Name: three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization
Uploaded: 2019-10-29T14:30:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization at JoVE.com

ونود ان نشكر جيفري نغوين وجوشوا شاهيفيتز للمساعدة في تطوير هذه الطريقة. التمويل: RMM-المعاهد القومية للصحة F32 GM103290-01A1 ، BPB-مركز غلين للبحوث الشيخوخة ومؤسسه العلوم الوطنية في 1734030.

<ol>
	<li>Young, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Selective+Value+of+Bacterial+Shape.">The Selective Value of Bacterial Shape.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).</li><li>Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Curved+Shape+of+Caulobacter+crescentus+Enhances+Surface+Colonization+in+Flow.">The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow.</a> Nature Communications. 5, 3824 (2014).</li><li>Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Hong, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. , 227-245 (2016).</li><li>Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB+Polymers+and+Curvature+Localization+are+Enhanced+by+RodZ+and+Predict+E.+coli's+Cylindrical+Uniformity.">MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity.</a> Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).</li><li>Ouzounov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB+Orientation+Correlates+with+Cell+Diameter+in+Escherichia+coli.">MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).</li><li>Morgenstein, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RodZ+links+MreB+to+Cell+Wall+Synthesis+to+Mediate+MreB+rotation+and+Robust+Morphogenesis.">RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).</li><li>Ursell, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-Like+Bacterial+Shape+is+Maintained+by+Feedback+Between+Cell+Curvature+and+Cytoskeletal+Localization.">Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization.</a> Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).</li><li>Bartlett, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Periplasmic+Polymer+Curves+Vibrio+cholerae+and+Promotes+Pathogenesis.">A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis.</a> Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).</li><li>Taylor, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Cytoskeletal+Proteins+Define+Zones+of+Enhanced+Cell+Wall+Synthesis+in+Helicobacter+pylori.">Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori.</a> bioRxiv. , 545517 (2019).</li><li>Egan, A. J. F., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physiology+of+Bacterial+Cell+Division.">The Physiology of Bacterial Cell Division.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division:+Assembly,+Maintenance+and+Disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).</li><li>Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Bacterial+Protein+Localization.">High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization.</a> Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).</li><li>de Pedro, M. A., Quintela, J. C., H&#246;ltje, J. V., Schwarz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murein+Segregation+in+Escherichia+coli.">Murein Segregation in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB+Filaments+Align+Along+Greatest+Principal+Membrane+Curvature+to+Orient+Cell+Wall+Synthesis.">MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis.</a> eLife. 7, e32471 (2018).</li><li>Wong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Strain+Sensing+Implicated+in+Cell+Shape+Recovery+in+Escherichia+coli.">Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli.</a> Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).</li><li>Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+and+Dynamics+of+Translocating+MreB+Filaments+on+Curved+Membranes.">Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes.</a> eLife. 8, e40472 (2019).</li><li>Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+Selection+of+Surface-Bound+Helical+Filaments:+Biopolymers+on+Curved+Membranes.">Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes.</a> Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).</li><li>Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RodZ+Modulates+Geometric+Localization+of+the+Bacterial+Actin+MreB+to+Regulate+Cell+Shape.">RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape.</a> Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).</li><li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+Presence+of+Noise.">Communication in the Presence of Noise.</a> Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).