Name: tissue-engineered graft for circumferential esophageal reconstruction in rats
Uploaded: 2020-02-10T12:00:00
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Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de I+D de La Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria Sanitaria de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de concesión: HI16C0362) y el Instituto de Investigación en Ciencias Básicas Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1C1B2011132). Los bioespecímenes y los datos utilizados en este estudio fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Universitario Nacional de Seúl, miembro de Korea Biobank Network.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC No 17-0164-S1A0) del Hospital Universitario Nacional de Seúl.
1. Fabricación de andamios
NOTA: Los andamios esofágicos de dos capas se fabrican combinando electrospinning e impresión 3D. La membrana interna del andamio tubular fue fabricada por poliuretano electrospinning (PU) con mandriles giratorios de acero inoxidable como los colectores<sup cl...

<ol>
	<li>Irino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+outcomes+after+replacement+of+the+esophagus+with+gastric,+colonic,+or+jejunal+conduits:+a+systematic+literature+review.">Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review.</a> Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).</li><li>Flanagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophagectomy+and+Gastric+Pull-through+Procedures:+Surgical+Techniques,+Imaging+Features,+and+Potential+Complications.">Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications.</a> Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).</li><li>Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+outcomes+of+different+approaches+to+esophageal+replacement+in+long-gap+esophageal+atresia:+A+systematic+review.">Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review.</a> Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).</li><li>Luc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+and+matured+esophageal+scaffold+for+circumferential+esophagus+replacement:+Proof+of+concept+in+a+pig+model.">Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model.</a> Biomaterials. 175, 1-18 (2018).</li><li>Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+oesophageal+muscle+layer+from+oesophagus+acellular+matrix+scaffold+using+adipose-derived+stem+cells.">Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).</li><li>La Francesca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regeneration+and+remodeling+of+the+pig+esophagus+after+circumferential+resection+using+a+retrievable+synthetic+scaffold+carrying+autologous+cells.">Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).</li><li>Ponten, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+severe+mediastinal+bleeding+after+esophagectomy:+a+potentially+lethal+complication.">Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).</li><li>Catry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+Esophageal+Replacement+by+a+Tissue-engineered+Substitute+Using+Mesenchymal+Stem+Cells:+An+Experimental+Study+in+Mini+Pigs.">Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs.</a> Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).</li><li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+preparation+of+bio-tubular+scaffolds+for+fabricating+artificial+vascular+grafts+by+combining+electrospinning+and+a+3D+printing+system.">Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).</li><li>Kim, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Esophagus+via+Bioreactor+Cultivation+for+Circumferential+Esophageal+Reconstruction.">Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinational+effects+of+mechanical+forces+and+substrate+surface+characteristics+on+esophageal+epithelial+differentiation.">Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).</li><li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyurethane+scaffolds+seeded+with+autologous+cells+can+regenerate+long+esophageal+gaps:+An+esophageal+atresia+treatment+model.">Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).</li><li>Nakase, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathoracic+esophageal+replacement+by+in+situ+tissue-engineered+esophagus.">Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).</li><li>Kwiatek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+esophagus+in+eosinophilic+esophagitis.">Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis.</a> Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).</li><li>Anjum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocomposite+nanofiber+matrices+to+support+ECM+remodeling+by+human+dermal+progenitors+and+enhanced+wound+closure.">Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).</li><li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCL+and+PCL-gelatin+nanofibers+as+esophageal+tissue+scaffolds:+optimization,+characterization+and+cell-matrix+interactions.">PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).</li></ol>

Los estudios en animales existentes sobre esofagia artificial siguen estando limitados por varios factores críticos. El andamio esofágico artificial ideal debe ser biocompatible y tener excelentes propiedades físicas. Debe ser capaz de regenerar el epitelio de la mucosa en el período postoperatorio temprano para evitar fugas anastomóticas. La regeneración de las capas musculares longitudinales circulares y externas internas también es importante para la peristalsis funcional12,<s...

