Name: isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno ve Spyros Darmanis'e bu protokolün geliştirilmesi sırasında ki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford Paylaşılan FACS Tesisi, özellikle Meredith Weglarz ve Lisa Nichols teşekkür ederiz; Yen Tran, Michael Eckart Stanford Protein ve Nükleik Asit Tesisi (PAN) filme için büyük destek için. Bu çalışma JPB Vakfı ve Vincent J. Coates Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Kemirgenlerle ilgili tüm prosedürler, ulusal ve eyalet yasalarına ve politikalarına uygun olan Stanford Üniversitesi yönergelerine uygundur. Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi'nin Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Paneli tarafından onaylandı.
NOT: Tüm çözelti ve tampon kompozisyonları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.
1. Hücre İzolasyon Günü'ne Hazırlık
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın ...

<ol>
	<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease.">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing.">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li><li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer's+Disease.">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li><li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+variants+in+Alzheimer's+disease.">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li><li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer's+disease.">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration.">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes.">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li><li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment.">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li><li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis.">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).</li><li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments.">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods.">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium.">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer's+disease.">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).</li><li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol.">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), 79-89 (2018).</li></ol>

Mikroglia aktif CNS diğer hücre tipleri ile etkileşim, ve çevresel uyaranlara çok duyarlıdır. İzolasyon işlemi sırasında gen ekspresyonundaki inflamatuar yanıtları ve anormal değişiklikleri en aza indirmek için, bu protokol daha önce yayınlanmış bir yöntem9'dandüzene sokulmuştur ve artık mikroglia'yı tek bir fare beyninin birçok bölgesinden paralel olarak izole etmek uygundur. Dokular ve reaktifler soğuk sıcaklıkta tutulur ve sınırlı doku boyutlarına göre daha az...

Tüm sinir hücrelerinin %5−%10'unu temsil eden mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS)1'edağılmış yerleşik makrofajlardır. Kan-beyin bariyerinin arkasında korunan, sağlıklı bir yetişkin beyin tipik mikroglia hızla genişletmek ve parankim nöronlar ve diğer glial hücreleri ile etkileşime geri birçok ince süreçler içerir. Mikroglia da belirli gelişimaşamalarında veya yaralanma ve hastalık1bağışıklık sorunları üzerine artan fagositik fonksiyon ile ilişkili amipoid morfolojisi benimseyebilir 1,2,3,4. Son heyecan verici keşifler açıkça mikroglia beyin kaynaklı veya patolojik sinyaller için pasif seyirci olduğunu göstermiştir, ama beyin gelişimi ve homeostaz kontrolünde önemli roller oynamak, örneğin, nöronal sağkalım destekleyerek, budama olgunlaşmamış sinapslar, oligodendrocyte soy hücrelerinin farklılaşması teşvik yanı sıra anjiyogenez1. Mikroglia daha fonksiyonları açıklığa kavuştururken, heyecan daha fazla insan genetik çalışmaları ile körüklenir, hangi birçok nörodejeneratif hastalık risk genleri gösterdi, TREM2 gibi, ağırlıklı olarak veya sadece microglia tarafından ifade5,6,7. Geliştirme ve makul hastalık sürüş rolleri onların önemi göz önüne alındığında, muazzam çaba son zamanlarda nörodejeneratif hastalıklar için yeni terapötik hedefler bulma umuduyla mikroglial gen regülasyonu ve fonksiyonu anlayışımıza doğru konulmuştur1,8.
RNA dizilemesi (RNA-seq) hücre tipine özgü gen ekspresyonunun tarafsız karakterizasyonuna izin verir, bu da bilim adamlarına yoğun hücresel ağlardaki gen fonksiyonlarını araştırmaya rehberlik eder7. RNA-seq çoğunlukla toplu örnekler üzerinde yapılmış, diğer nöral ve bağışıklık hücrelerinden ayıran bir homeostatik mikroglial gen imzası keşfiyol açan9. Ancak, böyle bir yaklaşım mikroglia arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları göz ardı edebilir, özellikle de geçici olarak geliştirme mevcut, ya da yaşlanma ve hastalık ile ilişkili. Nitekim, tek hücreli RNA-seq (scRNA-seq) çeşitli bağlamlarda mikroglia daha önce az takdir heterojenlik ortaya çıkararak alanında devrim var duyarlılık ve çözünürlük sunuyor2,3,10. Buna ek olarak, CNS-dolaşım arayüzüdiğer benzer bağışıklık hücrelerinin varlığı nedeniyle, scRNA-seq çok az ön bilgi ile bu ilgili hücreleri ayırmak ve işlevsel olarak bu ilgili hücrelerin diseksiyon yeni araçların tasarımına yardımcı bilgi sağlar2,11.
