Name: tissue-engineered graft for circumferential esophageal reconstruction in rats
Uploaded: 2020-02-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo Korea Health Technology P&D Project, por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria da Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde & Bem-Estar, República da Coreia (número de subvenção: HI16C0362) e Pesquisa Científica Básica Programa por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da Educação (2017R1C1B2011132). Os bioespécimes e dados utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Biobank of Seul National University Hospital, membro da Korea Biobank Network.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC nº 17-0164-S1A0) do Hospital Universitário Nacional de Seul.
1. Fabricação de andaimes
NOTA: Andaimes esôfagos de duas camadas são fabricados combinando eletrofiação e impressão 3D. A membrana interna do andaime tubular foi fabricada por poliuretano eletrofispinning (PU) com mandrels de aço inoxidável rotativos como os coletores9...

<ol>
	<li>Irino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+outcomes+after+replacement+of+the+esophagus+with+gastric,+colonic,+or+jejunal+conduits:+a+systematic+literature+review.">Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review.</a> Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).</li><li>Flanagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophagectomy+and+Gastric+Pull-through+Procedures:+Surgical+Techniques,+Imaging+Features,+and+Potential+Complications.">Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications.</a> Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).</li><li>Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+outcomes+of+different+approaches+to+esophageal+replacement+in+long-gap+esophageal+atresia:+A+systematic+review.">Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review.</a> Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).</li><li>Luc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+and+matured+esophageal+scaffold+for+circumferential+esophagus+replacement:+Proof+of+concept+in+a+pig+model.">Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model.</a> Biomaterials. 175, 1-18 (2018).</li><li>Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+oesophageal+muscle+layer+from+oesophagus+acellular+matrix+scaffold+using+adipose-derived+stem+cells.">Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).</li><li>La Francesca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regeneration+and+remodeling+of+the+pig+esophagus+after+circumferential+resection+using+a+retrievable+synthetic+scaffold+carrying+autologous+cells.">Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).</li><li>Ponten, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+severe+mediastinal+bleeding+after+esophagectomy:+a+potentially+lethal+complication.">Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).</li><li>Catry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+Esophageal+Replacement+by+a+Tissue-engineered+Substitute+Using+Mesenchymal+Stem+Cells:+An+Experimental+Study+in+Mini+Pigs.">Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs.</a> Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).</li><li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+preparation+of+bio-tubular+scaffolds+for+fabricating+artificial+vascular+grafts+by+combining+electrospinning+and+a+3D+printing+system.">Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).</li><li>Kim, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Esophagus+via+Bioreactor+Cultivation+for+Circumferential+Esophageal+Reconstruction.">Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinational+effects+of+mechanical+forces+and+substrate+surface+characteristics+on+esophageal+epithelial+differentiation.">Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).</li><li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyurethane+scaffolds+seeded+with+autologous+cells+can+regenerate+long+esophageal+gaps:+An+esophageal+atresia+treatment+model.">Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).</li><li>Nakase, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathoracic+esophageal+replacement+by+in+situ+tissue-engineered+esophagus.">Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).</li><li>Kwiatek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+esophagus+in+eosinophilic+esophagitis.">Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis.</a> Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).</li><li>Anjum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocomposite+nanofiber+matrices+to+support+ECM+remodeling+by+human+dermal+progenitors+and+enhanced+wound+closure.">Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).</li><li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCL+and+PCL-gelatin+nanofibers+as+esophageal+tissue+scaffolds:+optimization,+characterization+and+cell-matrix+interactions.">PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).</li></ol>

Os estudos em animais existentes sobre esôfagos artificiais ainda são limitados por vários fatores críticos. O andaime artificial ideal deve ser biocompatível e ter excelentes propriedades físicas. Ele deve ser capaz de regenerar o epitélio mucosa no início do pós-operatório para evitar vazamento saofótico. A regeneração das camadas musculares circulares internas e longitudinal externas também é importante para a peristalse funcional12,13.
<p c...

