 для коры и более 5000 для других тканей.Более 90% клеток должны быть жизнеспособными с небольшим количеством мусора миелина. FacS машина используется для сортировки микроглии, которые, как правило, CD45 низким и CD11B положительным. Успешная изоляция должна генерировать более 80%микроглии из всех живых однок клеток, по крайней мере для корковых тканей.После того, как отдельные микроглии захвачены в буфер лиза, РНК высвобождается, а затем обратно транскрибируется в cDNA, который затем усиливается в течение 23 циклов. Как капиллярная электрофорезная платформа, анализатор фрагментов и высокочувствительные наборы фрагментов NGS обеспечивают быструю и точную информацию о распределении размеров, а также количество молекул cDNA, присутствующих в каждом колодец 96-хорошо пластины. Образцы, показывающие мазок между 500 и 5000 базовых пар и выше определенного порога концентрации могут быть использованы для библиотек.Образцы секвенированы на глубину более одного миллиона необработанных считывания на клетку, что насыщает способность обнаружения одноклеточной методологии секвенирования РНК. С картографической скоростью около 60%над 2, 000 генов могут быть обнаружены на микроглиальные клетки. Ранее опубликованные данные, полученные из этого метода изоляции, воспроизводятся в результате независимых экспериментов, демонстрируя чувствительность к обнаружению микроглии конкретных генов в последовательной популяции.С информацией одиночных транскрипций микроглии, исследователя могут открыть уникально населенности клетки в смысле их интереса, и более далее изучить функциональную релевантность этих нов выявленных населенностей.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Изоляция и извлечение RNA нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Одноместный клеточной РНК последовательности нейронов дневно обозначенные мыши, с помощью ручной сортировки и двойной в Vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...