ScRNA-seq platformları çeşitli bir dizi icat edilmiştir, her belirli uygulamalar için uygun12. Genel olarak, 10x Genomik gibi damlacık tabanlı yöntemler, her çalıştırmada dizili (on) binlerce hücre ile elde etme açısından daha yüksektir ve geniş kategorizasyon gerektiren karışık hücre popülasyonları içerebilecek girdi için daha az seçicidir. Plaka tabanlı yöntemler daha yüksek duyarlılık sağlamak ve derinliği13okumak,14, genellikle ince farklılıklar veya nadir transkript ortaya çıkarmak için hücre sıralama belirli popülasyonları hedefleme. Mikroglial hücrelerin küçük yüzdesi göz önüne alındığında, özellikle bu gelişme- veya hastalık la ilişkili alt popülasyonlar, tüm CNS hücre tipleri arasında, genellikle ilgi belirli bir bölgeden mikroglia izole etmek ve onların heterojenlik anlamak için derin ve tam uzunlukta transkripsiyonik bilgi elde etmek için arzu edilir.
Burada, yarı otomatik plaka tabanlı kütüphane hazırlama prosedürü nden sonra tek hücreli (veya toplu) RNA-seq için kullanılan tek bir yarımküreden parçalanmış farklı fare beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek için nasıl ayrıntıları sağlar. Diğer yarımküre daha sonra histolojik doğrulama için kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir yöntem9aerodinamik, Bu izolasyon protokolü başlangıç malzemelerin in verimi maksimize etmeyi amaçlamaktadır, ve bu arada endojen mikroglial gen ekspresyonu profilleri korumak. Mikrogliayı (veya diğer ilgili bağışıklık hücrelerini) 96 kuyuplakaya dönüştürmek ve üretim hacmini artırmak için kitaplık hazırlama için reaktif lerin hacimlerini minyatürleştirmek için floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Diğer plaka tabanlı stratejiler uygulansa da bu hassas scRNA-seq platformuna vurgu yapıyoruz. Bu yöntem, mikroglia'yı yaralanma veya hastalık odakları gibi diğer diseksiyon lu dokulardan izole etmek için kolayca uyarlanabilir ve farenin yaşı hemen hemen her doğum sonrası evreye kadar değişebilir. Tek hücreli transkripsiyon çalışmaları için bölgesel mikrogliaverimli izolasyon sağlık ve hastalık fonksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 M Betaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B0300-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td>
			<td>Kapa Biosciences</td>
			<td>Cat# KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp &#8211; 6,000 bp)</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td>Cat# DNF-474-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Cat# A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LS002007</td>
			<td>Working solution: 12500 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERCC RNA Spike-In Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 4456740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Exonuclease (5 U/&#956;l)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>Cat# M0262S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc block</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat# 553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin removal beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>Cat# 130-096-433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# 20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCRClean DX beads</td>
			<td>Aline Biosciences</td>
			<td>Cat# C-1003-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P3566</td>
			<td>Staining: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermal Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>Cat# 101236; RRID: AB_11203704</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td>
			<td>Staining: 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>Cat# 2313B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/&#956;l)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>Cat# 639538</td>
			<td>Containing 5x First strand buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#956;M ISPCR Oligo: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-dT30VN primer: 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO 5&#39; - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3&#39; (&#34;r&#34; is forribobases and &#34;+&#34; is for an LNA base)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Picelli et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89005-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-shell 96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer, 2 ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large depletion column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large selection column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAzap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (70 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito HTS nanoliter pipetting robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of region-specific microglia from one adult mouse brain hemisphere for deep single-cell rna sequencing

Merkezi sinir sisteminde yerleşik makrofajlar olarak, mikroglia aktif beyin gelişimi ve homeostaz kontrol, ve onların işlev bozuklukları insan hastalıkları sürücü olabilir. Homeostatik mikroglianın moleküler imzalarının yanı sıra çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda yapılan değişiklikleri ortaya çıkarmak için önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Tek hücreli genomik metodolojilerin gelişi ve olgunlaşmasıyla, heterojen mikroglianın farklı gelişimsel ve patolojik koşullarda oynadıkları çeşitli rollerin altında yattığı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bu tür heterojenliğin daha fazla diseksiyonu, mikroglianın belirli bir ilgi bölgesinden etkin bir şekilde izole edilmesi ve ardından tek tek hücrelerin hassas profilinin alınması yla elde edilebilir. Burada, tek bir yetişkin fare beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Ayrıca bu sıralanmış mikroglianın plaka bazlı derin tek hücreli RNA dizilimi için nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz. Bu yöntemin diğer senaryolara uyarlanabilirliğini tartışır ve büyük ölçekli çalışmalara uyum sağlayacak şekilde sistemin iyileştirilmesi için yönergeler sağlarız.