El tratamiento de los trastornos esofágicos, como las malformaciones congénitas y los carcinomas esofágicos, puede conducir a la pérdida del segmento estructural del esófago. En la mayoría de los casos, se han realizado injertos de reemplazo autólogos, como conductos de extracción gástricos o interposiciones de colon,1,2. Sin embargo, estos reemplazos esofágistas tienen una variedad de complicaciones quirúrgicas y riesgos de reoperación3. Por lo tanto, el uso de andamios de esófago con ingeniería de tejido imitando el esófago nativo puede ser una estrategia alternativa prometedora para regenerar finalmente los tejidos perdidos4,5,6.
Aunque un esófago con ingeniería de tejido potencialmente ofrece una alternativa a los tratamientos actuales de defectos esofágicos, existen barreras significativas para su aplicación in vivo. La fuga anastomótica postoperatoria y la necrosis del andamio esofágico implantado conducen inevitablemente a una infección letal del espacio aséptico circundante, como el mediastinum7. Por lo tanto, es extremadamente importante prevenir la contaminación de alimentos o saliva en la herida y el tubo nasogástrico. Se debe considerar la gastrostomía o la nutrición intravenosa hasta que se complete la cicatrización de la herida primaria. Hasta la fecha, la ingeniería de tejido esofágico se ha realizado en grandes modelos animales porque los animales grandes sólo pueden ser alimentados por hiperalimentación intravenosa durante 2-4 semanas después de la implantación del andamio8. Sin embargo, no se ha establecido tal modelo de alimentación no oral para la supervivencia temprana después del trasplante de esófago en animales pequeños. Esto se debe a que los animales eran extremadamente activos e incontrolables, por lo que no podían mantener el tubo de alimentación en sus estómagos durante un largo período de tiempo. Por esta razón, ha habido pocos casos de trasplante de esófago exitoso en animales pequeños.
En vista de las circunstancias de la ingeniería del tejido esofágico, diseñamos un andamio tubular de dos capas que consiste en nanofibras electrospun (capa interna; Figura 1A) y una hebra impresa en 3D (capa exterior; Figura 1B) incluyendo una técnica de gastrostomía modificada. La nanofibra interna está hecha de PU, un polímero no degradable, y evita la fuga de alimentos y saliva. Las hebras externas impresas en 3D están hechas de policaprolactona biodegradable (PCL), que puede proporcionar flexibilidad mecánica y adaptarse al movimiento peristáltico. Las células madre mesenquimales derivadas de los adiposos humanos (hAD-MSC) fueron sembradas en la capa interna del andamio para promover la reepitelización. La estructura de nanofibra puede facilitar la regeneración inicial de la mucosa proporcionando un entorno de matriz extracelular estructural (ECM) para la migración celular.
También hemos aumentado la tasa de supervivencia y la bioactividad de las células inoculadas a través del cultivo del biorreactor. El andamio implantado estaba cubierto con un colgajo de la glándula tiroides para permitir una regeneración más estable de la mucosa esofágica y la capa muscular. En este informe, describimos protocolos para técnicas de ingeniería de tejido esofágico, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores a base de células madre mesenquimales, una técnica de alimentación de bypass con gastrostomía modificada y una técnica de anastomosis para la reconstrucción esofágica circunferencial en un modelo de rata.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metabolic cage</td>
			<td>TEUNGDO BIO &#38; PLANT</td>
			<td>JD-C-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil (50 mg/g dose)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>1000000188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% xylazine hydrochloride (Rumpun)</td>
			<td>Byely</td>
			<td>Q-0615-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Vicryl</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>W9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 Vicryl</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>W2813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic gentamicin (Septopal).</td>
			<td>Septopal</td>
			<td>0409-1207-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer, ph6.0, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>SK4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-23879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic stain kit</td>
			<td>ScyTeK</td>
			<td>ETS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin cap</td>
			<td>Hyupsung Medical</td>
			<td>HS-T-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hMSC (STEMPRO) / growth medium 
			(MesenPRO RSTM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R7788-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>PK7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin13</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-97797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability Assay Kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonadherent 
			24-well tissue culture plates.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3072115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10X</td>
			<td>BIOSOLUTION</td>
			<td>BP007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone (PCL) polymer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane (PU+A2:A24) polymer</td>
			<td>Lubrizol</td>
			<td>2363-80AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>NanoNC</td>
			<td>HV100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rumpun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Q-0615-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone T-tube</td>
			<td>Sewoon Medical</td>
			<td>2206-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycin Eye Ointment</td>
			<td>Pfizer Pharmaceutical Korea</td>
			<td>W01890011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac Laboratories</td>
			<td>Q-0042-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichrome stain kit</td>
			<td>ScyTeK</td>
			<td>TRM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc 14014</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-engineered graft for circumferential esophageal reconstruction in rats

