Name: tissue-engineered graft for circumferential esophageal reconstruction in rats
Uploaded: 2020-02-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI16C0362) en Basic Science Research Programma via de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (2017R1C1B2011132). De biospecimens en gegevens die in deze studie werden gebruikt, werden verstrekt door de Biobank van seoul National University Hospital, een lid van Korea Biobank Network.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC nr. 17-0164-S1A0) van het Seoul National University Hospital.
1. Steigerproductie
OPMERKING: Tweelaagse slokdarmsteigers worden vervaardigd door elektrospinning en 3D-printen te combineren. Het binnenste membraan van de buisvormige steiger werd vervaardigd door elektrospinenpolyurethaan (PU) met roterende roestvrijstalen mandrels als de collectoren<s...

<ol>
	<li>Irino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+outcomes+after+replacement+of+the+esophagus+with+gastric,+colonic,+or+jejunal+conduits:+a+systematic+literature+review.">Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review.</a> Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).</li><li>Flanagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophagectomy+and+Gastric+Pull-through+Procedures:+Surgical+Techniques,+Imaging+Features,+and+Potential+Complications.">Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications.</a> Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).</li><li>Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+outcomes+of+different+approaches+to+esophageal+replacement+in+long-gap+esophageal+atresia:+A+systematic+review.">Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review.</a> Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).</li><li>Luc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+and+matured+esophageal+scaffold+for+circumferential+esophagus+replacement:+Proof+of+concept+in+a+pig+model.">Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model.</a> Biomaterials. 175, 1-18 (2018).</li><li>Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+oesophageal+muscle+layer+from+oesophagus+acellular+matrix+scaffold+using+adipose-derived+stem+cells.">Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).</li><li>La Francesca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regeneration+and+remodeling+of+the+pig+esophagus+after+circumferential+resection+using+a+retrievable+synthetic+scaffold+carrying+autologous+cells.">Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).</li><li>Ponten, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+severe+mediastinal+bleeding+after+esophagectomy:+a+potentially+lethal+complication.">Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).</li><li>Catry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+Esophageal+Replacement+by+a+Tissue-engineered+Substitute+Using+Mesenchymal+Stem+Cells:+An+Experimental+Study+in+Mini+Pigs.">Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs.</a> Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).</li><li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+preparation+of+bio-tubular+scaffolds+for+fabricating+artificial+vascular+grafts+by+combining+electrospinning+and+a+3D+printing+system.">Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).</li><li>Kim, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Esophagus+via+Bioreactor+Cultivation+for+Circumferential+Esophageal+Reconstruction.">Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinational+effects+of+mechanical+forces+and+substrate+surface+characteristics+on+esophageal+epithelial+differentiation.">Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).</li><li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyurethane+scaffolds+seeded+with+autologous+cells+can+regenerate+long+esophageal+gaps:+An+esophageal+atresia+treatment+model.">Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).</li><li>Nakase, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathoracic+esophageal+replacement+by+in+situ+tissue-engineered+esophagus.">Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).</li><li>Kwiatek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+esophagus+in+eosinophilic+esophagitis.">Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis.</a> Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).</li><li>Anjum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocomposite+nanofiber+matrices+to+support+ECM+remodeling+by+human+dermal+progenitors+and+enhanced+wound+closure.">Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).</li><li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCL+and+PCL-gelatin+nanofibers+as+esophageal+tissue+scaffolds:+optimization,+characterization+and+cell-matrix+interactions.">PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).</li></ol>

Bestaande dierstudies over kunstmatige slokdarm worden nog steeds beperkt door verschillende kritische factoren. De ideale kunstmatige slokdarm steiger moet biocompatibel zijn en hebben uitstekende fysieke eigenschappen. Het moet in staat zijn om het mucosale epitheel in de vroege postoperatieve periode te regenereren om anastomotische lekkage te voorkomen. Regeneratie van de binnenste cirkelvormige en buitenste longitudinale spierlagen is ook belangrijk voor functionele peristalse12,<s...