Bu protokol, bir yetişkin perfüzyon beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek ve sıralamak için bir yöntem açıklar, scRNA-seq takip. Biz tek hücreli süspansiyon oluşturmak için douncing kullanın ve aynı zamanda mikroglia zenginleştirmek için ilk adım olarak. Yetersiz veya aşırı douncing verimi azaltır. Buna ek olarak, yetişkin fare beyinleri miyelin yüksek düzeyde içerir, aynı zamanda düzgün kaldırılmazsa sıralama verimliliği ve verimazaltabilir. Bu nedenle, ant...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Bu yöntem, mikroglia gen ekspresyonunun tek hücreli düzeyde tarafsız bir şekilde yakalanmasını sağlar, bu da sağlıklı ve hastalıklı bir beyinde mikroglianın moleküler heterojenliğini açıklığa kavuşturmada yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir prosedür sağlar ve nasıl verimli derin sıralama için tek hücreli RA6 kütüphaneleri oyun tabanı oluşturmak için gösterir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm arabellekleri ve çözümleri hazırlayın ve buz üzerinde soğutun.Ötenazi ve fare nin kafasını kestikten sonra, altındaki kafatası ortaya çıkarmak için baş deri açık kesmek için küçük makas kullanın. Sonra, sagittal sütür, lambdoidal sütür ve koronal sütür ile kesti. Dokuya zarar vermeden parietal kemik ve interparietal kemiğin her iki tarafını koparmak için forseps kullanın ve beyni dikkatlice orta A içeren bir diseksiyonu petri kabına taşıyın.Serebellum kortikal lob ve beyin sapı ayırmak için 55 numara forceps kullanın. Daha sonra, hipokampus ve korteksten striatum dikkatle incelemek ve ayrı bir koleksiyon Petri çanak içine her doku transferi için 55 numara forceps kullanın. İlk olarak, bir milimetreden daha az ince parçalar halinde her beyin bölgesi doğrayın için bir jilet kullanın.Ucu kesilmiş bir mililitrelik pipet kullanarak, önceden soğutulmuş Dounce homogenizers içine doku parçaları aktarın. Görünür bir parça bulunana kadar altı ila 10 tam vuruş için piston'u Dounce homogenizer'ine yavaşça bükerek dokuyu homojenize edin. Daha sonra, 70 mikrometre süzgeçler aracılığıyla 50 mililitre tüpler içine ayrıştırılmış dokular aktarın.Her dounce homogenizer ve piston soğuk orta A altı mililitre toplam durulayın sonra santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp için durulama aktarın. Santrifüj tek hücreli süspansiyon 400 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için beş bir mola ile. Bir büyük tükenme sütunu ve üç büyük seçim sütununu üç mililitre MCS ile manyetik ayırıcıda durulayın.Doku örnekleri için santrifüj tamamlandığında, pipet dışarı ve pelet rahatsız etmeden supernatant atın. RNase inhibitörü içeren MCS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Korteks ve serebellum dan yeniden askıya alınan hücreleri içeren her tüp için miyelin kaldırma boncuk 100 mikrolitre ekleyin ve hipokampus ve striatum yeniden askıya hücreleri içeren tüplerin her birine miyelin kaldırma boncuk 50 mikrolitre ekleyin.Tüpleri 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, iki mililitre kadar hacmini getirmek için kortikal hücreleri içeren tüp mcs ekleyin ve kalan tüplere bir mililitre kadar kendi hacimleri her getirmek için. Sütunlar durulama arabelleği boş aldıktan sonra, iki mililitre kortikal hücreyi büyük tükenme sütununa ve bir mililitresini ayrı büyük seçim sütunlarına yükleyin.Ardından, büyük tükenme sütunundakileri bir mililitre MCS arabelleğiyle yıkayın ve her büyük seçim sütununu her yıkama için bir mililitre MCS tamponu kullanarak iki kez yıkayın. Hücreleri 35 mikrolitre süzgeç kapağından yuvarlak alt FACS tüplere süzün. Bu tüpleri 400 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca hücreyi peletlemek için santrifüj edin.Sonra, yavaş yavaş supernatant dökün ve kağıt mendil üzerinde tüp kenarına dab. 300 mikrolitre FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın. İlk olarak, her tüpe fare FC reseptörlerinin bloke reaktif beş mikrolitre ekleyin.Beş dakika buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, her tüpe bir mikrolitre CD45 PE boyutu yedi ve bir mikrolitre CD11B BV421 ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayıcıya yerleştirin.Bundan sonra, yıkamak için FACS tampon iki mililitre ekleyin. 