</li><li>Billings, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Morphogenesis+in+L-Forms+Via+Geometric+Control+of+Cell+Growth.">De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth.</a> Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).</li><li>. Measuring a Point Spread Function Available from: <a target="_blank" href="https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function">https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function</a> (2012)</li><li>Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Experimental+Methods+for+Determining+the+Apparent+Focal+Shift+in+a+Microscope+System.">Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System.</a> PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).</li><li>Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Spectroscopy+and+Imaging+over+the+decades.">Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades.</a> Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+in+Cell+Biology.">Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).</li><li>Sarder, P., Nehorai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+Methods+for+3-D+Fluorescence+Microscopy+Images.">Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images.</a> IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M., Waters, J. C., Wittman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12, 1205 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+Lateral+Resolution+Limit+by+a+Factor+of+Two+Using+Structured+Illumination+Microscopy.">Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Labeling+of+Live+Cell+Surfaces+for+Three-Dimensional+Super-Resolution+Microscopy.">Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).</li><li>Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+Biofilm+Growth+Program+and+Architecture+Revealed+by+Single-Cell+Live+Imaging.">Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bact-3D:+A+level+set+segmentation+approach+for+dense+multi-layered+3D+bacterial+biofilms.">Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms.</a> 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

ومن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول الحصول علي صور عاليه الجودة. لأعاده بناء الخلايا بشكل صحيح ، يجب ان يكون هناك ما يكفي من عدم الوضوح فوق وتحت الخلية. ولذلك ، فانه من الضروري ان المكدس z المتخذة يغطي مسافة كبيره بما فيه الكفاية. يمكن تعديل عدد الخطوات المتخذة اثناء الحصول علي الصورة لكل سلاله. علي سبيل المثال ، الخلايا e. القولونية المحذوفة ل rodz هي أوسع وتتطلب المزيد من الخطوات ، التالي ، مسافة أكبر من الخلايا نوع البرية. إذا كانت العينة الانجرافات اثناء اكتساب الصورة ، وأعاده الاعمار يمكن ان يكون لها أخطاء كبيره. ولذلك ، فمن المهم ان ندع الشريحة تاتي إلى التوازن الحراري مع المجهر قبل التصوير لتجنب الانجراف خلال اكتساب z-كومه. يجب ان تكون الخلايا غير المصابين علي منصات مع انخفاض الفلورية. مكونات الوسائط ، مثل تلك الموجودة في متوسط LB الشائعة ، لها الفلورية التي يمكن ان تسبب مشاكل عند محاولة أعاده بناء الخلايا. كثافة الخلايا علي لوحه التصوير مهم لان عمليه أعاده البناء يتم تنفيذها بشكل مستقل علي كل خليه. عدد قليل جدا من الخلايا سوف تزيد من الوقت اللازم للحصول علي صور لعدد كاف من الخلايا ، في حين ان العديد من الخلايا سوف يؤدي إلى حقول التصوير التي هي كثيفه جدا لزراعه الخلايا الفردية بسهوله. ونظرا لعدم أعاده بناء جميع الخلايا بشكل صحيح ، ينبغي ان تكون الخلايا الاضافيه غير موجودة اثناء مرحله الاقتناء وينبغي فرز جميع النواتج قبل المضي قدما في التحليل الإحصائي (الشكل 3).
العديد من القيود لهذه الطريقة التقنية. علي المجهر لاستخدامها ، يجب علي المرء ان يكون الهدف الذي لديه فتحه رقميه عاليه (عاده > 1.4) ، لان هذا يتيح التقطيع البصرية علي نطاق حجم البكتيريا. بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان تكون مجهزه المجهر مع مرحله بيزو التي يمكن ان تتخذ خطوات صغيره ودقيقه في الاتجاه z. وعلاوة علي ذلك ، في حين انه ليس من الضروري ، ينصح بشده الوصول إلى الموارد الحسابية عاليه الانتاجيه لتشغيل برنامج تحليل الصور لأنه سيتم تقليل وقت المعالجة لأعاده بناء الخلايا.
أحد القيود المفاهيمية للأسلوب هو انه يجب اختيار موازين الطاقة الصحيحة لترجيح نعومه البناء بالنسبة لمعدل الاشاره إلى الضوضاء للصور. للتحقق من اختيار المعلمات ، يجب قياس احجام واشكال الخلايا باستخدام أساليب مستقله مثل المجهر الكترون الإرسال (TEM) أو المجهر القوه الذرية (فؤاد). وكدليل علي المبدا ، تم اجراء أعاده بناء الخلايا ثلاثية الابعاد اما علي فؤاد لاختبار دقه z (< 50 نانومتر) أو علي شبكه TEM لاختبار دقه xy (< 30 نانومتر)3. وهذا النهج المترابط يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وقد يكون النهج الأبسط لصوره عينات قياسيه مثل الخلايا نوع البرية أو 1 μm الخرز كرويه. ويمكن استخدام القطر والكروية لأعاده البناء لضمان صحة الحجم وموازين الطاقة المستخدمة في أعاده الاعمار.