De behandeling van slokdarmaandoeningen, zoals aangeboren misvormingen en slokdarmcarcinomen, kan leiden tot structureel segmentverlies van de slokdarm. In de meeste gevallen zijn autologe vervangende grafts uitgevoerd, zoals maagophaalleidingen of darminterposities,1,2. Echter, deze slokdarmvervangingen hebben een verscheidenheid aan chirurgische complicaties en heroperatie risico's3. Zo kan het gebruik van weefsel-engineered slokdarm steigers nabootsen van de inheemse slokdarm een veelbelovende alternatieve strategie voor uiteindelijk regenereren verloren weefsels4,5,6.
Hoewel een weefsel-engineered slokdarm potentieel biedt een alternatief voor de huidige behandelingen van slokdarmafwijkingen, er zijn aanzienlijke barrières voor de in vivo toepassing. Postoperatieve anastomotische lekkage en necrose van de geïmplanteerde slokdarmsteiger leiden onvermijdelijk tot een dodelijke infectie van de omliggende aseptische ruimte, zoals het mediastinum7. Daarom is het uiterst belangrijk om voedsel- of speekselbesmetting in de wond en nasogastrische buis te voorkomen. Gastrostomie of intraveneuze voeding moet worden overwogen totdat de primaire wondgenezing is voltooid. Tot op heden, slokdarmweefsel engineering is uitgevoerd in grote diermodellen, omdat grote dieren kunnen alleen worden gevoed door intraveneuze hyperalimentatie gedurende 2-4 weken na implantatie van de steiger8. Een dergelijk niet-oraal voedingsmodel is echter niet vastgesteld voor vroegtijdige overleving na slokdarmtransplantatie bij kleine dieren. Dit komt omdat de dieren waren zeer actief en oncontroleerbaar, zodat ze niet konden houden van de voedingssonde in hun magen voor een langere periode van tijd. Om deze reden zijn er weinig gevallen van succesvolle slokdarmtransplantatie bij kleine dieren.
Gezien de omstandigheden van slokdarmweefseltechniek, ontwierpen we een tweelaags buisvormig schavot bestaande uit elektrogesponnen nanovezels (binnenlaag; Figuur 1A) en een 3D-geprinte streng (buitenlaag; Figuur 1B) met inbegrip van een gewijzigde gastrostomietechniek. De interne nanovezel is gemaakt van PU, een niet-afbreekbaar polymeer, en voorkomt de lekkage van voedsel en speeksel. De externe 3D-geprinte strengen zijn gemaakt van biologisch afbreekbare polycaprolacton (PCL), die mechanische flexibiliteit kan bieden en zich kan aanpassen aan peristaltische beweging. Menselijke vet-afgeleide mesenchymale stamcellen (hAD-MSCs) werden gezaaid op de binnenste laag van het schavot om re-epithelisatie te bevorderen. De nanovezelstructuur kan de initiële regeneratie van slijm vergemakkelijken door een structurele extracellulaire matrix (ECM) omgeving te bieden voor celmigratie.
We hebben ook de overlevingskans en de bioactiviteit van de ingeënte cellen verhoogd door middel van bioreactorteelt. De geïmplanteerde steiger was bedekt met een schildklier flap om meer stabiele regeneratie van de slokdarm slijmvlies en spierlaag mogelijk te maken. In dit rapport beschrijven we protocollen voor slokdarmweefseltechnieken, waaronder steigerproductie, mesenchymale stamcelgebaseerde bioreactorteelt, een bypassvoedingstechniek met gemodificeerde gastrostomie en een gemodificeerde chirurgische anastomose techniek voor circumferential slokdarmreconstructie in een rattenmodel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic cage</td>
			<td>TEUNGDO BIO &#38; PLANT</td>
			<td>JD-C-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil (50 mg/g dose)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>1000000188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% xylazine hydrochloride (Rumpun)</td>
			<td>Byely</td>
			<td>Q-0615-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Vicryl</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>W9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 Vicryl</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>W2813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic gentamicin (Septopal).</td>
			<td>Septopal</td>
			<td>0409-1207-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer, ph6.0, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-23879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic stain kit</td>
			<td>ScyTeK</td>
			<td>ETS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin cap</td>
			<td>Hyupsung Medical</td>
			<td>HS-T-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hMSC (STEMPRO) / growth medium 
			(MesenPRO RSTM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R7788-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>PK7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin13</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-97797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability Assay Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonadherent 
			24-well tissue culture plates.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3072115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone (PCL) polymer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane (PU+A2:A24) polymer</td>
			<td>Lubrizol</td>
			<td>2363-80AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>NanoNC</td>
			<td>HV100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rumpun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Q-0615-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone T-tube</td>
			<td>Sewoon Medical</td>
			<td>2206-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycin Eye Ointment</td>
			<td>Pfizer Pharmaceutical Korea</td>
			<td>W01890011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac Laboratories</td>
			<td>Q-0042-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome stain kit</td>
			<td>ScyTeK</td>
			<td>TRM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc 14014</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-engineered graft for circumferential esophageal reconstruction in rats