El uso de materiales biocompatibles para la reconstrucción esofágica circunferencial es una tarea técnicamente difícil en ratas y requiere una técnica de implante óptima con apoyo nutricional. Recientemente, ha habido muchos intentos de ingeniería de tejido esofágico, pero la tasa de éxito ha sido limitada debido a la dificultad en la epitelización temprana en el entorno especial de la peristalsis. Aquí, desarrollamos un esófago artificial que puede mejorar la regeneración de la mucosa esofágica y las capas musculares a través de un andamio tubular de dos capas, un sistema de biorreactor a base de células madre mesenquimales, y una técnica de alimentación de bypass con Gastrostomy. El andamio está hecho de nanofibras de poliuretano (PU) en forma cilíndrica con una hebra de policaprolactona impresa tridimensional (3D) envuelta alrededor de la pared exterior. Antes del trasplante, las células madre mesenquimales derivadas del ser humano se sembraban en el lumen del andamio, y se realizaba el cultivo del biorreactor para mejorar la reactividad celular. Mejoramos la tasa de supervivencia del injerto aplicando anastomosis quirúrgica y cubriendo la prótesis implantada con un colgajo de la glándula tiroides, seguido de la alimentación temporal de la gastrostomía no oral. Estos injertos fueron capaces de recapitular los hallazgos de epitelización inicial y regeneración muscular alrededor de los sitios implantados, como lo demuestra el análisis histológico. Además, se observaron un aumento de las fibras de elastina y la neovascularización en la periferia del injerto. Por lo tanto, este modelo presenta una nueva técnica potencial para la reconstrucción esofágica circunferencial.

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso de fabricación del andamio tubular de dos capas PU-PCL. La solución de PU fue electrospun de una aguja de 18 G para hacer una estructura interna cilíndrica con un espesor de 200 m. Luego, el PCL fundido se imprimió en la pared exterior de la nanofibra de la PU a intervalos regulares. La morfología superficial de las paredes internas y externas del andamio tubular completado se puede ver en las imá...

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Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.

Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

La reparación del esófago circunferencial es técnicamente difícil en un modelo de rata, lo que requiere el desarrollo de esófago diseñado por tejidos que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo sin fuga de anastomosis esofágica. Hemos implementado un andamio tubular de dos capas como modelo piloto, que consiste en nanofibra interna y una hebra externa de impresión 3D en combinación con una anastomosis microvascular para minimizar la fuga de saliva después del trasplante. La reconstrucción esofágica estándar convencional se asocia con una amplia gama de complicaciones y morbilidad.Por lo tanto, la ingeniería de tejidos esofágicos puede ser una estrategia alternativa prometedora para desarrollar modelos nativos de esófago para pacientes. La combinación de andamios híbridos, cultivo de biorreactor y un sistema de nutrición oral se puede aplicar a cualquier sistema que tenga un ambiente contaminado similar con su presión mecánica continua. Comience esterilizando un andamio de esófago impreso en 3D con una exposición de una hora a la luz ultravioleta, un remojo de 10 minutos en etanol y tres lavados con PBS.Después del último lavado, coloque el andamio tubular de dos capas en una placa de cultivo de tejido no adherente de 24 pozos, y agregue suavemente pero uniformemente una vez 10 a las seis células madre mesenquimales humanas derivadas de seis adiposos por mililitro de matriz de membrana del sótano complementada con medio de crecimiento a la superficie interna del andamio. Utilice un sistema de biorreactor de flujo pulstil para fijar firmemente el andamio tubular de semilla celular al soporte de acrílico en la cámara de cultivo del biorreactor, y agregue 500 mililitros de medio de crecimiento a la cámara. A continuación, aplique 1 dyne por centímetro cuadrado de tensión de cizallamiento inducida por el flujo bajo una atmósfera húmeda que contenga 5% de dióxido de carbono.Después de cinco días, utilice un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD para determinar las respuestas celulares en la superficie interna del andamio de acuerdo con los protocolos estándar, e imagine las células mediante microscopía confocal. Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal en la rata anestesiada y coloque al animal en la posición supina sobre una cortina estéril. Utilice cortadores para eliminar el cabello del sitio quirúrgico, y desinfectar la piel expuesta con BETADINE secuencial y exfoliaciones de etanol al 70%.Para la colocación del tubo T, haz una incisión muscular y de la piel de la línea media en el abdomen de la rata, y usa una cuchilla de bisturí para crear un orificio de tres milímetros en la pared gástrica anterior. Inserte la punta de un tubo T de silicona en el sitio del defecto para fijarlo a la pared del estómago, y sutura cuidadosamente el tubo al tejido muscular gástrico. Sutura de la pared abdominal con sutura VICRYL 4-0.Inserte cuidadosamente el extremo distal del tubo T implantado a través del túnel subcutáneo en la parte posterior del cuello, y utilice un angiocatéter para conectar una tapa de heparina al extremo del tubo T para evitar que el contenido del estómago fluya hacia atrás. Cuando la tapa esté en su lugar, utilice suturas de poliglactitina 4-0 para cerrar todas las capas de la piel abdominal, y coloque la rata en una jaula metabólica con monitoreo hasta la recumbencia completa. Una semana después de la colocación del tubo T, prepare la rata para la cirugía como se ha demostrado.Coloque la rata bajo el microscopio y haga una incisión anterior del cuello medio en la piel desinfectada expuesta. Separe los músculos de la correa para exponer la estructura traqueoesofágica. Aísle el lado izquierdo del esófago de la tráquea.Separe cuidadosamente la parte superior del esófago de la glándula tiroides, y use tijeras quirúrgicas para crear un defecto circunferencial completo de cinco milímetros de largo que contenga todas las capas del esófago. A continuación, inserte una sutura 9-0 entre el margen inferoposterior derecho del remanente y el andamio del escafgugu superior, y continúe suturando de derecha a izquierda entre el remanente del esófago superior y el andamio para crear una microanastomosis en el extremo superior del defecto esofágico distal. Luego, anastomose el andamio de la misma manera que el margen superior del remanente del esófago inferior.Cuando las anastomosas estén completas, poner el colgajo de la glándula tiroides circundante sobre el sitio trasplantado para asegurar un suministro vascular y un mantenimiento estable del injerto. Luego, coser el músculo subcutáneo y el tejido de la piel con una sutura 4-0 VICRYL, y colocar la rata en una jaula metabólica en un dispositivo de calentamiento infrarrojo con monitoreo hasta la recumbencia completa. Después de una aplicación uniforme a la pared interna del andamio mediante inyección, la matriz de membrana del sótano incrustada en células madre mesenquimales humanas demuestra la morfología esperada de las células madre mesenquimales evaluada por la microscopía electrónica de barrido.Después del trasplante esofágico en ratas con defectos esofágicos circunferenciales completos como se ha demostrado, el injerto se cubre con un colgajo de la glándula tiroides para una fijación estable y el suministro vascular al sitio implantado. Las ratas trasplantadas de esófago permanecen en 340 gramos hasta aproximadamente nueve días después del procedimiento, momento en el que los animales disminuyen rápidamente de peso debido a diversas causas, lo que resulta en la muerte para el día 15. Aunque la mayoría de las ratas desarrollan obstrucción no esofágica causada por bolas de pelo, en general no hay evidencia bruta de perforación, fuga de anastomosis con fístula, acumulación de seroma, formación de abscesos o necrosis de tejido blando circundante en cualquier animal experimental.La reepíterización del sitio de trasplante puede confirmarse mediante la tinción de inmunofluorescencia para la queratina, y la capa de colágeno regenerado y las fibras de elastina pueden ser observadas claramente por la tinción tricromática de Masson. La regeneración de la capa muscular esofágica también se evidencia por una abundante neovascularización evaluada por el análisis inmunohistoquímico desmina. El éxito de este procedimiento se basa en el mantenimiento estable del tubo T a través de la fijación detrás del cuello para proporcionar nutrición durante la reconstrucción del esófago.Para superar la mortalidad temprana típica de este procedimiento, se podría aplicar la tecnología de vascularización orgánica o temprana después de la implantación esofágica para ayudar en la reconstrucción esófago funcional.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Investigación

Bioingeniería

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Protocolo para la evaluación relativa hidrodinámico de Tri-lámina polimérica Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Técnica quirúrgica para la implantación de la ingeniería tisular injertos vasculares y posterior<em&gt; En Vivo</em&gt; Monitoreo

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Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

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Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

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Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Aplicaciones de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...