هذه ليست الطريقة الوحيدة التي تسعي لاستخراج المعلومات المكانية عاليه الدقة من الصور المجهرية الفلورية. العديد من المقالات الاستعراضية تصف التطورات الاخيره في مجال المجهر الفائق24،25. تقنيات تعزيز القرار مثل تفكيك المجهر26، الغزل القرص المجهر البؤري27، أعاده تعيين بكسل28، والمجهر الاضاءه المهيكلة (SIM)29 تسعي لتحسين القرار من صور التي حصلت عليها المجهر. وهذه الأساليب لا تتنافى مع النهج المقدم. مؤخرا تم تكييف هذه الطريقة للسماح للصور المستندة إلى SIM كمدخلات9. في حين ان طريقه التواء إلى الامام تشترك في بعض الدعائم مع المجهر غير الحلزوني ، فانه يحتوي علي مخرجات مختلفه تماما. في حين ان النهج مثل تفكيك المجهر تسعي إلى تحسين القرار من الصورة ، وهذا النهج لا تولد صوره ولكن بدلا من أعاده بناء شكل خليه مع دقه 50 نانومتر تقريبا. ويمكن لتقنيات المجهر النشط أحاديه الجزيء التي تعتمد علي عينات قليله التسمية ان توفر مستويات اعلي من الدقة المكانية من هذه الطريقة. في كثير من الحالات ، وهذه النهج جزيء واحد يتطلب الاستفادة المثلي من ثوابت الفلورسنت ويمكن ان تتطلب وقتا طويلا الاستحواذ ، مما يجعلها صعبه الاستخدام مع عينات حيه أو ديناميكية. كل من هذه الطرق ياتي مع تحذير واحد أو أكثر ان هذا الأسلوب لا. علي سبيل المثال, الفوائد المعلن عنها من قبل الغزل القرص المجهر البؤري ليست كما تنطبق علي أحاديه الخلايا البكتيرية, حيث لا يوجد الكثير من ضوء الطائرة. وعلاوة علي ذلك ، يوفر هذا الأسلوب خط أنابيب للحصول علي الاشكال الخلية 3D دقيقه وتوطين البروتين دون الحاجة إلى اي فلوبهورس المتخصصة. هذا الأسلوب لديه الحد الأدنى من متطلبات الاجهزه (اي ، z بيزو ، عاليه الهدف NA) ويتطلب سوي عشرات الصور في الوقت الواحد ، مما يسمح للمرء ان التحقيق بسهوله الهياكل 3D ديناميكية6.
وهناك عدد متزايد من النهج لدراسة تنظيم الخلايا البكتيرية في الهياكل ثلاثية الابعاد. وتشمل هذه النهج المفاهيمي مماثله لهذه التي تستفيد من جوده عاليه, 3d الصور الفلورية30,31,32. يتطلب هذا النهج خلايا معزولة جيدا ولا يجعل الافتراضات المسبقة حول الهندسة الخلوية. ومع ذلك ، للانتقال إلى المجاميع الخلوية الكثيفة أو الاغشيه البيولوجية ، يفترض ان تكون الخلايا مثل قضيب. يتيح هذا العرض الأقل دقه امكانيه التحقق من ترتيبات التعبئة للخلايا ، علي الرغم من ان الكثافة العالية للخلايا في البيوفيلم تمنع تحليل التعريب الخلوي لعوامل محدده.
في المستقبل ، قد يكون من المثير للاهتمام لوضع اطار لدمج جزيء واحد ونهج واسعه المجال مع هذه التقنية 3D أعاده البناء. وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من الممكن ادراج هذا النهج التواء إلى الامام مع أدوات تقسيم الرؤية اليه32 للسماح باعاده بناء مجموعات خلايا أكثر كثافة.
لماذا تطورت الخلايا إلى اشكال محدده هي قضية معقده يجب ان تعكس البيئة المعقدة التي يعيشون فيها. يتطلب فهم تطور ووظيفة اشكال الخلايا أخذ قياسات دقيقه ودقيقه لتلك الاشكال ، وهو ما يوفره هذا الأسلوب.