Het gebruik van biocompatibele materialen voor circumferential eesofagereconstructie is een technisch uitdagende taak bij ratten en vereist een optimale implantaattechniek met voedingsondersteuning. Onlangs zijn er vele pogingen tot slokdarmweefsel engineering, maar het slagingspercentage is beperkt als gevolg van moeilijkheden in de vroege epithelisatie in de speciale omgeving van peristalis. Hier ontwikkelden we een kunstmatige slokdarm die de regeneratie van het slokdarmslijmvlies en spierlagen kan verbeteren door middel van een tweelaags buisvormig schavot, een mesenchymale stamcelgebaseerd bioreactorsysteem en een bypassvoedingtechniek met aangepaste Gastrostomy. Het schavot is gemaakt van polyurethaan (PU) nanovezels in een cilindrische vorm met een driedimensionale (3D) geprinte polycaprolactone streng gewikkeld rond de buitenmuur. Voorafgaand aan de transplantatie werden mesenchymale stamcellen van menselijke afkomst in het lumen van het schavot gezaaid en werd de bioreactorteelt uitgevoerd om de cellulaire reactiviteit te verbeteren. We verbeterden de overlevingsgraad van graft door chirurgische anastomose toe te passen en de geïmplanteerde prothese te bedekken met een schildklierflap, gevolgd door tijdelijke nonorale gastrostomievoeding. Deze grafts waren in staat om de bevindingen van de eerste epitheelalisatie en spierregeneratie rond de geïmplanteerde sites, zoals blijkt uit histologische analyse, te recapituleren. Bovendien werden verhoogde elastinevezels en neovascularisatie waargenomen in de periferie van de graft. Daarom presenteert dit model een potentiële nieuwe techniek voor circumferential eesofageale reconstructie.

Figuur 1 toont een schematisch diagram van het productieproces van de PU-PCL tweelaagse buisvormige steiger. De PU-oplossing werd geëlektrospun van een naald van 18 G om een cilindrische interne structuur te maken met een dikte van 200 μm. Vervolgens werd de gesmolten PCL op regelmatige tijdstippen op de buitenwand van de PU nanovezel gedrukt. De oppervlaktemorfologie van de binnen- en buitenwanden van de voltooide buisvormige steiger is te zien in de scann...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats at JoVE.com

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Slokdarmreconstructie is een uitdagende procedure, en de ontwikkeling van een weefsel-engineered slokdarm die regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier mogelijk maakt en die kan worden geïmplanteerd als een kunstmatige graft is noodzakelijk. Hier presenteren we ons protocol om een kunstmatige slokdarm te genereren, inclusief steigerproductie, bioreactorteelt en verschillende chirurgische technieken.