O tratamento de distúrbios esofágicos, como malformações congênitas e carcinomas esofágicos, pode levar à perda estrutural do segmento do esôfago. Na maioria dos casos, enxertos de substituição autólogas, como conduítes gástricos ou interposições de cólon, foram realizados1,2. No entanto, essas substituições de esôfago têm uma variedade de complicações cirúrgicas e riscos de reoperação3. Assim, o uso de andaimes de esôfago projetados por tecido imitando o esôfago nativo pode ser uma estratégia alternativa promissora para, em última análise, regenerar tecidos perdidos4,5,6.
Embora um esôfago projetado por tecido potencialmente ofereça uma alternativa aos tratamentos atuais de defeitos esofágicos, existem barreiras significativas para sua aplicação in vivo. Vazamento anastomótico pós-operatório e necrose do andaime esôfago implantado inevitavelmente levam a uma infecção letal do espaço asséptico circundante, como o mediastinum7. Por isso, é extremamente importante prevenir a contaminação de alimentos ou saliva na ferida e na sonda nasogástrica. Gastrostomia ou nutrição intravenosa devem ser consideradas até que a cicatrização da ferida primária seja concluída. Até o momento, a engenharia de tecidos esofágicos tem sido realizada em grandes modelos animais porque animais de grande porte só podem ser alimentados por hiperalimentação intravenosa por 2-4 semanas após a implantação do andaime8. No entanto, tal modelo de alimentação não oral não foi estabelecido para a sobrevivência precoce após o transplante de esôfago em animais pequenos. Isso porque os animais eram extremamente ativos e incontroláveis, então eles não podiam manter o tubo de alimentação em seus estômagos por um longo período de tempo. Por essa razão, houve poucos casos de transplante esofágico bem sucedido em animais pequenos.
Em vista das circunstâncias da engenharia de tecidos esofágicos, projetamos um andaime tubular de duas camadas composto por nanofibras eletrospun (camada interna; Figura 1A) e um fio impresso em 3D (camada externa; Figura 1B) incluindo uma técnica modificada de gastrostomia. A nanofibra interna é feita de PU, um polímero não degradável, e previne o vazamento de alimentos e saliva. Os fios impressos 3D externos são feitos de policaprolactona biodegradável (PCL), que pode fornecer flexibilidade mecânica e se adaptar ao movimento peristaltico. Células-tronco mesenquimicas derivadas de adiposas humanas (hAD-MSCs) foram semeadas na camada interna do andaime para promover a reepitada. A estrutura da nanofibra pode facilitar a regeneração mucosa inicial, fornecendo um ambiente estrutural de matriz extracelular (ECM) para migração celular.
Também aumentamos a taxa de sobrevivência e a bioatividade das células inoculadas através do cultivo de bioreatores. O andaime implantado foi coberto com uma aba de glândula tireoide para permitir uma regeneração mais estável da mucosa esofágica e da camada muscular. Neste relatório, descrevemos protocolos para técnicas de engenharia de tecidos esofágicos, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreator à base de células-tronco mesenquimicas, uma técnica de alimentação de bypass com gastrostomia modificada e uma cirurgia modificada técnica de anastomose para reconstrução circunferencial do esôfago em um modelo de rato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic cage</td>
			<td>TEUNGDO BIO &#38; PLANT</td>
			<td>JD-C-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil (50 mg/g dose)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>1000000188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% xylazine hydrochloride (Rumpun)</td>
			<td>Byely</td>
			<td>Q-0615-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Vicryl</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>W9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 Vicryl</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>W2813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic gentamicin (Septopal).</td>
			<td>Septopal</td>
			<td>0409-1207-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer, ph6.0, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-23879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic stain kit</td>
			<td>ScyTeK</td>
			<td>ETS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin cap</td>
			<td>Hyupsung Medical</td>
			<td>HS-T-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hMSC (STEMPRO) / growth medium 
			(MesenPRO RSTM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R7788-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>PK7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin13</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-97797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability Assay Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonadherent 
			24-well tissue culture plates.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3072115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone (PCL) polymer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane (PU+A2:A24) polymer</td>
			<td>Lubrizol</td>
			<td>2363-80AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>NanoNC</td>
			<td>HV100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rumpun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Q-0615-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone T-tube</td>
			<td>Sewoon Medical</td>
			<td>2206-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycin Eye Ointment</td>
			<td>Pfizer Pharmaceutical Korea</td>
			<td>W01890011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac Laboratories</td>
			<td>Q-0042-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome stain kit</td>
			<td>ScyTeK</td>
			<td>TRM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc 14014</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-engineered graft for circumferential esophageal reconstruction in rats