الخلايا من جميع الأنواع تنظيم الاشكال الخاصة بهم لوظائف محدده. علي سبيل المثال ، تتشكل الخلايا العصبية بطريقه مختلفه عن كريات الدم ولها وظائف مختلفه. المثل ، تاتي الخلايا البكتيرية في مجموعه متنوعة من الاشكال والاحجام ، علي الرغم من ان الغرض من هذه الاشكال لا يعرف دائما1،2. ولذلك ، فمن المهم ان يتم تحديد شكل الخلايا البكتيرية بدقه. توضح الطريقة الموضحة طريقه سهله التنفيذ لجمع البيانات المناسبة للتحليل ثلاثي الابعاد لمعظم الخلايا البكتيرية الحية أو الثابتة.
الطريقة الموصوفة تمكن المرء من التقاط صور ثلاثية الابعاد للخلايا البكتيرية من أجل تمثيل شكل الخلية ثلاثية الابعاد بدقه في العينة وتحديد البروتينات داخل هذه الاشكال بدقه. التقنيات المجهرية التقليدية تاخذ الصور 2D ، والتي هي إشكاليه عند دراسة الخلايا التي لها اشكال غير طبيعيه أو غير متناظرة ، مثل طفرات القولونية، أو البكتيريا المنحنية مثل الكوليرا والملوية بيلوري. في حين ان الصور ثلاثية الابعاد ذات الدقة العالية هي المدخل الرئيسي لهذا الأسلوب ، فان الأسلوب لا يرجع صوره محسنه للقرار. بدلا من ذلك ، هذا الأسلوب يعيد إنشاء إحداثيات السطح ثلاثي الابعاد وشكل الخلية باستخدام خوارزميه التواء إلى الامام باستخدام المعالم النشطة ووظيفة ضبابية واضحة للمجهر3 (الشكل 1). وقد استخدمت لدراسة البكتيريا الاكتين homolog mreb في e. القولونية4,5,6,7, الرواية periskeletal عنصر crva في كوليرا8, والمفترض bactofilin CcmA في الملوية بيلوري9 (الشكل 2).
يمكن لتوطين البروتينات إعطاء نظره ثاقبه في وظائفهم. علي سبيل المثال ، البروتينات المشاركة في تقسيم الخلايا عاده ما تكون مترجمه إلى الخلية الوسطي10،11. وقد أجريت دراسات عاليه الانتاجيه لتوطين جميع البروتينات من بكتيريا علي أمل الحصول علي نظره ثاقبه في وظائفهم12. لسوء الحظ ، تم اجراء هذه الدراسات مع التصوير 2D و 1D أو 2D التحليل ، مما يجعل من المستحيل لقياس جوانب محدده من توطين البروتين ، مثل التعريب إلى الميزات الهندسية الخلوية.
علي سبيل المثال ، يتم الافتراض بان البروتين الديناميكي المطلوب لشكل قضيب العديد من البكتيريا ، للعمل عن طريق توجيه توطين الخلية التوليف الجدار ، والتعريب لها الترجمة التعريب جدار الخلية التوليف7،13. الملوخية من أنواع متعددة يظهر الإثراء الهندسي4،6،7،14،15. البوليمرات السطحية الديناميكية ، مثل MreB ، قد زوجين هندسه السطح إلى الوقت المتوسط تخصيب الملف الشخصي16 وقد تكون قادره علي توجيه لهندسي محدده عن طريق التقليل من الطاقة المرتبطة بالربط إلى الغشاء17. في حين ان اهميه التواء ، والتجميع ، والانحناء ، والديناميكية لم يتم حلها بالبالكامل بالنسبة لشركه MreB ، من المهم ملاحظه ان القياسات الدقيقة لتقوسات الرئيسية للسطح تتطلب تمثيلا كاملا ثلاثي الابعاد للخلية. ولذلك ، لقياس أكثر دقه تقوسات التي البروتينات تعريب ، فمن التفضيلية لاستخدام 3D ، بدلا من التصوير 2D. التصوير ثلاثي الابعاد يلغي الحاجة إلى التقدير الحسابي لتلك التقوسات التي لا يمكن قياسها في 2D ، وهو تقدير قد لا يكون دقيقا في الخلايا غير المتناظرة18.