400 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca hücreleri pelet santrifüj. Bir mikrolitre RNase inhibitörü ve 0,5 mikrolitre propidium iyodür içeren 400 mikrolitre FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.Standart FACS prosedürünü takiben, 100 mikrometre nozüllü tek canlı mikrogliayı, her kuyuda dört mikrolitre lysis tamponu içeren 96 kuyulu PCR plakalara sıralayın. Kısaca plakaları girdap ve bir tezgah üst santrifüj kullanarak aşağı spin. Plakaları kütüphane hazırlığına kadar eksi 80 derecede saklayın.Devam etmeye hazır olduğunuzda, buz üzerinde plaka eritin. CDNA oluşturmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi ek bir ekeksikleazazsa sindirim adımı ile cDNA yükseltmek için ilk transkripsiyon gerçekleştirmek için bir termal döngückullanın. Bundan sonra, her kuyuya 18 mikrolitre manyetik boncuk ekleyerek cDNA'yı arındırın.Plakayı manyetik bir standda beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, supernatant çıkarın ve her yıkama için iyi başına etanol 80 mikrolitre kullanarak taze yapılmış% 80 etanol ile iki kez örnekleri yıkayın. Etiketleme gerçekleştirmek için, her cDNA numunesinin 0,4 mikrolitresini kütüphane hazırlama kitinden 1,2 mikrolitre Tn5 etiketleme reaktifiyle 10 dakika boyunca 55 derece lik bir plakaiçinde 384 kuyuluk bir plakayla karıştırmak için nanolitre lik bir pipetleme makinesi kullanın.Etiketleme reaksiyonunu durdurmak için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0,4 mikrolitre nötralizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, 384 indeks ve 1.2 mikrolitre PCR örneklere karıştırılır ve metin protokolünde belirtildiği gibi kitaplıkları yükseltin. Aynı 384 kuyulu plakadan tüm kütüphaneleri bir araya getirin ve son havuzlu kütüphaneleri arındırmak için manyetik boncuklar kullanın.Bu çalışmada, mikroglia korteks izole edilir, serebellum, hipokampus, ve yetişkin bir farebeyin hemisfer striatum. Hazırlanan hücre süspansiyonu antikor boyama yapmadan önce miyelin çıkarma verimi, hücre canlılığı ve etkinliğini tahmin etmek için trypan mavisi ve hemositometre kullanılarak mikroskop altında incelenir. Bu noktada toplam hücre sayısı korteks için 30,000 ve diğer dokular için 5.000'den fazla olmalıdır.Hücrelerin %90'Dan fazlası az miyelin enkazıyla birlikte yaşayabilir. Bir FACS makine genellikle CD45 düşük ve CD11B pozitif olan mikroglia sıralamak için kullanılır. Başarılı izolasyon tüm canlı tek hücrelerden en azından kortikal doku için% 80'den fazla mikroglia üretmelidir.Bireysel mikroglia lysis tamponuna yakalandıktan sonra, RNA serbest bırakılır ve daha sonra cDNA'ya aktarılır ve daha sonra 23 döngü boyunca yükseltilir. Bir kılcal elektroforez platformu olarak, parça analizörü ve yüksek duyarlı NGS parça kitleri boyut dağılımı hakkında hızlı ve doğru bilgi sağlar, yanı sıra 96-kuyu plaka her kuyuda bulunan cDNA moleküllerinin miktarı. 500 ile 5,000 baz çifti arasında bir yayma gösteren ve belirli bir konsantrasyon eşiğinin üzerinde olan örnekler kütüphaneler yapmak için kullanılabilir.Örnekler, tek hücreli RNA sıralama metodolojisinin algılama gücünü doygunlaştıran hücre başına bir milyondan fazla ham okuma derinliğine sıralanır. 2 üzerinden yaklaşık% 60 bir haritalama oranı ile, mikroglial hücre başına 000 genler tespit edilebilir. Bu izolasyon yönteminden elde edilen daha önce yayınlanmış veriler bağımsız deneylerden üretilir ve sıralı popülasyonda mikroglia spesifik genlerin saptanma hassasiyetini gösterir.Tek mikroglia transkripsiyonları bilgi ile, araştırmacılar kendi ilgi bağlamında benzersiz hücre popülasyonları keşfedebilir, ve daha fazla bu yeni tanımlanan popülasyonların işlevsel alaka çalışma.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...