Tissue-Engineered Graft voor circumferential slokdarmreconstructie bij ratten

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Circumferential slokdarm reparatie is technisch uitdagend in een rat model, noodzakelijk de ontwikkeling van weefsel-engineered slokdarm die de regeneratie van slokdarmslijmvlies en spier zonder slokdarm anastomose lekkage mogelijk maakt. We hebben een tweelaags buisbiediger geïmplementeerd als proefmodel, bestaande uit binnennanofiber en een buitenste 3D-printen streng in combinatie met een microvasculaire anastomose om speeksellekkage na transplantatie te minimaliseren. Conventionele standaard slokdarmreconstructie wordt geassocieerd met een breed scala aan complicaties en morbiditeit.Daarom kan slokdarmweefsel engineering een veelbelovende alternatieve strategieën voor het ontwikkelen van een inheemse patiënt slokdarm modellen. De combinatie van hybride steiger, bioreactor teelt, en een orale voeding systeem kan worden toegepast op elk systeem dat een soortgelijke verontreinigde omgeving met zijn continue mechanische druk heeft. Begin met het steriliseren van een 3D-geprinte slokdarmsteiger met een blootstelling van een uur aan ultraviolet licht, een 10-minuten weken in ethanol, en drie wasbeurten met PBS.Na de laatste wasbeurt, plaats de twee-gelaagde buisvormige steiger in een niet-adherent 24-well weefsel cultuurplaat, en voorzichtig maar gelijkmatig een keer 10 toe te voegen aan de zes vet-afgeleide menselijke mesenchymale stamcellen per milliliter van kelder membraan matrix aangevuld met groeimedium aan het binnenoppervlak van het steiger. Gebruik een pulsatiele stroom bioreactor systeem om stevig vast te stellen de cel-gezaaide buisvormige steiger aan de acrylhouder in de kweekkamer van de bioreactor, en voeg 500 milliliter groeimedium aan de kamer. Breng vervolgens 1 dyne per centimeter in het kwadraat van flow-geïnduceerde schuifspanning aan onder een vochtige atmosfeer met 5% kooldioxide.Na vijf dagen, gebruik maken van een LIVE / DEAD Viability Assay Kit om de celreacties op het binnenoppervlak van het steiger te bepalen volgens de standaard protocollen, en beeld van de cellen door confocale microscopie. Voordat u met de chirurgische ingreep begint, bevestigt u een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij de verdoofde rat en plaatst u het dier in de supinepositie op een steriel laken. Gebruik tondeuses om het haar van de chirurgische plaats te verwijderen en de blootgestelde huid te desinfecteren met sequentiële BETADINE en 70% ethanolscrubs.Voor T-tube plaatsing, maak een middellijn huid en spier incisie in de buik van de rat, en gebruik een scalpel mes om een drie-millimeter opening in de voorste maagwand te creëren. Steek de punt van een siliconen T-buis in de defect site om het te repareren aan de maagwand, en zorgvuldig hecht de buis aan de maagspierweefsel. Hecht de buikwand met 4-0 VICRYL hechting.Steek het distale uiteinde van de geïmplanteerde T-buis voorzichtig door de onderhuidse tunnel in de achterkant van de nek en gebruik een angiocatheter om een heparinedop aan te sluiten op het einde van de T-buis om te voorkomen dat de maaginhoud naar achteren stroomt. Wanneer de dop op zijn plaats is, gebruik 4-0 polyglactine hechtingen om alle lagen van de buikhuid te sluiten, en plaats de rat in een metabole kooi met controle tot volledige recumbency. Een week na de T-buis plaatsing, bereid de rat voor chirurgie zoals aangetoond.Plaats de rat onder de microscoop en maak een voorste mediane nekincisie in de blootgestelde gedesinfecteerde huid. Scheid de bandspieren om de tracheoesophageal structuur bloot te leggen. Isoleer de linkerkant van de slokdarm van de luchtpijp.Scheid zorgvuldig het bovenste deel van de slokdarm van de schildklier en gebruik een chirurgische schaar om een vijf millimeter lang volledig omtrek te creëren dat alle lagen van de slokdarm bevat. Steek vervolgens een 9-0 hechting tussen de rechter inferoposterior marge van de bovenste slokdarm rest en steiger, en blijven hechten van rechts naar links tussen de bovenste slokdarm overblijfsel en het steiger om een microanastomose te creëren aan de bovenkant van de distale slokdarm defect. Dan, anastomose het schavot op dezelfde manier als de bovenste marge van de onderste slokdarm overblijfsel.Wanneer de anastomoses zijn voltooid, leg de omliggende schildklier flap over de getransplanteerde site om een vasculaire levering aan en stabiel onderhoud van de graft te garanderen. Steek vervolgens de onderhuidse spier en het huidweefsel met een 4-0 VICRYL-hechting en plaats de rat in een metabole kooi op een infraroodopwarmingsapparaat met monitoring tot volledige recumbency. Na een gelijkmatige toepassing op de binnenwand van het schavot via injectie, de menselijke mesenchymale stamcel ingebed kelder membraan matrix toont de verwachte mesenchymale stamcel morfologie zoals beoordeeld door het scannen van elektronenmicroscopie.Na slokdarmtransplantatie bij ratten met volledige circumferential slokdarmdefecten zoals aangetoond, is het transplantaat bedekt met een schildklierflap voor stabiele fixatie en vasculaire toevoer naar de geïmplanteerde locatie. De slokdarm getransplanteerde ratten blijven op 340 gram tot ongeveer negen dagen na de procedure, waarna de dieren snel in gewicht afnemen als gevolg van verschillende oorzaken, wat resulteert in de dood op dag 15. Hoewel de meeste ratten niet-slokdarmobstructie ontwikkelen veroorzaakt door haarballen, is er over het algemeen geen grof bewijs van perforatie, anastomoselekkage met fistel, seromaaccumulatie, abccesvorming of omliggende wekedelennecrose bij een experimenteel dier.Re-epithelialisatie van de transplantatie site kan worden bevestigd door immunofluorescentie vlekken voor keratine, en de geregenereerde collageen laag en de elastine vezels kunnen duidelijk worden waargenomen door timchrome masson vlekken. Regeneratie van de slokdarmspierlaag blijkt ook uit een overvloedige neovascularisatie zoals beoordeeld door desmin immunohistochemische analyse. Het succes van deze procedure is afhankelijk van het stabiele onderhoud van de T-buis via fixatie achter de nek om voeding te leveren tijdens de slokdarmreconstructie.Om de vroege mortaliteit te overwinnen die kenmerkend is voor deze procedure, kan organoïde of vroege vascularisatietechnologie na de slokdarmimplantatie worden toegepast om te helpen bij de functionele slokdarmreconstructie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografie methodologie voor de evaluatie van Tissue Engineered Construct groei

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocol voor Relatieve Hydrodynamische Beoordeling van Tri-folder Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Chirurgische techniek voor de inplanting van Tissue Engineered vaattransplantaten en de daaropvolgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...