علي الرغم من ان التصوير ثنائي الابعاد للخلايا أسرع ولا يتطلب قدرا كبيرا من العمل الحسابي ، فان التصوير ثلاثي الابعاد يوفر تمثيلا أدق للخلية ، فضلا عن القدرة علي قياس الخصائص السطحية ، مثل الانحناء ، والتي لا يمكن قياسها في 2D. ولذلك ، كما يصبح التصوير ثلاثي الابعاد أكثر شيوعا ، سيصبح من الممكن رؤى جديده في شكل الخلية وتوطين البروتين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50nm fluorescent beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td>these are used to measure the blurring function of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>Puritan Medical Products Company LLC</td>
			<td>S304659</td>
			<td>used to appy VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>used to cro cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LST3166</td>
			<td>membrane dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>Huygens essential or professional</td>
			<td>Use to measure blurring function of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td>combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB growth medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 medium</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>M1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Needed to run forward convolution scripts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nkon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-038-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezo z stage</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77011589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips -p200</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips- p10</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization

شكل البكتيريا مهم لعلم وظائف الجسم. يمكن ان يتاثر العديد من جوانب فسيولوجيا الخلية مثل حركيه الخلية ، والنهب ، وإنتاج بيوفيلم بشكل الخلية. الخلايا البكتيرية هي الكائنات ثلاثية الابعاد (3D) ، علي الرغم من انها نادرا ما تعامل علي هذا النحو. تؤدي معظم تقنيات المجهر إلى صور ثنائيه الابعاد (ثنائيه الابعاد) تؤدي إلى فقدان البيانات المتعلقة بشكل الخلية ثلاثية الابعاد الفعلي وتوطين البروتينات. بعض المعلمات الشكل ، مثل انحناء غاوسي (المنتج من التقوسات الرئيسية اثنين) ، يمكن فقط ان تقاس في 3D لان الصور 2D لا تقيس كل من تقوسات الرئيسية. بالاضافه إلى ذلك ، لا تقع جميع الخلايا مسطحه عند التركيب والتصوير ثنائي الابعاد للخلايا المنحنية قد لا تمثل بدقه اشكال هذه الخلايا. يمكن ان يساعد قياس توطين البروتين بدقه في 3D علي تحديد التنظيم المكاني ووظيفة البروتينات. وقد تم تطوير تقنيه التواء الاماميه التي تستخدم وظيفة طمس من المجهر لأعاده بناء الاشكال الخلية 3D وبدقه توطين البروتينات. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاعداد وتركيب عينات لتصوير الخلايا الحية من البكتيريا في 3D علي حد سواء لأعاده بناء شكل خليه دقيقه وتوطين البروتينات. ويستند هذا الأسلوب علي اعداد عينه بسيطه ، واكتساب صوره الفلورسنت ، ومعالجه الصور المستندة إلى MATLAB. يمكن تعديل العديد من المجاهر الفلورية عاليه الجودة ببساطه لاتخاذ هذه القياسات. هذه أعاده بناء الخلايا هي مكثفه حسابيا والوصول إلى الموارد الحاسوبية عاليه الانتاجيه ويوصي ، وان لم يكن ضروريا. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح علي العديد من الأنواع البكتيرية والمسوخ ، وطرائق التصوير الفلوري ، ومصنعي المجهر.

البكتيريا تاتي في مجموعه واسعه من الاشكال والاحجام التي قد تحدد وظائفها في الطبيعة1. ونتيجة هذا الاجراء هي تمثيل ثلاثي الابعاد دقيق للخلايا من التواء الاماميه لكومه z من الصور (الشكل 1). هذا الأسلوب مهم بشكل خاص عند التعامل مع الخلايا المنحنية (الشكل 2) ، أو مع خلايا علي شكل غير طبيعي (الشكل 4ا) ، كما لا يعكس تمثيل 2d انحناء الخلايا بدقه. من أجل استخدام طريقه التواء الاماميه (الشكل 1ا) ، يجب ان تكون الخلايا اما ملطخه بالمحيطيا أو ان يكون لديها وصمه الخلوية (الشكل 2ب اليسار مقابل اليمين).