O uso de materiais biocompatíveis para reconstrução circunferencial do esôfago é uma tarefa tecnicamente desafiadora em ratos e requer uma técnica ideal de implante com suporte nutricional. Recentemente, houve muitas tentativas de engenharia de tecidos esofágicos, mas a taxa de sucesso foi limitada devido à dificuldade na epitação precoce no ambiente especial da peristalse. Aqui, desenvolvemos um esôfago artificial que pode melhorar a regeneração da mucosa esofágica e camadas musculares através de um andaime tubular de duas camadas, um sistema de bioreator à base de células-tronco mesenquiérmicos e uma técnica de alimentação de bypass com modificação Gastrostomia. O andaime é feito de nanofibras de poliuretano (PU) em uma forma cilíndrica com um fio de policaprolactona impresso tridimensional (3D) enrolado ao redor da parede externa. Antes do transplante, as células-tronco mesenquimals derivadas pelo homem foram semeadas no lúmen do andaime, e o cultivo de bioreator foi realizado para melhorar a reatividade celular. Melhoramos a taxa de sobrevivência do enxerto aplicando anastomose cirúrgica e cobrindo a prótese implantada com um retalho da glândula tireoide, seguido de alimentação temporária de gastrostomia não oral. Esses enxertos foram capazes de recapitular os achados da epitelialização inicial e regeneração muscular em torno dos locais implantados, como demonstrado pela análise histológica. Além disso, foram observadas fibras de elastina aumentadas e neovascularização na periferia do enxerto. Portanto, este modelo apresenta uma potencial nova técnica para a reconstrução circunferencial do esôfago.

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do processo de fabricação do andaime tubular pu-PCL de duas camadas. A solução PU foi eletrosada a partir de uma agulha de 18 G para fazer uma estrutura interna cilíndrica com uma espessura de 200 μm. Em seguida, o PCL derretido foi impresso na parede externa da nanofibra PU em intervalos regulares. A morfologia superficial das paredes internas e externas do andaime tubular completo pode ser vista nas imagens d...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats at JoVE.com

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

A reconstrução do esôfago é um procedimento desafiador, e o desenvolvimento de um esôfago projetado por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular e que pode ser implantado à medida que um enxerto artificial é necessário. Aqui, apresentamos nosso protocolo para gerar um esôfago artificial, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreatores e várias técnicas cirúrgicas.

Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

A reparação esofágica circunferencial é tecnicamente desafiadora em um modelo de rato, necessitando do desenvolvimento de esôfagos projetados por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular sem vazamento de anastomose esofágica. Implementamos um andaime tubular de duas camadas como modelo piloto, consistindo de nanofibra interna e um fio externo de impressão 3D em conjunto com uma anastomose microvascular para minimizar o vazamento de saliva após o transplante. A reconstrução esofágica padrão convencional está associada a uma ampla gama de complicações e morbidade.Portanto, a engenharia de tecidos esofágulas pode ser uma estratégia alternativa promissora para o desenvolvimento de modelos de esôfago de pacientes nativos. A combinação de andaime híbrido, cultivo de bioreatores e um sistema de nutrição oral pode ser aplicada a qualquer sistema que tenha um ambiente contaminado semelhante com sua pressão mecânica contínua. Comece esterilizando um andaime de esôfago impresso em 3D com uma exposição de uma hora à luz ultravioleta, um mergulho de 10 minutos em etanol e três lavagens com PBS.Após a última lavagem, coloque o andaime tubular de duas camadas em uma placa de cultura de tecido nãoadherent de 24 poços, e adicione suavemente, mas uniformemente, uma vez 10 às seis células-tronco mesenquimais humanas derivadas de adiposos por mililitro da matriz de membrana do porão complementada com meio de crescimento à superfície interna do andaime. Use um sistema bioreator de fluxo pulsatil para fixar firmemente o andaime tubular semeado por células ao suporte acrílico na câmara de cultura do bioreator, e adicione 500 mililitros de meio de crescimento à câmara. Em seguida, aplique 1 dyne por centímetro quadrado de estresse de cisalhamento induzido pelo fluxo sob uma atmosfera úmida contendo 5% de dióxido de carbono.Após cinco dias, use um Kit de Ensaio de Viabilidade LIVE/DEAD para determinar as respostas celulares na superfície interna do andaime de acordo com os protocolos padrão e imagem das células por microscopia confocal. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal no rato anestesiado e coloque o animal na posição supina em uma cortina estéril. Use cortadores para remover o cabelo do local cirúrgico e desinfetar a pele exposta com betadine sequencial e 70% de esfoliantes de etanol.Para a colocação do tubo T, faça uma incisão de pele e músculo médio no abdômen do rato, e use uma lâmina de bisturi para criar um orifício de três milímetros na parede gástrica anterior. Insira a ponta de um tubo T de silicone no local do defeito para fixá-lo na parede estomacal e sutura cuidadosamente o tubo ao tecido muscular gástrico. Sutura a parede abdominal com sutura VICRYL 4-0.Insira cuidadosamente a extremidade distal do tubo T implantado através do túnel subcutâneo na parte de trás do pescoço, e use um angiocateter para conectar uma tampa de heparina à extremidade do tubo T para evitar que o conteúdo estomacal flua para trás. Quando a tampa estiver no lugar, use suturas de poliglatina 4-0 para fechar todas as camadas da pele abdominal, e coloque o rato em uma gaiola metabólica com monitoramento até a recumbência total. Uma semana após a colocação do tubo T, prepare o rato para a cirurgia como demonstrado.Coloque o rato sob o microscópio, e faça uma incisão anterior do pescoço mediano na pele desinfetada exposta. Separe os músculos da correia para expor a estrutura traqueoesofágica. Isole o lado esquerdo do esôfago da traqueia.Separe cuidadosamente a parte superior do esôfago da glândula tireoide e use uma tesoura cirúrgica para criar um defeito circunferencial completo de cinco milímetros contendo todas as camadas do esôfago. Em seguida, insira uma sutura 9-0 entre a margem inferoposterior direita do remanescente e andaime superior do esôfago, e continue suturando da direita para a esquerda entre o remanescente superior do esôfago e o andaime para criar uma microanastomose na extremidade superior do defeito esofágico distal. Em seguida, anastomose o andaime da mesma forma que a margem superior do remanescente inferior do esôfago.Quando as anastomoses estiverem completas, coloque a retalho da glândula tireoide circundante sobre o local transplantado para garantir um suprimento vascular e manutenção estável do enxerto. Em seguida, costure o músculo subcutâneo e o tecido da pele com uma sutura VICRYL 4-0, e coloque o rato em uma gaiola metabólica em um dispositivo de aquecimento infravermelho com monitoramento até a completa recumbência. Após uma aplicação uniforme na parede interna do andaime via injeção, a matriz de membrana de porão incorporada por células-tronco humanas demonstra a esperada morfologia de células-tronco mesenquimais, avaliada pela microscopia eletrônica de varredura.Após o transplante esofágico em ratos com defeitos esofágios circunferenciais completos, como demonstrado, o enxerto é coberto com uma reta da glândula tireoide para fixação estável e fornecimento vascular ao local implantado. Os ratos transplantados do esôfago permanecem em 340 gramas até cerca de nove dias após o procedimento, momento em que os animais diminuem rapidamente de peso devido a várias causas, resultando em morte até o dia 15. Embora a maioria dos ratos desenvolva obstrução não esofágica causada por bolas de cabelo, no geral não há evidência grosseira de perfuração, vazamento de anastomose com fístula, acúmulo de soroma, formação de abscesso ou necrose de tecido mole circundante em qualquer animal experimental.A reetelialização do local do transplante pode ser confirmada por coloração de imunofluorescência para queratina, e a camada regenerada de colágeno e as fibras de elastina podem ser claramente observadas pela coloração tricrática de Masson. A regeneração da camada muscular esofágica também é evidenciada por uma neovascularização abundante, avaliada pela análise imunohistoquímica desmin. O sucesso deste procedimento depende da manutenção estável do tubo T através da fixação atrás do pescoço para fornecer nutrição durante a reconstrução esofágica.Para superar a mortalidade precoce típica desse procedimento, a tecnologia organoide ou vascularização precoce poderia ser aplicada após a implantação do esôfago para auxiliar na reconstrução funcional do esôfago.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Bioengenharia

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Técnica Cirúrgica para a Implantação de engenharia de tecidos enxertos vasculares e Subsequente<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...