يظهر الشكل 4 توطين المحارب في الخلية. وقد تم الانصهار gfp إلى البروتين الاكتين البكتيرية mreb21 من أجل دراسة التعريب الدقيق في كل من نوع البرية ومتحولة e. القولونية الخلايا4. لأنه يرتبط بالغشاء ، فان التصوير ثلاثي الابعاد مطلوب لأعاده إنتاج موضعه بإخلاص في الخلية. من خلال جعل هذه القياسات في 3D ، تمكنا من أعاده بناء الاشكال من كل من النوع البري والخلايا المتحولة Rodz (الشكل 4ا). وقد تبين ان توطين MreB قد اثري في تقوسات الصغيرة ، وهي ميزه هندسية لا يمكن قياسها الا بالابعاد الثلاثية ، بطريقه تعتمد علي RodZ (الشكل 4ب).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig1.jpg"> الشكل 1: يعيد أسلوب التواء إلى الامام الخلايا بدون معرفه مسبقه بشكل الخلية. (ا) الناتج النهائي للأسلوب هو أعاده بناء خليه ثلاثية الابعاد مشتقه بمقارنه شكل الاختبار بوظيفة التعتيم المعايرة الخاصة بالمجهر. ويقارن هذا الأمر بالمكدس z الملاحظ حتى تتطابق الصورة الثلاثية الابعاد الملاحظة مع الشكل الافتراضي. الصورة المعروضة هنا هو تجسيد لأعاده بناء خليه واحده c. كريسينتوس . (ب) يستكمل خط أنابيب التعمير بشكل متكرر المواضع المقدرة للعناصر السطحية استنادا إلى رصه الصورة المرصودة. للحصول علي تفاصيل حسابيه كامله للأسلوب ، راجع نغوين3. (ج) يبدا خط التعمير بدون معرفه مسبقه بشكل الخلية ويستكمل الموقع وعدد القمم السطحية ليطابق الكومة z الملحوظة. تظهر الصور التمثيلية من كل 30 خطوه خلال عمليه أعاده الاعمار ثلاثية الابعاد من ثلاث زوايا مختلفه للخلية كوليرا . يتم تحديث المواضع السطحية لهذا الشكل لتقليل الفرق بين المكدسات التي تمت محاكاتها والتي تمت مراقبتها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig2.jpg"> الشكل 2: أعاده البناء التمثيلي ثلاثي الابعاد لثلاثه أنواع مختلفه من البكتيريا التي تتشكل. ويمكن اجراء أعاده البناء ثلاثية الابعاد من الخلايا مع غشاء الملونة (اليسار) أو مليئه فلوكوفيري السيتوبلازمي (الحق). شكل وانحناء الخلية البداية ليست مهمة ، كما قضيب عازمه ، قضيب الملتوية ، أو قضيب مستقيم كلها قادره علي ان يعاد بناؤها بدقه. ويتم تلوين الأسطح المعاد بناؤها علي أساس انحناء غوسيه المحلي للسطح. شريط مقياس = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig3a.jpg"> الشكل 3: يمكن ان تفشل أعاده الإنشاءات لأسباب متعددة. ويجب فحص الخلايا للتاكد من ان خوارزميه أعاده البناء متقاربة إلى نتيجة معقولة. اليسار = نوع البرية ممثل (اعلي) و Rodz متحولة (أسفل) e. القولونية الخلايا التي مرت مراقبه الجودة. الحق = الخلايا التي فشلت في أعاده بناء بشكل صحيح ولم يمر مراقبه الجودة. وتظهر خمس فئات من التقارب الفاشل: ' 1 ' الخلايا القريبة جدا من حافه منطقه الزراعة التي تؤدي إلى ترسيم حاد ، ' 2 ' خلايا قريبه جدا من خليه أخرى ، ' 3 ' الخلايا التي أنتجت الكريات ، ' 4 ' الخلايا التي لم تمضي في الفترة الاولي نقطه التارتينغ ، و (v) أخطاء أخرى غير معروفه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig4.jpg"> الشكل 4: بيانات تمثيليه تبين توطين البروتين لهندسي الخلوية المحددة. (ا) ثلاثه ابعاد الخلايا التي أعيد بناؤها من نوع البرية و rodz e. القولونية الخلايا مع انحناء غوسيه وكثافة الفلورية mreb عرض. شريط مقياس = 1 μm. (ب) قطع التخصيب من النوع البري والخلايا القولونية . وتظهر القيم > 1 الإثراء والقيم < 1 التي تظهر نضوب MreB من هذه المناطق الخلوية بالنسبة للتغطية الموحدة للخلية. المناطق المظللة تشير إلى متوسط ± 90 ٪ الفاصل الثقة التمهيد من الوسط. منحني كل سلاله هو شريحة تجانس مكعب ويتم اقتطاعها باستخدام عتبه احتمال لتقوسات المدقع من p > 5 x 10-3. وقد تم تعديل هذا الرقم من (براتون وآخرون) 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization at JoVE.com

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

يشرح هذا البروتوكول كيفيه اعداد وتركيب العينات البكتيرية للتصوير الحي ثلاثي الابعاد وكيفيه أعاده بناء الشكل ثلاثي الابعاد من كولاي من تلك الصور.

التصوير ثلاثي الابعاد للخلايا البكتيرية للتمثيلات الخلوية الدقيقة وتعريب البروتين الدقيق

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

لأن البكتيريا صغيرة جدا، والناس غالبا ما ننسى أنها كائنات ثلاثية الأبعاد. بروتوكولنا يسمح بإعادة بناء دقيقة من الأشكال من كل من الخلايا المسطحة والمنحنية. يتطلب هذا البروتوكول تعديلات طفيفة فقط على المجهر القياسي وهي متوفرة بسهولة في نصوص MATLAB.قبل البدء في التجربة مكان اثنين من أكوام من كل من ثلاثة 20 من 20 ملم غطاء زلات على طرفي نقيض من شريحة المجهر الزجاجي واحد. Pipette 200 microliters من حل وسادة agarose على الشريحة وعلى الفور وبحزم وضع شريحة ثانية على كومة من زلات الغطاء لتسطيح agarose. بعد السماح لأغاروز لترسيخ لمدة دقيقة واحدة تقريبا في درجة حرارة الغرفة الشريحة بعناية قبالة الشريحة العلوية واستخدام نهاية كبيرة من 200 دقيق ماصات تلميح لقطع منصات قطرها خمسة ملليمترات الفردية من هلام.عندما تم الحصول على جميع منصات ماصة الخلية الإشريكية القولونية ثقافة عدة مرات لتعطيل أي كتل الخلية وضمان أن يتم توزيع الخلايا بشكل متجانس قبل إضافة ميكرولتر واحد من الثقافة الفرعية على كل لوحة. بعد السماح للعينات الهواء الجاف لمدة خمس إلى 10 دقائق تؤكد أن القطرات قد تم امتصاصها تماما في منصات قبل وضع زلة غطاء على منصات. ثم استخدام مسحة القطن لفرشاة بلطف تسرب المناسبة حول حافة زلة الغطاء، مع الحرص على إبقاء تسرب بعيدا عن الجزء العلوي من زلة الغطاء.مباشرة بعد ختم زلة الغطاء وضع الشريحة على مرحلة المجهر وبعد خمس دقائق من التوازن الحراري استخدام عجلات التركيز المجهر لتحقيق منتصف خلية في التركيز. في برنامج المجهر المرتبط به ضمن اكتساب ND، تحقق من المربع Z للحصول على رصة Z وانقر فوق الزر الصفحة الرئيسية لتعيين منتصف الخلية كنقطة بداية. تعيين حجم الخطوة إلى 0.1 ميكرومتر والنطاق إلى أربعة ميكرومتر وتأكد من أن يتم تعيين الجهاز Z إلى مرحلة بيزو.ومن الأهمية بمكان أن يكون هناك عدم وضوح كافية على كل من أعلى وأسفل الخلية بحيث تكون الخلية لا يمكن فصلها تقريبا عن الخلفية. تعيين القنوات الفلورية تحت نافذة لامدا إلى إعدادات لجزيئات الفلورسنت التي يتم تصويرها والتأكد من أن يتم تعيين ترتيب التجربة إلى لامدا بحيث سيتم الحصول على مكدس Z كامل في كل قناة لون قبل التبديل. ثم انقر فوق تشغيل الآن لبدء الحصول على الصورة.عندما تم الحصول على جميع الصور فتح الملفات في برنامج تحليل الصور المناسبة. ارسم مربع حول خلية فردية و تكرار تلك الخلية مرتين، مرة لكل قناة، مع التأكد من تحديد مربع الكومة الفوقية المكررة، ثم قم بتغيير القناة إلى واحد أو اثنين. بمجرد توفر كل من التكديس، حدد الصور، والمكدسات، والأدوات، وسلسلة لدمج الصور.مع البروتين قناة أولى والشكل قناة ثانية. بعد حفظ الصورة الجديدة كملف TIFF جعل مجلد داخل مجلد على سطح المكتب الذي يحتوي على الصور المقتصة cell_shape_settings_tri. ملف txt من exampleData_tri shae-cellshape-public.قم بتحرير cell_shape_settings_tri. txt ملف أن يكون الإعدادات الصحيحة لتجربة الفائدة. وتشغيل وظيفة Cell_shape_detector3dConvTriFolder مع سلسلة إلى موقع المجلد متبوعاً بعدد الخلية التي سيتم تشغيلها وعدد الخلايا التي يجب تشغيلها.للتأكد من أن الخلايا قد أعيد بناؤها بشكل صحيح تشغيل ScreenFits. عند فتح واجهة المستخدم الرسومية انقر فوق الزر تحديد مجلد وحدد المجلد مع إعادة إنشاء ملفات البيانات لشاشة بصرية عمليات إعادة إنشاء الخلايا الفردية. لأي خلية تظهر مشوهة أو التي تفتقر إلى تغطية كاملة حدد المربع الموجود بجوار إعادة البناء إلى ملحق FLAG إلى الاسم بحيث يمكن استبعاده من أي تحليل المتلقين للمعلومات.تشغيل enrichmentSmothingSpline لإنشاء ملف تعريف إثراء من التركيز النسبي للبروتين الفائدة كدالة من انحناء الغاوسية على السطح. ثم حدد كل مجلد مع TRI التي تم إنشاؤها للتو. ملفات حصيرة وحدد ملف حصيرة منحنى تم إنشاؤه حديثا.هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع الخلايا المنحنية أو على شكل غير طبيعي حيث لا يمكن أن يعكس التمثيل 2D انحناء الخلايا بدقة. في هذه التجربة تم توليد بروتين الانصهار الفلورسنت الأخضر إلى بروتين actin البكتيري MreB لدراسة التعريب الدقيق للبروتين أكتين في كل من النوع البري وخلايا القولونية المتحولة. من خلال إجراء هذه القياسات في صور 3D القبض على أشكال كل من نوع البرية وخلايا متحولة rodZ كانت قادرة على إعادة بنائها.ثم تم تحديد توطين MreB بحيث يتم إثراؤه في انحناءات جاوسي الصغيرة ، وهي ميزة هندسية لا يمكن قياسها إلا في 3D بطريقة تعتمد على rodZ. تذكر للتأكد من أن مكدس Z كبير بما يكفي أن الخلايا غير واضحة في الأعلى والأسفل وأن الخلايا متباعدة بشكل جيد عن بعضها البعض. نحن نعرض كيفية قياس التعريب الهندسي للبروتينات في 3D ولكن يمكن حساب معلومات أخرى من هذه البيانات مثل حجم تجميعات بروتين العلامة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

البكتيرية التصوير Bioluminescent<em&gt; في الجسم الحي</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

تحريض التمايز الخلوي والتصوير خلية واحدة من<em&gt; فيبرايو بارايموليتيكوس</em&gt; السباح و سوارمر الخلايا

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...